Summary
מחקר זה מתאר את השלבים להשגת תמונות ברזולוציה גבוהה של מוחות עכבר בילודים על ידי שילוב טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT) וסוכן ניגוד בדגימות ex vivo . אנו מתארים ניתוחים מורפומטריים בסיסיים כדי לכמת את גודל המוח וצורתו בתמונות אלה.
Abstract
תמונות מוחיות הן כלי רב ערך לחקר מורפולוגיה של המוח בניסויים באמצעות מודלים של בעלי חיים. דימות תהודה מגנטית (MRI) הפך לשיטה הסטנדרטית עבור רקמות רכות, אם כי הרזולוציה המרחבית הנמוכה שלה מציבה מגבלות מסוימות עבור בעלי חיים קטנים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לקבלת מידע תלת-ממדי (תלת-ממדי) ברזולוציה גבוהה על מוחות וגולגולות של עכברים באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT). הפרוטוקול כולל את השלבים הדרושים כדי לנתח את הדגימות, להכתים ולסרוק את המוח, ולקבל מדידות מורפומטריות של כל האיבר ואזורי העניין (ROIs). ניתוח תמונה כולל פילוח מבנים ודיגיטציה של קואורדינטות נקודתיות. לסיכום, עבודה זו מראה כי השילוב של מיקרו-CT והפתרון של לוגול כחומר ניגוד הוא חלופה מתאימה להדמיית מוחות פרינטליים של בעלי חיים קטנים. לתהליך הדמיה זה יש יישומים בביולוגיה התפתחותית, ביו-רפואה ומדעים אחרים המעוניינים להעריך את ההשפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים מגוונים על התפתחות המוח.
Introduction
הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT) היא כלי רב ערך לתחומי מחקר שונים. בביולוגיה, הוא מתאים במיוחד לחקר העצם בגלל ספיגת קרני רנטגן ברקמות מינרליות. בשל תכונה זו, שאלות מגוונות לגבי התפתחות עצם1, מטבוליזם2, ואבולוציה 3,4, בין נושאים אחרים, ניגשו בעזרת micro-CT. בשנת 2008, de Crespigny et al.5 הראו כי ניתן להשיג תמונות מיקרו-CT של מוחות עכברים וארנבים בוגרים באמצעות יוד כחומר ניגוד. עבודה זו פתחה יישום חדש לטכניקת הדמיה זו, שכן יוד איפשר רכישת תמונות מרקמות רכות שאחרת לא היו רגישות לקרני רנטגן. לפיכך, המטרה הכללית של שילוב micro-CT וחומר ניגוד מבוסס יוד היא להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה, שבו רקמות רכות ניתן להבחין ולזהות ברמה אנטומית meso או מאקרו.
לטכניקה זו פוטנציאל בולט למחקרים הדורשים אפיון פנוטיפי מפורט של דגימות קטנות, כגון עוברי עכברים, הנמצאים בשימוש נרחב בעיצובים ניסיוניים6. ניגודיות יוד בשילוב עם הדמיית מיקרו-CT שימשה להשגת כימות נפחי של איברים7 ומבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) 8,9. בשנים האחרונות בוצעה סריקת מיקרו-CT של דגימות מוכתמות לתיאור תכונות פנוטיפיות מוחיות של מכרסמים10, והוצעו שיפורים שונים בטכניקה. עבור מוחות בוגרים, פרוטוקול של 48 שעות של טבילה ביוד, עם שלב קודם של זילוח עם הידרוג'ל, נמצא לייצר תמונות באיכות גבוהה11. Gignac et al.12 הרחיבו את גבולות הטכניקה הזו בכך שהראו שמוחות של חולדות המוכתמים ביוד יכולים להיות מעובדים כדי לבצע טכניקות היסטולוגיות שגרתיות. באופן דומה, הליכים אלה מראים תוצאות מבטיחות עבור מוחות עובריים וטרום גמילה של מכרסמים 8,13,14,15.
