Summary
تصف هذه الدراسة خطوات الحصول على صور عالية الدقة لأدمغة الفئران حديثي الولادة من خلال الجمع بين التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) وعامل التباين في عينات خارج الجسم الحي . نصف التحليلات المورفومترية الأساسية لتحديد حجم الدماغ وشكله في هذه الصور.
Abstract
الصور العصبية هي أداة قيمة لدراسة مورفولوجيا الدماغ في التجارب باستخدام النماذج الحيوانية. أصبح التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) الطريقة القياسية للأنسجة الرخوة ، على الرغم من أن دقته المكانية المنخفضة تفرض بعض القيود على الصغيرة. هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد عالية الدقة (3D) عن أدمغة وجماجم حديثي الولادة في الفئران باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT). يتضمن البروتوكول تلك الخطوات اللازمة لتشريح العينات ، وصبغ الدماغ ومسحه ضوئيا ، والحصول على قياسات مورفومترية للعضو بأكمله والمناطق ذات الاهتمام (ROIs). يتضمن تحليل الصور تجزئة الهياكل ورقمنة إحداثيات النقاط. باختصار ، يوضح هذا العمل أن الجمع بين التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ومحلول Lugol كعامل تباين هو بديل مناسب لتصوير أدمغة الصغيرة في الفترة المحيطة بالولادة. يحتوي سير عمل التصوير هذا على تطبيقات في علم الأحياء التنموي والطب الحيوي والعلوم الأخرى المهتمة بتقييم تأثير العوامل الوراثية والبيئية المتنوعة على نمو الدماغ.
Introduction
يعد التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) أداة قيمة لمختلف مجالات البحث. في علم الأحياء ، وهي مناسبة بشكل خاص لأبحاث العظام بسبب امتصاص الأشعة السينية في الأنسجة المعدنية. بسبب هذه الميزة ، تم تناول أسئلة متنوعة تتعلق بتطور العظام1 ، والتمثيل الغذائي2 ، والتطور3،4 ، من بين مواضيع أخرى ، بمساعدة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. في عام 2008 ، أظهر de Crespigny et al.5 أنه يمكن الحصول على صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة لأدمغة الفئران والأرانب البالغة باستخدام اليود كعامل تباين. فتح هذا العمل تطبيقا جديدا لتقنية التصوير هذه ، حيث سمح اليود بالحصول على صور من الأنسجة الرخوة التي ستكون غير حساسة للأشعة السينية. وبالتالي ، فإن الهدف العام من الجمع بين التصوير المقطعي المحوسب الدقيق وعامل التباين القائم على اليود هو الحصول على صور عالية الدقة ، حيث يمكن تمييز الأنسجة الرخوة وتحديدها على المستوى التشريحي المتوسط أو الكلي.
هذه التقنية لديها إمكانات ملحوظة للدراسات التي تتطلب توصيفا مفصلا للنمط الظاهري خارج الجسم الحي للعينات الصغيرة ، مثل أجنة الفئران ، والتي تستخدم على نطاق واسع في التصاميم التجريبية6. وقد استخدم تباين اليود في تركيبة مع التصوير المقطعي المحوسب الدقيق للحصول على الكميات الحجمية للأعضاء7 والهياكل ثلاثية الأبعاد (3D) 8,9. في السنوات الأخيرة ، تم تطبيق المسح الضوئي بالأشعة المقطعية الدقيقة للعينات الملطخة لوصف السمات الظاهرية للدماغ للقوارض10 ، وتم اقتراح تحسينات مختلفة على التقنية. بالنسبة لأدمغة البالغين ، تم العثور على بروتوكول 48 ساعة من الغمر في اليود ، مع خطوة سابقة من التروية مع هيدروجيل ، لإنتاج صور عالية الجودة11. وسع Gignac et al.12 حدود هذه التقنية من خلال إظهار أن أدمغة الفئران الملطخة باليود يمكن معالجتها لأداء التقنيات النسيجية الروتينية. وبالمثل ، تظهر هذه الإجراءات نتائج واعدة لأدمغة القوارض الجنينية وما قبل الفطام8،13،14،15.
