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Chemistry

Preparação de Amostras de Alimentos Utilizando Homogeneização e Digestão Ácida Úmida Assistida por Micro-ondas para Determinação de Multielementos com ICP-MS

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/65624
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Chemistry and Chemical Engineering, University of Maribor

Summary

O protocolo apresentado descreve a homogeneização das amostras com um misturador de laboratório, a digestão ácida de amostras de alimentos usando uma mistura de 68% em peso HNO3 e 30% em peso de H2O2 via digestão ácida úmida assistida por micro-ondas e determinação multielemento realizada com espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado.

Abstract

A preparação da amostra é crucial para a determinação elementar, e várias técnicas estão disponíveis, uma das quais envolve homogeneização seguida de digestão ácida. É necessário um cuidado especial durante o manuseio da amostra na fase de preparação para eliminar ou minimizar a contaminação potencial e a perda do analito. A homogeneização é um processo que reduz simultaneamente o tamanho das partículas e distribui uniformemente os componentes da amostra. Após a homogeneização, a amostra passa por digestão ácida, na qual é digerida com ácidos e produtos químicos auxiliares a temperaturas elevadas, transformando as amostras sólidas em estado líquido. Nesse processo, os metais da amostra original reagem com ácidos formando sais solúveis em água. Amostras preparadas através de digestão ácida são adequadas para análise elementar usando técnicas como espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado, espectroscopia de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado, espectroscopia de absorção atômica, métodos eletroquímicos e outras técnicas analíticas. Este trabalho detalha a preparação de amostras de alimentos para determinação de múltiplos elementos usando espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado. O procedimento passo-a-passo envolve o processo de homogeneização usando um misturador do tamanho de um laboratório com lâminas cerâmicas, seguido de digestão ácida em vasos fechados usando digestão ácida úmida assistida por micro-ondas. Uma mistura de 5,0 mL de HNO3 em peso 68% e 1,0 mL de H2O2 % em peso serve como reagente auxiliar. Este guia fornece uma explicação dos processos envolvidos em ambas as etapas.

Introduction

A análise elementar é um processo analítico para determinar a composição elementar de várias amostras. Ele pode ser usado para controlar a ingestão de metais no corpo humano (especialmente metais pesados1), uma vez que suas altas concentrações podem causar problemas de saúde indesejados. Os metais pesados também são um dos principais contaminantes ambientais, portanto, o controle de sua presença no ambiente é necessário2. Além disso, a análise elementar pode ser empregada para determinar a origem geográfica dos produtos alimentícios3 e para controlar a qualidade dos alimentos e dos recursos hídricos4. Além disso, é usado para a determinação de micro e macronutrientes em solos5 e para obter informações sobre processos geológicos ao longo da história, examinando a composição química de minerais e sedimentos6. Estudos também têm sido realizados para determinar a presença de metais raros em resíduos eletroeletrônicos para posterior regeneração de metais7, avaliar o sucesso de tratamentos medicamentosos8 e verificar a composição elementar de implantes metálicos9.

A espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) e a espectroscopia de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) são técnicas comumente utilizadas para a análise elementar de várias amostras10. Eles permitem a determinação simultânea de múltiplos elementos com limites de detecção (LOD) e limites de quantificação (LOQ) tão baixos quanto ng/L. Em geral, ICP-MS tem menores valores de LOD11 e uma faixa de concentração linear mais ampla em comparação com ICP-OES12. Outras técnicas para determinar a composição elementar são a espectrometria de emissão óptica com plasma induzida por micro-ondas13 e várias variantes da espectroscopia de absorção atômica (EAA), incluindo espectroscopia de absorção atômica com chama, espectroscopia de absorção atômica eletrotérmica2, espectroscopia de absorção atômica com vapor frio e espectroscopia de absorção atômica com geração de hidreto14. Além disso, a determinação elementar com baixos LOD e LOQ é possível com diferentes métodos eletroanalíticos, especialmente com voltametria de redissolução anódica15,16. É claro que existem outros métodos para determinar a composição elementar das amostras, mas eles não são tão frequentemente empregados quanto os métodos acima mencionados.

A determinação elementar direta de amostras sólidas é viável usando espectroscopia de degradação induzida por laser e fluorescência de raios X17. No entanto, para a determinação elementar com ICP-MS, ICP-OES e AAS é necessário converter amostras sólidas em estado líquido. Para este fim, a digestão ácida é realizada usando ácidos e reagentes auxiliares (na maioria dos casos H2O2). A digestão ácida é realizada em temperatura e pressão elevadas, convertendo a parte orgânica da amostra em produtos gasosos e convertendo os elementos metálicos em sais solúveis em água, dissolvindo-os na solução18.

Existem dois tipos principais de digestão ácida, a digestão de vasos abertos e a digestão de vasos fechados. A digestão em vasos abertos é custo-efetiva14 , mas apresenta limitações, como a temperatura máxima de digestão, que coincide com a temperatura de ebulição dos ácidos à pressão atmosférica. A amostra pode ser aquecida em placas quentes, blocos de aquecimento, banhos de água, banhos de areia2 e por micro-ondas19. Ao aquecer a amostra dessa maneira, grande parte do calor gerado é perdido para o entorno20, o que prolonga o tempo de digestão14. Outras desvantagens da digestão em vasos abertos incluem o maior consumo de produtos químicos, a maior possibilidade de contaminação do ambiente circundante e a possível perda de analitos devido à formação de componentes voláteis e sua evaporação a partir da mistura reacional21.