אף על פי שמדעי המוח יישמו במידה רבה טכניקות מבוססות מיקרוסקופ כדי להעריך היבטים מבניים ותפקודיים שונים של התפתחות המוח, מחקרים כאלה מתאימים יותר לאפיון אוכלוסיות תאים ספציפיות או מבנים מוגבלים מרחבית. לעומת זאת, הדמיית מיקרו-CT מאפשרת תיאור מבנים שלמים ורכישת מודלים תלת-ממדיים המשמרים מידע מרחבי רלוונטי, המשלים טכניקות מיקרוסקופיות. דימות תהודה מגנטית (MRI) הוא גם טכניקה סטנדרטית המיושמת כדי לחקור את התכונות המבניות של בעלי חיים קטנים 16,17,18. עם זאת, למיקרו-CT, עם שימוש בחומר ניגוד, יש שני יתרונות עיקריים עבור דגימות קבועות ex vivo: סורקי מיקרו-CT הם לרוב זולים יותר וקלים לתפעול, ומאפשרים רזולוציה מרחבית גבוהה יותר מאשר MRI12.
עבודה זו נועדה לתאר את ההליך לקבלת תמונות ברזולוציה גבוהה ממוחות עכברים בילודים באמצעות סריקת מיקרו-CT לאחר צביעה בתמיסה של לוגול, חומר ניגוד מבוסס יוד. מוצג פרוטוקול מקיף, שמתחיל בשלבים ראשוניים כמו איסוף דגימות וקיבוע רקמות, עובר דרך צביעה, רכישת תמונת מיקרו-CT ועיבוד סטנדרטי. עיבוד תמונה כולל פילוח של נפח תלת-ממדי של הראש השלם, כמו גם של המוח, ובחירה של מישורים אנטומיים ספציפיים לדיגיטציה של קואורדינטות נקודתיות שניתן להשתמש בהן בניתוחים מורפומטריים. למרות שהמוקד כאן הוא מוח העכבר בילוד, אסטרטגיות דומות יכולות להיות מיושמות על רקמות רכות אחרות. לפיכך, הפרוטוקול המוצג כאן גמיש מספיק כדי להיות מיושם, עם שינויים עדינים, על סוגים אחרים של דגימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי הניסוי פעלו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.
1. איסוף דוגמאות והכנתן
- הכינו 500 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA).
- תחת שטף מיצוי בארון, הוסף 20 גרם של אבקת PFA ל 250 מ"ל של 1x פוספט חוצץ מלוחים (PBS) בכד זכוכית 1 L. מניחים את הכד עם מגנט על צלחת ערבוב מגנטית.
- יש לערבב תוך כדי חימום. עם מדחום, כל הזמן לבדוק את הטמפרטורה של הפתרון כדי לשמור אותו מתחת 60 ° C.
- עם פיפטה פסטר פלסטיק, להוסיף טיפות של 1 M NaOH לתמיסה כדי להמיס את PFA. לאחר שאבקת PFA התמוססה לחלוטין, קררו את התמיסה בטמפרטורת החדר (RT).
- כוונן את עוצמת הקול ל- 500 מ"ל עם PBS אחד. כוונן את ה- pH ל- 7.2-7.3 על ידי הוספת טיפות של 1 M HCl עם פיפטת פסטר מפלסטיק.
- באמצעות פילטר נייר ומשפך זכוכית, סנן את התמיסה בבקבוק זכוכית 1 ליטר.
- סגרו את בקבוק הזכוכית, הוציאו אותו מארון השטף ואחסנו במקרר בטמפרטורה של -4°C.
- אספו דגימות מוח.
- כדי להשיג דגימות, יש להקריב יילודים של עכברים בבוקר שלאחר לידתם, בגיל 0.5 ימים (P 0.5), באמצעות מספריים כירורגיים כדי לערוף את ראשם.
- מניחים את המספריים בצוואר היילוד תוך כדי אחיזת הגוף, ומבצעים חיתוך בודד ונקי.
- קבע את הדגימות ב- PFA.
- מלא צינור חרוטי 50 מ"ל עם 40 מ"ל של 4% PFA.
- טבלו כל ראש בצינור המכיל PFA כחומר קיבוע. לפעולה זו, השתמש במרית פטון או בכף.
- אחסנו את הצינורות החרוטיים במקרר בטמפרטורה של -4°C למשך 48 שעות, ולאחר מכן החליפו ל-40 מ"ל של 1x PBS עם 0.1% נתרן אזיד כחומר משמר. יש לשמור בקירור בטמפרטורה של -4°C-.