على الرغم من أن علم الأعصاب قد طبق إلى حد كبير التقنيات القائمة على المجهر لتقييم الجوانب الهيكلية والوظيفية المختلفة لنمو الدماغ ، إلا أن هذه الدراسات أكثر ملاءمة لتوصيف مجموعات خلايا معينة أو هياكل محدودة مكانيا. على العكس من ذلك ، يسمح التصوير المقطعي المحوسب الدقيق بوصف الهياكل الكاملة واكتساب نماذج 3D التي تحافظ على المعلومات المكانية ذات الصلة ، والتي تكمل التقنيات المجهرية. التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) هو أيضا تقنية قياسية يتم تطبيقها لاستكشاف السمات الهيكلية للحيوانات الصغيرة16،17،18. ومع ذلك ، فإن التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، باستخدام عامل تباين ، له ميزتان رئيسيتان للعينات الثابتة خارج الجسم الحي : الماسحات الضوئية الدقيقة بالأشعة المقطعية أقل تكلفة إلى حد كبير وسهلة التشغيل ، وتسمح بدقة مكانية أعلى من التصوير بالرنين المغناطيسي12.
يهدف هذا العمل إلى وصف الإجراء للحصول على صور عالية الدقة من أدمغة الفئران حديثي الولادة باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق بعد تلطيخها بمحلول Lugol ، وهو عامل تباين قائم على اليود. يتم تقديم بروتوكول شامل ، والذي يبدأ بمراحل أولية مثل جمع العينات وتثبيت الأنسجة ، ويمر عبر التلوين ، والحصول على صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، والمعالجة القياسية. تتضمن معالجة الصور تجزئة حجم 3D للرأس الكامل ، وكذلك الدماغ ، واختيار مستويات تشريحية محددة لرقمنة إحداثيات النقاط التي يمكن استخدامها بعد ذلك في التحليلات المورفومترية. على الرغم من أن التركيز هنا هو دماغ الفأر الوليدي ، إلا أنه يمكن تطبيق استراتيجيات مماثلة على الأنسجة الرخوة الأخرى. وبالتالي ، فإن البروتوكول المقدم هنا مرن بما يكفي لتطبيقه ، مع تعديلات طفيفة ، على أنواع أخرى من العينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
اتبعت جميع الإجراءات التجريبية إرشادات المجلس الكندي لرعاية.
1. جمع العينات وإعدادها
- تحضير 500 مل من 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA).
- تحت تدفق الاستخراج في خزانة ، أضف 20 جم من مسحوق PFA إلى 250 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في دورق زجاجي سعة 1 لتر. ضع الدورق بمغناطيس على لوح تحريك مغناطيسي.
- يقلب أثناء التسخين. باستخدام مقياس حرارة ، تحقق باستمرار من درجة حرارة المحلول لإبقائه أقل من 60 درجة مئوية.
- باستخدام ماصة باستور البلاستيكية ، أضف قطرات من 1 M NaOH إلى المحلول لإذابة PFA. بمجرد أن يذوب مسحوق PFA تماما ، قم بتبريد المحلول في درجة حرارة الغرفة (RT).
- اضبط مستوى الصوت على 500 مل باستخدام 1x PBS. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2-7.3 عن طريق إضافة قطرات من 1 M HCl مع ماصة باستور بلاستيكية.
- باستخدام مرشح ورقي وقمع زجاجي ، قم بتصفية المحلول في زجاجة زجاجية سعة 1 لتر.
- أغلق الزجاجة ، وأخرجها من خزانة التدفق ، واحفظها في الثلاجة عند -4 درجة مئوية.
- جمع عينات الدماغ.
- للحصول على عينات ، يتم تضحية حديثي الولادة في صباح اليوم التالي لولادتهم ، في عمر 0.5 يوم (P 0.5) ، باستخدام مقص جراحي لقطع رؤوسهم.
- وضع المقص في عنق حديث الولادة أثناء الإمساك بالجسم، وإجراء عملية قص واحدة ونظيفة.
- تثبيت العينات في PFA.
- املأ أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل ب 40 مل من 4٪ PFA.
- اغمر كل رأس في الأنبوب الذي يحتوي على PFA كعامل تثبيت. لهذا الإجراء ، استخدم ملعقة باتون أو ملعقة.