2. צביעת דגימה
- הכינו את הפתרון של לוגול (3.75% w/v).
- תחת שטף מיצוי בארון, בתוך זכוכית 1 L, להמיס 10 גרם של Kl ו 5 גרם של I2 ב 400 מ"ל של מים מזוקקים, עם ערבוב קבוע באמצעות מערבל מגנטי.
- לטבול כל ראש בצינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 40 מ"ל של תמיסה של לוגול.
- עבור יילודים בגודל גוף משוער של 1.3 גרם, השאירו את הדגימות שקועות במשך 15-20 שעות עם ערבוב קבוע באמצעות שייקר מסלולי.
- הניחו את הדגימות בצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 1% אגרוז למשך 30 דקות לפני הסריקה.
3. סריקת מיקרו-CT
הערה: סריקת Micro-CT דורשת ציוד ספציפי. ישנן אפשרויות שונות עבור סוג זה של סורק, ופרטים על הרכישה תלויים במאפיינים של הציוד בשימוש. מעבדתו של ד"ר הלגרימסון מסתמכת על כמה חלופות של סורקי מיקרו-CT. כאן, הפרוטוקול מבוסס על שימוש בסורק שולחני בסיסי, שהוא בין מכונות ההדמיה הנגישות יותר של בעלי חיים קטנים המשמשות מעבדות ברחבי העולם. אם מטרת הסריקה היא הגולגולת, דלג על השלבים בסעיף 2 של הפרוטוקול והמשך לסעיף 3. לאחר סריקת הגולגולת, ניתן היה לבצע את תהליך הצביעה ואת סריקת המוח כדי לקבל תמונות מאותן דגימות הן של המוח והן של הגולגולת.
- הניחו את הדגימה במחזיק מיקרו-CT.
- מניחים את הדגימה בצינור חרוטי של 50 מ"ל. תקן את הדגימה כדי למנוע תנועות במהלך הפעלת הסורק. לשם כך, ניתן להשתמש בחומר פוליאוריתן כלשהו כדי למלא את החלקים הריקים של הצינור.
- פתח את הציוד והנח את הצינור עם הדגימה במחזיק מיקרו-CT.
- היכנס ללוח הבקרה של micro-CT ורשום את הדגימה לסריקה. פעולה זו תיצור באופן אוטומטי מספר מדגם. בנוסף למספר, מלא את השדה "שם". יש לרשום הן את שם המדגם והן את המספר במקום אחר (לדוגמה, בגיליון אלקטרוני) למקרה שיהיה צורך לאחזר שוב את הנתונים הגולמיים.
- הפעל את תוכנית הסריקה. הזן את השם או המספר לדוגמה ובחר קובץ בקרה , שאמור להכיל את פרמטרי הסריקה.
- סרוק את הדגימה.
- במסך של תוכנת micro-CT, הגדר את הפרמטרים הבאים: גודל ווקסל איזוטרופי של 0.012 מ"מ, 45 kVp, 177 lA, זמן אינטגרציה של 800,000 אלפיות השנייה ו- 500 תחזיות לכל 180°.
- הגדר את אזור הסריקה על-ידי בחירה באפשרות תצוגת צופה. לאחר הופעת תמונת ההפניה, הקש על שורת הפניה כדי להגדיר את האזור. הזז/י את הקו הירוק המלא לקצה הדגימה ולאחר מכן החזק/ י את מקש Shift תוך כדי גרירת הסמן כדי להרחיב את אזור הסריקה לקצה השני של הדגימה.
- בחר אישור כדי להתחיל בסריקה.
- הערך וייצא את הסריקה.
- פתח את תוכנית הערכת סורק המיקרו-CT ולחץ על בחר דגימה ומדידה. בשדה 'מסנן ', הקלידו את שם הדגימה, בחרו בדגימה ובחרו בקובץ המדידה.
- הקובץ ייטען כפרוסות, שמספרן תלוי בחלון הסריקה הראשוני. לחצו על כפתור "טען הכל ", שיטען כל פרוסה ויקל על התנועה בין הפרוסות בהמשך.