- قم بتخزين الأنابيب المخروطية في الثلاجة عند -4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ، ثم قم بتغييرها إلى 40 مل من 1x PBS مع 0.1٪ أزيد الصوديوم كمادة حافظة. يحفظ في الثلاجة عند درجة حرارة -4 درجة مئوية.
2. عينة تلطيخ
- تحضير حل Lugol (3.75٪ وزن / حجم).
- تحت تدفق الاستخراج في خزانة ، في دورق زجاجي سعة 1 لتر ، قم بإذابة 10 جم من Kl و 5 جم من I2 في 400 مل من الماء المقطر ، مع الخلط المستمر باستخدام محرك مغناطيسي.
- اغمر كل رأس في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 40 مل من محلول Lugol.
- بالنسبة لحديثي الولادة الذين يبلغ حجم جسمهم التقريبي 1.3 جم ، اترك العينات مغمورة لمدة 15-20 ساعة مع خلط مستمر باستخدام شاكر مداري.
- ضع العينات في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من 1٪ أغاروز لمدة 30 دقيقة قبل المسح.
3. التصوير المقطعي المحوسب الدقيق
ملاحظة: يتطلب التصوير المقطعي المحوسب الدقيق معدات محددة. هناك خيارات مختلفة لهذا النوع من الماسح الضوئي ، وتعتمد تفاصيل الاستحواذ على خصائص المعدات المستخدمة. يعتمد مختبر الدكتور هالغريمسون على بعض بدائل الماسحات الضوئية الدقيقة بالأشعة المقطعية. هنا ، يعتمد البروتوكول على استخدام ماسح ضوئي أساسي لسطح المكتب ، وهو من بين آلات تصوير الصغيرة التي يسهل الوصول إليها والتي تستخدمها المختبرات في جميع أنحاء العالم. إذا كان هدف المسح هو الجمجمة ، فتخط الخطوات الواردة في القسم 2 من البروتوكول وانتقل إلى القسم 3. بعد مسح الجمجمة ، يمكن إجراء عملية التلوين ومسح الدماغ للحصول على صور من نفس العينات لكل من الدماغ والجمجمة.
- ضع العينة في حامل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق.
- ضع العينة في أنبوب مخروطي حجمه 50 mL. قم بإصلاح العينة لتجنب الحركات أثناء جلسة الماسحة الضوئية. لهذا الغرض ، يمكن استخدام بعض مواد البولي يوريثين لملء الأجزاء الفارغة من الأنبوب.
- افتح الجهاز وضع الأنبوب مع العينة في حامل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق.
- قم بتسجيل الدخول إلى لوحة التحكم micro-CT وسجل العينة المراد مسحها ضوئيا. سيؤدي هذا تلقائيا إلى إنشاء رقم عينة. بالإضافة إلى الرقم ، املأ حقل "الاسم". يجب تسجيل كل من اسم العينة ورقمها في مكان آخر (على سبيل المثال ، في جدول بيانات) في حالة الحاجة إلى استرداد البيانات الأولية مرة أخرى.
- ابدأ تشغيل برنامج المسح. أدخل اسم العينة أو الرقم وحدد ملف التحكم ، والذي يجب أن يحتوي على معلمات المسح.
- امسح العينة.
- في شاشة برنامج micro-CT ، اضبط المعلمات التالية: حجم فوكسل الخواص 0.012 مم ، 45 كيلو فولت ، 177 مللي أمبير ، وقت تكامل 800000 مللي ثانية ، و 500 إسقاط لكل 180 درجة.
- قم بتعيين منطقة المسح الضوئي عن طريق تحديد طريقة عرض الكشاف. بمجرد ظهور الصورة المرجعية ، اضغط على الخط المرجعي لتعيين المنطقة. حرك الخط الأخضر المتصل إلى حافة العينة، ثم اضغط باستمرار على مفتاح Shift أثناء سحب المؤشر لتوسيع منطقة المسح الضوئي إلى الحافة الأخرى للعينة.
- حدد موافق لبدء الفحص.
- تقييم وتصدير الفحص.
- افتح برنامج تقييم الماسح الضوئي بالأشعة المقطعية الدقيقة وانقر على تحديد العينة والقياس. في حقل التصفية ، اكتب اسم العينة، وحدد العينة، وحدد ملف القياس.
- سيتم تحميل الملف كشرائح ، يعتمد عددها على نافذة المسح الأولية. انقر فوق الزر "تحميل الكل " ، والذي سيقوم بتحميل كل شريحة وتسهيل الحركة بين الشرائح لاحقا.
- حدد المهام > تقييم 3D لتهيئة مربع اقتصاص حول الشرائح. ستظهر مطالبة 3D-Evaluation مع عدد من الحقول ، بما في ذلك المهمة / التقييم ، VOI (حجم الاهتمام) ، Start X ، Y ، Z ، والبعد X و Y و Z.
- قم بتعيين حقل Task > Evaluation 3D إلى البرنامج النصي المناسب ، حيث يمكن تنفيذ مجموعة متنوعة من مهام التقييم ، مثل إعادة البناء ، والتجزئة ، وقياس التشكل (على سبيل المثال ، كثافة المعادن في العظام) ، وتحويلات الملفات أو نقلها. يمكن استخدام البرنامج النصي للتقييم الافتراضي كدليل.
- بعد تحديد البرنامج النصي ، اضبط مربع VOI على الصورة الرئيسية. ابدأ من الشريحة الأولى. تأكد من أن المربع يحتوي على التشريح المراد تقييمه. حرك VOI بالنقر بزر الماوس الأيمن على أحد المربعات البيضاء الصغيرة باتجاه حافة المربع وتغيير حجم VOI باستخدام زر الماوس الأوسط. بدلا من ذلك، اضبط حقول الأبعاد عدديا.
- قم بالمرور عبر العينة باستخدام شريط التمرير الموجود أسفل الصورة للتأكد من التقاط جميع التشريحات في مربع VOI. انقر فوق XY أو XZ أو YZ بالقرب من الجزء العلوي الأيسر من البرنامج لتغيير الاتجاه.
- حدد بدء التقييم. اعتمادا على البرنامج النصي لتقييم المهام ، سيؤدي ذلك إلى إنشاء ملف صورة 3D .aim مع ملف رأس .txt مطابق. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحديد مسار في البرنامج النصي لبروتوكول نقل الملفات (FTP) الصورة إلى موقع معين.
4. معالجة الصور
- افتح الصور في برنامج معالجة الصور.
ملاحظة: يمكن إجراء معالجة الصور باستخدام برامج مختلفة. يتضمن هذا البروتوكول الخطوات الأساسية في برنامج تجاري ، وهو مقبول على نطاق واسع في المنطقة ويحتوي على أدوات متعددة الاستخدامات للمعالجة الأساسية والمتقدمة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تنسيقات مختلفة مقبولة لصور التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة المعاد بناؤها. يعتمد هذا الجانب عادة على المعدات المستخدمة للاقتناء وبرامجها. هنا ، تتم معالجة الصور باستخدام .bmp الصور. يمكن تطبيق نفس الإجراء على الصور .tiff والأنواع الأخرى. نظرا لأن عملية الاستحواذ تتم في ماسح ضوئي باستخدام .aim كتنسيق افتراضي ، يتم تقديم التحويل من .aim إلى .bmp أولا.- لفتح ملفات .aim ، حدد ملف > Open Data واختر الملف. بعد ذلك ، سيتم فتح نافذة بعنوان تحديد تنسيق الملف. حدد البيانات الأولية.
- سيتم فتح نافذة بعنوان معلمات البيانات الأولية. في هذه النافذة، املأ المعلمات باتباع المعلومات الموجودة على الرأس .txt الملف الذي تم إنشاؤه لكل ملف .aim . لنوع البيانات، اختر 16 بت للرأس مكتمل بالرقم بعد بدء بيانات الصورة عند إزاحة البايت. أيضا ، قم بتعيين الأبعاد وحجم voxel باستخدام المعلومات الموجودة في الرأس .txt الملف. بمجرد اكتمال المعلمات ، اضغط على موافق.
- إذا كانت هناك حاجة للتحويل من .aim إلى .bmp ، في اللوحة الرئيسية > عرض المشروع ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق كائن .aim وحدد الخيار تحويل > تحويل نوع الصورة. في خصائص ، حدد 8 بت كنوع الإخراج. حدد تطبيق.
- انقر بزر الماوس الأيمن فوق كائن 8 بت الجديد. حدد حفظ باسم. اختر .bmp واحفظها.