- בחר משימות > הערכה תלת-ממדית כדי לאתחל תיבת חיתוך מסביב לפרוסות. תופיע בקשה להערכה תלת-ממדית עם מספר שדות, כולל פעילות/הערכה, VOI (נפח עניין), התחלה X, Y, Z וממד X, Y, Z.
- הגדר את השדה Task > Evaluation 3D לסקריפט המתאים, מכיוון שניתן לבצע מגוון משימות הערכה, כגון שחזור, סגמנטציה, מורפומטריה (למשל, צפיפות מינרלים בעצם) והמרות או העברות קבצים. ניתן להשתמש בקובץ ה- Script של הערכת ברירת המחדל כקו מדריך.
- לאחר בחירת הסקריפט, התאם את תיבת VOI בתמונה הראשית. מתחילים בפרוסה הראשונה. ודא שהתיבה מכילה את האנטומיה שיש להעריך. הזז את ה- VOI על-ידי לחיצה ימנית על אחד הריבועים הלבנים הקטנים לכיוון קצה התיבה ושינוי גודל ה- VOI באמצעות לחצן העכבר האמצעי. לחלופין, התאימו את שדות הממד מבחינה מספרית.
- עבור על הדגימה באמצעות פס הגלילה מתחת לתמונה כדי לוודא שכל האנטומיות נלכדו בתיבת ה- VOI. לחץ על XY, XZ או YZ ליד בפינה השמאלית העליונה של התוכנה כדי לשנות את הכיוון.
- בחר התחל הערכה. בהתאם לסקריפט הערכת המשימות, פעולה זו תיצור קובץ תמונה תלת-ממדי .aim עם קובץ כותרת .txt תואם. בנוסף, ניתן לציין נתיב בסקריפט ל-File Transfer Protocol (FTP) של התמונה למיקום מסוים.
4. עיבוד תמונה
- פתח את התמונות בתוכנת עיבוד התמונה.
הערה: עיבוד תמונה יכול להתבצע באמצעות תוכנות שונות. פרוטוקול זה כולל את השלבים הבסיסיים בתוכנה מסחרית, המקובלת בתחום ובעלת כלים מגוונים לעיבוד בסיסי ומתקדם. בנוסף, ישנם פורמטים מקובלים שונים עבור תמונות micro-CT משוחזרות. היבט זה תלוי בדרך כלל בציוד המשמש לרכישה ובתוכנה שלו. כאן, עיבוד התמונה מתבצע עם תמונות .bmp. ניתן להחיל את אותו הליך על תמונות .tiff וסוגים אחרים. מכיוון שהרכישה מתבצעת בסורק עם .aim כפורמט ברירת המחדל, מוצגת לראשונה המרה מ- .aim ל- .bmp.- כדי לפתוח קובצי .aim בחר קובץ > נתונים פתוחים ובחר את הקובץ. לאחר מכן, ייפתח חלון עם הכותרת בחירת פורמט קובץ. בחר נתונים גולמיים.
- ייפתח חלון עם הכותרת פרמטרים של נתונים גולמיים. בחלון זה, מלא את הפרמטרים הבאים אחר המידע בקובץ .txt הכותרת שנוצר עבור כל קובץ .aim . בתיבה 'סוג נתונים', בחרו '16 סיביות ' לכותרת עליונה עם המספר שאחרי נתוני התמונה מתחילים בהסטת בתים. כמו כן, הגדר את הממדים ואת גודל הווקסל באמצעות המידע על קובץ .txt הכותרת. לאחר השלמת הפרמטרים, לחץ על אישור.
- אם יש צורך בהמרה מ- .aim ל- .bmp, בלוח הראשי > בתצוגת Project, לחץ לחיצה ימנית על אובייקט .aim ובחר באפשרות המר > המר סוג תמונה. תחת מאפיינים, בחר 8 סיביות כסוג פלט. בחר החל.
- לחץ לחיצה ימנית על האובייקט החדש של 8 סיביות. בחר שמירה בשם. בחר .bmp ושמור.
- כדי לפתוח את קובץ .bmp, בחר קובץ > פתח נתונים ובחר את הקובץ. לאחר מכן, נפתח חלון עם הפרמטרים של התמונה. אשר את הפרמטרים וקבל אם הם נכונים.
- בלוח הראשי > תצוגת Project, אובייקט חדש נוצר עם שם קבצי .bmp. לחצו לחיצה ימנית על עצם זה ובחרו באפשרות Ortho Slice. ב'מאפיינים', בחרו במספר הפרוסה ובמישור הכיוון שיש לראות.
- השג נפחים תלת-ממדיים של הראש השלם.
- בלוח הראשי > תצוגת Project, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אובייקט התמונה. בחר באפשרות סף אינטראקטיבי > יצירה. ב'מאפיינים', שנו את הערכים 'RGB מינימלי' ו'מרבי RGB' עד לבחירת החלק בתמונה המתאים לראש החיה. בחר החל.
- בלוח הראשי > תצוגת Project, נוצר אובייקט סף. לחץ לחיצה ימנית על אובייקט זה, ובמאפיינים, בחר Isosurface. בתיבה 'מאפיינים', בחרו סף להמחשת המשטח ולחצו על 'החל'. סף זה צריך להיבחר אמפירית, ואז ייתכן שיהיה צורך לבחון ערכים שונים.
- דיגיטציה של קואורדינטות נקודתיות
- ניתן לבצע דיגיטציה של קואורדינטות נקודה תלת-ממדיות הן על בסיס פרוסות והן על בסיס משטחים שחולצו. באפשרות הראשונה, לחצו לחיצה ימנית על אפשרות התמונה ובחרו 'פרוסה'. ב'תרגום', בחרו בפרוסה הרצויה במישור הצירים. אם המישור אינו ממוקם כהלכה, לחץ על אפשרויות > סובב במאפיינים כדי לקבוע את הכיוון הנכון.
- כדי להפוך ציוני דרך לדיגיטליים, לחץ לחיצה ימנית בלוח הראשי > בתצוגת Project ובחר Create Object > Points and Lines > Landmark. לחץ לחיצה ימנית על ציוני הדרך החדשים של האובייקט ובחר תצוגת ציוני דרך. בתצוגת לנדמרק, שנה את גודל הנקודה בגודל. כדי להוסיף ציוני דרך במאפיינים, השתמש באפשרות הוסף במצב עריכה.
הערה: עבור יילודים, קבוצה של ציוני דרך וציוני דרך למחצה סביב העקומות הציריות והקשת של המוח פורסמה בעבר14. - ראשית, בחרו את מישור הציר החוצה את הנקודה הרוסטרלית ביותר של פקעות הריח ואת הנקודה הקאודלית ביותר של קליפת המוח.
- בחר את ציוני הדרך של האובייקט , ובמאפיינים, בחר עורך ציוני דרך. באמצעות החץ, לחץ על המקום שבו הנקודה אמורה לעבור דיגיטציה.
- בקבוצת ציוני הדרך המוצעת, 24 נקודות עוברות דיגיטציה במישור הציר שנבחר. דיגיטציה של הראשון בנקודה הקאודלית ביותר של המוח בקו האמצע.
- דיגיטציה של חמש נקודות המפוזרות באופן שווה סביב העקומה (ציוני דרך למחצה) עד לנקודת הציון הבאה בצומת שבין המוח התיכון לקליפת המוח.
- לאחר מכן, בצעו דיגיטציה של שמונה נקודות (ציוני דרך למחצה) סביב קליפת המוח.
- דיגיטציה של נקודת ציון חדשה בצומת שבין קליפת המוח לנורות הריח. לאחר מכן, דיגיטציה של ארבע נקודות (ציוני דרך למחצה) סביב נורות הריח.
- דיגיטציה של נקודת ציון חדשה בנקודה הרוסטרלית ביותר של נורות הריח בקו האמצע. לאחר מכן, דיגיטציה של שתי נקודות (ציוני דרך למחצה) בין שתי נורות הריח.
- דיגיטציה של נקודת ציון חדשה בנקודה הקאודלית ביותר של נורות הריח בקו האמצע.
- עבור נקודות קשת, קבעו פרוסה בצד ימין של המוח במישור פאראסגיטלי שבו המוח בולט ביותר.
- בקבוצה המוצעת של ציוני דרך, 33 נקודות הן דיגיטציה במישור parasagittal שנבחר. דיגיטציה הראשונה בצומת בין diencephalon לבין המוח האחורי. לאחר מכן, דיגיטציה של תשע נקודות (ציוני דרך למחצה) בגבול הגחון של המוח.