- لفتح ملف .bmp، حدد ملف > البيانات المفتوحة واختر الملف. بعد ذلك ، يتم فتح نافذة مع معلمات الصورة. قم بتأكيد المعلمات وقبولها إذا كانت صحيحة.
- في اللوحة الرئيسية > عرض المشروع، يتم إنشاء كائن جديد باسم ملفات .bmp. انقر بزر الماوس الأيمن فوق هذا الكائن وحدد الخيار Ortho Slice. في الخصائص، حدد رقم الشريحة ومستوى الاتجاه المراد رؤيتهما.
- الحصول على مجلدات 3D من الرأس الكامل.
- في اللوحة الرئيسية > عرض المشروع ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق كائن الصورة. حدد خيار الحد التفاعلي > إنشاء. في الخصائص، قم بتغيير قيم الحد الأدنى RGB والحد الأقصى RGB حتى يتم تحديد جزء الصورة المقابل لرأس. حدد تطبيق.
- في اللوحة الرئيسية > عرض المشروع، يتم إنشاء كائن عتدي. انقر بزر الماوس الأيمن فوق هذا الكائن ، وفي الخصائص ، حدد Isosurface. في الخصائص، اختر عتبة لتصور السطح وانقر تطبيق. يجب اختيار هذه العتبة تجريبيا ، ثم قد يلزم فحص قيم مختلفة.
- إحداثيات نقطة الرقمنة
- يمكن رقمنة إحداثيات نقطة 3D على أساس شرائح أو الأسطح المستخرجة. بالنسبة للخيار الأول ، انقر بزر الماوس الأيمن في خيار الصورة وحدد شريحة. في ترجمة، اختر الشريحة المطلوبة في المستوى المحوري. إذا لم يتم وضع المستوى بشكل صحيح، انقر فوق خيارات > تدوير في خصائص لإنشاء الاتجاه الصحيح.
- لرقمنة المعالم، انقر بزر الماوس الأيمن في اللوحة الرئيسية > عرض المشروع وحدد إنشاء كائن > نقاط وخطوط > معالم. انقر بزر الماوس الأيمن فوق معالم الكائن الجديدة وحدد طريقة عرض المعلم. في طريقة عرض المعلم، قم بتعديل حجم النقطة في الحجم. لإضافة معالم في الخصائص، استخدم الخيار إضافة في وضع التحرير.
ملاحظة: بالنسبة لحديثي الولادة ، تم نشر مجموعة من المعالم وشبه المعالم حول المنحنيات المحورية والسهمية للدماغسابقا 14. - أولا ، اختر المستوى المحوري الذي يعبر النقطة الأكثر منضدة للمصابيح الشمية والنقطة الأكثر ذيلية في القشرة.
- حدد معالم الكائن ، وفي الخصائص، حدد محرر المعالم. باستخدام السهم ، انقر فوق المكان الذي سيتم فيه رقمنة النقطة.
- في مجموعة المعالم المقترحة ، يتم رقمنة 24 نقطة في المستوى المحوري المحدد. رقمنة الأول في أكثر نقطة ذيلية في الدماغ عند خط الوسط.
- رقمنة خمس نقاط موزعة بالتساوي حول المنحنى (شبه المعالم) حتى المعلم التالي عند التقاطع بين الدماغ المتوسط والقشرة.
- ثم قم برقمنة ثماني نقاط (شبه معالم) حول القشرة.
- رقمنة معلم جديد عند التقاطع بين القشرة والمصابيح الشمية. ثم قم برقمنة أربع نقاط (شبه معالم) حول المصابيح الشمية.
- رقمنة معلم جديد في أكثر نقطة منضدية من المصابيح الشمية في خط الوسط. ثم قم برقمنة نقطتين (شبه معالم) بين كلا اللمبات الشمية.
- رقمنة معلم جديد في أكثر نقطة ذيلية من المصابيح الشمية في خط الوسط.
- بالنسبة للنقاط السهمية ، قم بإنشاء شريحة في الجانب الأيمن من الدماغ عند مستوى شبه سهمي حيث يكون الدماغ أكثر بروزا من الناحية الذيلية.
- في مجموعة المعالم المقترحة ، يتم رقمنة 33 نقطة في المستوى شبه السهمي المحدد. رقمنة الأول في التقاطع بين الدماغ البيني والدماغ الخلفي. ثم رقمنة تسع نقاط (شبه معالم) في الحد البطني للدماغ.