- דיגיטציה של נקודת ציון חדשה בנקודה הרוסטרלית ביותר של נורת הריח. לאחר מכן, דיגיטציה של שלוש נקודות (ציוני דרך למחצה) סביב נורות הריח.
- דיגיטציה של נקודת ציון חדשה בצומת שבין פקעת הריח לקליפת המוח. לאחר מכן, דיגיטציה של שלוש נקודות (ציוני דרך למחצה) סביב נורות הריח.
- דיגיטציה של נקודת ציון חדשה בצומת שבין פקעת הריח לקליפת המוח. לאחר מכן, בצעו דיגיטציה של שבע נקודות (ציוני דרך למחצה) סביב קליפת המוח.
- דיגיטציה של נקודת ציון חדשה בהצטלבות שבין קליפת המוח למוח האמצעי. לאחר מכן, בצעו דיגיטציה של שבע נקודות (ציוני דרך למחצה) סביב קליפת המוח.
- דיגיטציה של נקודת ציון חדשה בהצטלבות שבין קליפת המוח למוח האמצעי. לאחר מכן, בצעו דיגיטציה של שש נקודות (ציוני דרך למחצה) סביב המוח האמצעי.
- דיגיטציה של נקודת ציון חדשה בצומת שבין המוח התיכון למוח הקטן. לאחר מכן, דיגיטציה של שתי נקודות (ציוני דרך למחצה) סביב המוח הקטן.
- דיגיטציה של ציון דרך חדש בצומת שבין המוח הקטן למוח האחורי.
- שמור את הנקודות הדיגיטליות. לחץ לחיצה ימנית על ציוני דרך אובייקט ובחר באפשרות שמור נתונים.
- נתח את קואורדינטות הנקודה.
הערה: לאחר דיגיטציה של קואורדינטות הנקודות עבור קבוצת דגימות, ניתן לבצע ניתוחים בסיסיים באמצעות כלים מורפומטריים גיאומטריים כדי לקבל משתני גודל (גודל צנטרואידי) וצורה (קואורדינטות צורה או פרוקרוסטס). הניתוחים מתבצעים בסביבת תוכנה פתוחה חופשית, המתאימה במיוחד לניתוחים סטטיסטיים.- באמצעות פנקס רשימות, בנה קובץ המכיל את הקואורדינטות של כל הדגימות הדיגיטליות. לשם כך יש לפעול במתכונת תב"ע, כמתואר https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm.
- פתח את התוכנה הסטטיסטית. בחר File > Change Dir כדי לבחור את הספרייה שבה נשמר קובץ ה- .tps.
- בחר חבילות > התקנת חבילות. בחר מראת Cran אחת. חפש את geomorph והתקן אותו.
- טען חבילות על-ידי הקלדה בקונסולה: library(geomorph) ו - library(Morpho).
- טען את ערכת הנתונים על-ידי הקלדה במסוף: ערכת הנתונים <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID").
- בצע ניתוח Procrustes כללי על ידי הקלדה בקונסולה: GPA<- gpagen (dataset).
- השג את גודל centroid על ידי הקלדה בקונסולה: CS<-GPA$Csize.
- השג קואורדינטות Procrustes על ידי הקלדה בקונסולה: ProcCoord<- GPA$coords.
- התווה את הקואורדינטות של Procrustes ואת הצורה הממוצעת על-ידי הקלדה בקונסולה: plotAllSpecimens(ProcCoord).
- פילוח תשואות השקעה
הערה: כדי לפלח את המוח ולקבל שחזור תלת-ממדי, זהה ידנית את רקמות המוח בכל פרוסה. אותו הליך יכול להיות מיושם על ROI ספציפי, כגון נורות הריח, קליפת המוח, וכו '- לחץ לחיצה ימנית על הלוח הראשי > Project View ובחר Create Object > Label Field.
- בחירת האובייקט Label Field , הקש על האפשרות Segmentation Editor במאפיינים.
- בחומרים, הוסיפו חומר חדש, ואם תרצו, שנו את שמו למוח.
- בבחירה, בחרו באפשרות 'פרוסה נוכחית' כדי לפלח את הרקמה המתאימה למוח בכל פרוסה.
- בעזרת האפשרויות הקיימות ב'כלים', בחרו ברקמת המוח בכל פרוסה. במקרה זה, שרביט הקסמים והמברשת הם המתאימים ביותר.
- לאחר ביצוע הבחירה בכל פרוסה, הקישו 'הוסף' בבחירה.
- בסיום הבחירה בכל הפרוסות, חזרו אל תצוגת Project בחלונית הראשית ולחצו לחיצה ימנית על 'שדה תווית ' כדי לבחור 'צור משטח' ולאחר מכן לחצו על 'החל'.
- לאחר קבלת המשטח, יצא אותו על-ידי החלת Extract Surface.
- כדי להשיג את עוצמת הקול של המבנים המקוטעים, בלוח הראשי > בתצוגת Project, בחר באובייקט המכיל את התווית, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר מדוד ונתח > מקטע עוצמת הקול. לאחר מכן, לחץ על החל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן מוצג פרוטוקול בסיסי לקבלת תמונות ברזולוציה גבוהה של מוחות עכבר בילודים. הראשים נסרקו לאחר טבילה בתמיסה של לוגול. למרות גודלם הקטן, ניתן להבחין בין המבנים האנטומיים העיקריים במוח, כמו פקעות הריח, קליפת המוח, המוח האמצעי, המוח הקטן והמוח האחורי (איור 1).
ניתוחים שונים יכולים להתבצע באמצעות תמונות אלה כקלט. קבוצה של ציוני דרך וציוני דרך למחצה בשני מישורים אנטומיים שונים עברו דיגיטציה. כפי שניתן לראות באיור 2, נקודות ממוקמות לאורך כל גבול המוח במישורים שנבחרו. לאחר סיום הדיגיטציה, ניתן לקרוא את הקואורדינטות של הנקודות בקובץ .txt (איור 3). מטרת הדיגיטציה הנקודתית הייתה להשיג קואורדינטות גולמיות שניתן להמשיך ולהשתמש בהן בניתוחים מורפומטריים גיאומטריים. הפרוטוקול המוצג מתמקד בדגימה בודדת, וניתוחים מורפומטריים מתאימים לדגימות גדולות יותר, אך התוצאות המתקבלות באמצעות אותה קבוצת נקודות מוצגות במקום אחר14.
לבסוף, התוצאה של פילוח ידני של המוח כולו היא מודל תלת-ממדי של המוח (איור 4). בכרכים אלה ניתן לנקוט בגישות מגוונות, החל מהערכה פשוטה של שטחם ונפחם, דרך חילוץ נקודות פני השטח, וכלה בביצוע ניתוחים דומים לזה המוצג כאן עבור נקודות עקומה.
איור 1: פרוסות מייצגות של תמונת מיקרו-CT של ראש היילוד. (A-C) מוצגים מישורים ציריים, (D) קורונליים ו-(E). אזורים ומבנים שניתן להבחין ביניהם במישור הפאראסגיטלי: (א) פקעות ריח, (ב) קליפת המוח, (ג) המוח האמצעי, (ד) המוח הקטן, (ה) המוח האחורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ציוני דרך וציוני דרך למחצה שעברו דיגיטציה בפרוטוקול המוצע. (A) מוצגים מישורים ציריים ו-(B) פאראסגיטליים. המספרים מצביעים על ציוני דרך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דוגמה לקובץ המכיל קואורדינטות נקודתיות כפי שיוצאו מהתוכנה. הפריטים העיקריים מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שחזור תלת-ממדי של מוחו של יילוד לאחר סגמנטציה ידנית. דוגמה למוח משוחזר שלם מוצגת בשתי השקפות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבודה זו מוצג פרוטוקול תמציתי לסריקת רקמות מוח יילודים של עכברים באמצעות מיקרו-CT עם חומר ניגוד. בנוסף, הוא כולל נהלים פשוטים להשגת תפוקות כמותיות ואיכותיות. בהתבסס על שיטות אלה, ניתן לבצע ניתוחים חלופיים או משלימים נוספים.