- رقمنة معلم جديد في أكثر نقطة منضدة من المصباح الشمي. ثم قم برقمنة ثلاث نقاط (شبه معالم) حول المصابيح الشمية.
- رقمنة معلم جديد في التقاطع بين المصباح الشمي والقشرة. ثم قم برقمنة ثلاث نقاط (شبه معالم) حول المصابيح الشمية.
- رقمنة معلم جديد في التقاطع بين المصباح الشمي والقشرة. ثم قم برقمنة سبع نقاط (شبه معالم) حول القشرة.
- رقمنة معلم جديد في التقاطع بين القشرة والدماغ المتوسط. ثم قم برقمنة سبع نقاط (شبه معالم) حول القشرة.
- رقمنة معلم جديد في التقاطع بين القشرة والدماغ المتوسط. بعد ذلك ، قم برقمنة ست نقاط (شبه معالم) حول الدماغ المتوسط.
- رقمنة معلم جديد في التقاطع بين الدماغ المتوسط والمخيخ. ثم قم برقمنة نقطتين (شبه معالم) حول المخيخ.
- رقمنة معلم جديد في التقاطع بين المخيخ والدماغ الخلفي.
- احفظ النقاط الرقمية. انقر بزر الماوس الأيمن فوق معالم الكائن واختر الخيار حفظ البيانات.
- تحليل إحداثيات النقطة.
ملاحظة: بمجرد رقمنة إحداثيات النقاط لمجموعة من العينات ، يمكن إجراء التحليلات الأساسية باستخدام أدوات القياسات الشكلية الهندسية للحصول على الحجم (حجم النقطه الوسطى) ومتغيرات الشكل (إحداثيات الشكل أو Procrustes). يتم إجراء التحليلات في بيئة برمجيات مفتوحة مجانية ، وهي مناسبة بشكل خاص للتحليلات الإحصائية.- باستخدام المفكرة ، قم ببناء ملف يحتوي على إحداثيات جميع العينات الرقمية. لهذا الغرض ، اتبع تنسيق TPS ، كما هو موضح في https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm.
- افتح البرنامج الإحصائي. حدد ملف > Change Dir لاختيار الدليل حيث يتم حفظ ملف .tps.
- حدد الحزم > تثبيت الحزم. اختر مرآة كران واحدة. ابحث عن geomorph وقم بتثبيته.
- قم بتحميل الحزم عن طريق الكتابة في وحدة التحكم: المكتبة (geomorph) والمكتبة (Morpho).
- قم بتحميل مجموعة البيانات عن طريق الكتابة في وحدة التحكم: مجموعة البيانات <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps"، specID="ID").
- قم بإجراء تحليل Procrustes المعمم عن طريق الكتابة في وحدة التحكم: GPA<- gpagen (مجموعة البيانات).
- احصل على حجم النقطه الوسطى عن طريق الكتابة في وحدة التحكم: CS<-GPA$Csize.
- احصل على إحداثيات Procrustes عن طريق الكتابة في وحدة التحكم: ProcCoord<- GPA$coords.
- ارسم إحداثيات Procrustes والشكل المتوسط عن طريق الكتابة في وحدة التحكم: plotAllSamples (ProcCoord).
- تجزئة عائد الاستثمار
ملاحظة: لتقسيم الدماغ والحصول على إعادة بناء 3D ، حدد يدويا أنسجة المخ في كل شريحة. يمكن تطبيق نفس الإجراء على عائد استثمار محدد ، مثل المصابيح الشمية والقشرة وما إلى ذلك.- انقر بزر الماوس الأيمن فوق اللوحة الرئيسية > عرض المشروع وحدد إنشاء كائن > حقل تسمية.
- عند تحديد كائن حقل التسمية ، اضغط على خيار محرر التجزئة في الخصائص.
- في المواد، أضف مادة جديدة، وإذا رغبت في ذلك، أعد تسميتها باسم Brain.
- في التحديد، اختر الخيار الشريحة الحالية لتقسيم الأنسجة المقابلة للدماغ في كل شريحة.
- باستخدام الخيارات الموجودة في الأدوات، حدد أنسجة المخ في كل شريحة. في هذه الحالة ، فإن العصا السحرية والفرشاة هي الأنسب.