כפי שמוצג בפרוטוקול, ניתן לנתח תמונות מיקרו-CT בדרכים שונות. במחקרים קודמים, הקבוצה שלנו העריכה את השונות בגודל ובצורה במוחות פרינטליים של עכברים על ידי דיגיטציה של קואורדינטות של נקודות ויישום טכניקות מורפומטריות גיאומטריות 8,14. דיגיטציה של קואורדינטות שימושית גם להשגת מדידות ליניאריות, באמצעות הערכת מרחק אוקלידית פשוטה. זה, יחד עם הנפחים הנגזרים מפילוחי מוח ו- ROI, הם תשומות יקרות ערך להערכה מורפומטרית מסורתית.
למרות שהפרוטוקול המוצג כאן מיושם בקלות על דגימות קטנות של ex vivo , כמו אלה בהן השתמשנו, הוא אינו ישים עבור מחקרי in vivo , שכן קיבוע, ובמיוחד הפתרון של לוגול כחומר ניגוד, אינו בר קיימא. הדמיית מיקרו-CT משמשת in vivo, בדרך כלל לבדיקת רקמות קשות19, אך מתן חומרי ניגוד המגיעים למוח החוצה את המחסום ההמטואנצפלי בילודים חיים אינו פשוט. לפיכך, הטכניקה המוצגת כאן היא עדיין כלי מבטיח לענות על שאלות שונות של שונות מורפולוגית.
מאז מחקרים חלוציים הראו כי יוד הוא בחירה טובה עבור עוברים חולייתנים20, היישום שלה התרחב במהירות, והתברר כי אחד החסרונות העיקריים של טכניקה זו הוא התכווצות המיוצר על ידי סוכן ניגוד12. זוהי בעיה נפוצה במחקרים המשתמשים בגישה זו, ועל המשתמשים לשקול אותה בעת העתקת הפרוטוקול המוצג כאן, שכן צפויה מידה מסוימת של כיווץ. אסטרטגיות מגוונות הוצעו כדי להפחית השפעה זו; Vickerton et al.21 בחנו ריכוזים שונים של יוד והגיעו למסקנה כי התכווצות תלויה ישירות בריכוז, והפחתתו מסייעת במידה רבה לרסן את העיוות בשל השפעה זו. נקודה נוספת שיש להתאים היא הזמן הנכון של טבילה, אשר תלוי בגודל ואת הקשיות של המבנים. לאחר כמה בדיקות, מצאנו כי 15-20 שעות היא תקופה מספקת כדי להכתים את רקמות המוח של יילודים עכבר ולשמר את התכונות המורפולוגיות העיקריות. כמה מחברים הציעו להשתמש בכמה תמיסות לפני צביעה, כגון אגרוז7 והידרוג'ל11,13, או יישום של תמיסה של לוגול חוצץ המונע החמצה, וכתוצאה מכך, התכווצות22. את כל הפרוצדורות הללו ניתן להוסיף לפרוטוקול המוצג כאן, שהוא גישה כללית ובסיסית להדמיית מיקרו-CT עם ניגוד יוד.
לשימוש בסורקי מיקרו-CT להדמיית רקמות רכות בדגימות גדולות יותר, כגון עכברים בוגרים, יש כמה חסרונות. הליך טבילה להכתמה אינו מומלץ מכיוון שפיזור חומר הניגוד יהיה כנראה הטרוגני. חשוב יהיה לבחון כמה אפשרויות חלופיות, כמו מתן הפתרון של לוגול באמצעות זילוח לב.
לסיכום, מיקרו-CT בתוספת הפתרון של לוגול מהווה חלופה מתאימה להדמיית מוח פרינטלי של בעלי חיים קטנים, ובפרט עכברים. זוהי דרך פשוטה להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה, אשר בשילוב עם היסטולוגיה, יכול לספק אפיון עקבי של שונות מורפולוגית המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לוויי ליו על עזרתו הטכנית. עבודה זו ממומנת על ידי ANPCyT PICT 2017-2497 ו- PICT 2018-4113.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
References
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660 (2021).
- Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
- Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
- de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227 (2016).
- Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
- Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Gignac, P. M., O'Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
- Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184 (2022).
- Turnbull, D. H., Mori, S.
- Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615 (2018).
- Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
- Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol's solution. Scientific Reports. 11, 19781 (2021).