- بمجرد إجراء التحديد في كل شريحة، اضغط على إضافة في التحديد.
- عند الانتهاء من التحديد في كل الشرائح، ارجع إلى عرض المشروع في اللوحة الرئيسية وانقر بزر الماوس الأيمن فوق حقل التسمية لتحديد إنشاء Surface، ثم انقر فوق تطبيق.
- بمجرد الحصول على السطح ، قم بتصديره عن طريق تطبيق Extract Surface.
- للحصول على حجم الهياكل المجزأة، في اللوحة الرئيسية > عرض المشروع، حدد الكائن الذي يحتوي على التسمية، وانقر بزر الماوس الأيمن، وحدد قياس وتحليل > كسر الحجم. ثم انقر فوق تطبيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا ، يتم تقديم بروتوكول أساسي للحصول على صور عالية الدقة لأدمغة الفئران حديثي الولادة. تم مسح الرؤوس بعد الغمر في محلول Lugol. على الرغم من صغر حجمها ، يمكن تمييز الهياكل التشريحية الرئيسية للدماغ ، مثل المصابيح الشمية والقشرة والدماغ المتوسط والمخيخ والدماغ الخلفي (الشكل 1).
يمكن إجراء تحليلات مختلفة باستخدام هذه الصور كمدخلات. تم رقمنة مجموعة من المعالم وشبه المعالم في مستويين تشريحيين مختلفين. كما هو موضح في الشكل 2، توضع النقاط على طول حدود الدماغ عند المستويات المختارة. بمجرد الانتهاء من الرقمنة ، يمكن قراءة إحداثيات النقاط في ملف .txt (الشكل 3). كان الغرض من رقمنة النقاط هو الحصول على إحداثيات خام يمكن استخدامها بشكل أكبر في التحليلات المورفومترية الهندسية. يركز البروتوكول المقدم على عينة واحدة ، والتحليلات المورفومترية مناسبة للعينات الأكبر ، ولكن النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام نفس مجموعة النقاط معروضة في مكان آخر14.
أخيرا ، نتيجة التجزئة اليدوية للدماغ بأكمله هي نموذج ثلاثي الأبعاد للدماغ (الشكل 4). في هذه المجلدات ، يمكن اتباع نهج متنوعة ، من مجرد تقدير مساحتها وحجمها إلى استخراج نقاط السطح ، إلى إجراء تحليلات مماثلة لتلك المعروضة هنا لنقاط المنحنى.
الشكل 1: شرائح تمثيلية لصورة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لرأس حديث الولادة. (A-C) يتم عرض المستويات المحورية ، (د) الإكليلية ، و (ه) المستويات شبه السهمية. المناطق والتراكيب التي يمكن تمييزها في المستوى شبه السهمي: (أ) المصابيح الشمية ، (ب) القشرة ، (ج) الدماغ المتوسط ، (د) المخيخ ، (ه) الدماغ الخلفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المعالم وأشباه المعالم الرقمية في البروتوكول المقترح. (أ) يتم عرض المستويات المحورية و (ب) شبه السهمية. تشير الأرقام إلى المعالم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مثال لملف يحتوي على إحداثيات نقطية كما تم تصديرها من البرنامج. يشار إلى العناصر الرئيسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إعادة بناء دماغ حديث الولادة ثلاثي الأبعاد بعد التجزئة اليدوية. يتم تقديم مثال على الدماغ المعاد بناؤه بالكامل في وجهتي نظر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العمل ، تم تقديم بروتوكول موجز لمسح أنسجة دماغ الأطفال حديثي الولادة للفئران باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق مع عامل تباين. بالإضافة إلى ذلك ، يتضمن إجراءات بسيطة للحصول على مخرجات كمية ونوعية. واستنادا إلى هذه الأساليب، يمكن إجراء المزيد من التحليلات البديلة أو التكميلية.
كما هو موضح في البروتوكول ، يمكن تحليل صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيق بطرق مختلفة. في الدراسات السابقة ، قدرت مجموعتنا اختلاف الحجم والشكل في أدمغة الفئران في الفترة المحيطة بالولادة عن طريق رقمنة إحداثيات النقاط وتطبيق تقنيات التشكل الهندسية 8,14. تعد رقمنة الإحداثيات مفيدة أيضا للحصول على قياسات خطية ، باستخدام تقدير المسافة الإقليدية البسيط. هذا ، جنبا إلى جنب مع الأحجام المستمدة من تجزئة الدماغ وعائد الاستثمار ، هي مدخلات قيمة للتقييم المورفومتري التقليدي.
على الرغم من أن البروتوكول المقدم هنا يتم تطبيقه بسهولة على العينات الصغيرة خارج الجسم الحي ، مثل تلك التي استخدمناها ، إلا أنه لا ينطبق على الدراسات في الجسم الحي ، لأن التثبيت ، وخاصة حل Lugol كعامل تباين ، غير قابل للتطبيق. يستخدم التصوير المقطعي المحوسب الدقيق في الجسم الحي ، عادة لفحص الأنسجة الصلبة19 ، ولكن إعطاء عوامل التباين التي تصل إلى الدماغ التي تعبر حاجز الدم الدماغي في حديثي الولادة الأحياء ليست بسيطة. وبالتالي ، فإن التقنية المقدمة هنا لا تزال أداة واعدة للإجابة على أسئلة مختلفة من الاختلاف المورفولوجي.
منذ أن أظهرت الدراسات الرائدة أن اليود هو خيار جيد لأجنة الفقاريات20 ، فقد توسع تطبيقه بسرعة ، وأصبح من الواضح أن أحد العيوب الرئيسية لهذه التقنية هو الانكماش الناتج عن عامل التباين12. إنها مشكلة في كل مكان في الدراسات التي تستخدم هذا النهج ، ويجب على المستخدمين أخذها في الاعتبار عند إعادة إنتاج البروتوكول المقدم هنا ، حيث من المتوقع حدوث قدر من الانكماش. وقد اقترحت استراتيجيات متنوعة للحد من هذا التأثير؛ فحص Vickerton et al.21 تركيزات مختلفة من اليود وخلصوا إلى أن الانكماش يعتمد بشكل مباشر على التركيز ، وتقليله يساعد إلى حد كبير على كبح التشوه بسبب هذا التأثير. نقطة أخرى يجب ضبطها هي الوقت المناسب للغمر ، والذي يعتمد على حجم وصلابة الهياكل. بعد بعض الاختبارات ، وجدنا أن 15-20 ساعة هي فترة كافية لتلطيخ أنسجة المخ لحديثي الولادة في الفئران والحفاظ على الخصائص المورفولوجية الرئيسية. اقترح بعض المؤلفين استخدام بعض المحاليل قبل التلوين ، مثل الأغاروز7 وهيدروجيل11,13 ، أو تطبيق محلول لوغول المخزن الذي يمنع التحمض ، وبالتالي الانكماش22. يمكن إضافة كل هذه الإجراءات إلى البروتوكول المقدم هنا ، وهو نهج عام وأساسي للتصوير المقطعي المحوسب الدقيق مع تباين اليود.
إن استخدام الماسحات الضوئية بالتصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتصوير الأنسجة الرخوة في عينات أكبر ، مثل الفئران البالغة ، له بعض العيوب. لا ينصح بإجراء الغمر للتلطيخ لأن توزيع عامل التباين سيكون على الأرجح غير متجانس. سيكون من المهم استكشاف بعض الخيارات البديلة ، مثل إعطاء محلول Lugol عن طريق التروية القلبية.
في الختام ، يعد التصوير المقطعي المحوسب الدقيق مع إضافة محلول Lugol بديلا مناسبا لتصوير أدمغة الصغيرة في الفترة المحيطة بالولادة ، وخاصة الفئران. إنها طريقة بسيطة للحصول على صور عالية الدقة ، تكملها الأنسجة ، يمكن أن توفر توصيفا ثابتا للتنوع المورفولوجي للدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
Acknowledgments
ونشكر وي ليو على مساعدته التقنية. يتم تمويل هذا العمل من قبل ANPCyT PICT 2017-2497 و PICT 2018-4113.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
References
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660 (2021).
- Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
- Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
- de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227 (2016).
- Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
- Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Gignac, P. M., O'Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
- Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184 (2022).
- Turnbull, D. H., Mori, S.
- Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615 (2018).
- Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
- Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol's solution. Scientific Reports. 11, 19781 (2021).