Sistemas de vasos fechados são mais convenientes para a digestão de amostras orgânicas e inorgânicas em comparação com sistemas de vasos abertos. Os sistemas de vasos fechados utilizam uma variedade de fontes de energia para aquecer as amostras, como aquecimento por condução e micro-ondas22. Os métodos de digestão que utilizam micro-ondas incluem a combustão induzida por micro-ondas23, sistemas de câmara de reação única24 e a digestão ácida úmida assistida por micro-ondas (MAWD) comumente usada 25,26. O MAWD permite a digestão em temperaturas operacionais mais elevadas, variando entre 220 °C e 260 °C e pressões máximas de até 200 bar, dependendo das condições de trabalho do instrumento27.

A eficiência e a taxa de MAWD dependem de vários fatores, incluindo a composição química das amostras, a temperatura máxima, o gradiente de temperatura, a pressão no recipiente de reação, a quantidade de ácidos adicionados e a concentração de ácidos utilizados28. No MAWD, a digestão ácida completa pode ser alcançada em poucos minutos devido às condições de reação elevadas em comparação com digestãos mais duradouras em sistemas de vasos abertos. Menores volumes e concentrações de ácidos são necessários na DMA, o que está de acordo com as diretrizes atuais de química verde29. Na MAWD, uma quantidade menor de amostra em comparação com a digestão em vasos abertos é necessária para realizar a digestão ácida, geralmente até 500 mg de amostra é suficiente 30,31,32. Maiores quantidades de amostra podem ser digeridas, mas requerem uma quantidade maior de produtos químicos.

Uma vez que o instrumento para MAWD controla automaticamente as condições de reação e a pessoa não entra em contato direto com os produtos químicos durante o aquecimento, o MAWD é mais seguro de operar do que as digestãos de vasos abertos. No entanto, a pessoa deve sempre proceder com cautela ao adicionar produtos químicos aos vasos de reação para evitar que eles entrem em contato com o corpo e causem danos. Os vasos de reação também precisam ser abertos lentamente, pois a pressão é acumulada dentro deles durante a digestão ácida.

Embora a digestão ácida seja uma técnica útil para preparar amostras para determinação elementar, a pessoa que a realiza deve estar ciente de suas possíveis limitações. A digestão ácida pode não ser adequada para todas as amostras, especialmente aquelas com matrizes complexas e aquelas que são altamente reativas ou podem reagir explosivamente. Portanto, a composição da amostra deve sempre ser avaliada para selecionar os produtos químicos adequados e as condições de reação para uma digestão completa que dissolva todos os elementos desejados na solução. Outras preocupações que o usuário deve considerar e abordar são as impurezas e a perda de analitos em cada etapa da preparação da amostra. A digestão ácida deve ser sempre realizada de acordo com regras específicas ou utilizando protocolos.

O protocolo descrito abaixo fornece instruções para a homogeneização de amostras de alimentos em um misturador de tamanho laboratorial, um procedimento para limpar os componentes do misturador, pesar adequadamente a amostra, adicionar produtos químicos, realizar a digestão ácida por MAWD, limpar os vasos de reação após a digestão completa, preparar as amostras para determinação elementar e realizar uma determinação quantitativa multielemento com ICP-MS. Seguindo as instruções abaixo, deve-se ser capaz de preparar uma amostra adequada para a determinação elementar e realizar as medições das amostras digeridas.

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Protocol

1. Homogeneização da amostra

  1. Usando uma faca de cerâmica limpa, corte manualmente as amostras de alimentos (brócolis, cogumelos, salsichas e macarrão) em pedaços menores para acelerar o processo de secagem. Preparar amostras suficientes para um mínimo de 6 repetições da digestão ácida (garantir que a massa mínima das amostras secas é de 1500 mg).
    OBS: O aumento da área superficial da amostra expõe uma porção maior da amostra ao ar ambiente aquecido, aumentando a taxa de evaporação da água.
  2. Colocar a amostra num copo de vidro de 250 ml e secá-la a 105 °C até um peso constante utilizando um secador.
  3. Retire o copo de vidro com a amostra do secador e insira-o no dessecador.
  4. Deixe a amostra arrefecer até à temperatura ambiente.
    NOTA: As amostras devem ser pesadas a uma temperatura constante para garantir que o peso reflecte com precisão a massa. Variações de temperatura podem afetar o volume e a densidade das amostras medidas.
  5. Abra o exsicador e transfira o copo de vidro com a amostra na balança analítica. Meça o peso do copo de vidro com a amostra.
  6. Após a conclusão da pesagem, coloque a amostra de volta no secador.
    NOTA: Se a amostra encolheu significativamente durante a secagem, pode-se transferi-la para um copo de vidro menor usando uma espátula plástica para pesagem mais conveniente.
  7. Repetir o processo conforme descrito nos passos 1.3-1.6 até atingir um peso constante da amostra.
  8. Coloque a amostra heterogénea seca no copo misturador (ver Tabela de Materiais), certificando-se de que não excede o volume máximo do copo misturador.
  9. Insira o copo misturador no misturador e feche a porta de proteção (Figura 1).
  10. Pressione o botão Iniciar para ativar as lâminas para moer e misturar a amostra.
  11. Realizar a moagem até que a amostra se transforme em um pó fino ou uma pasta homogênea. Para conseguir tal produto, repita o processo de moagem várias vezes.
  12. Quando a amostra estiver homogeneizada, desligue o misturador, abra a porta de proteção e retire o copo misturador.
  13. Retirar a amostra homogeneizada do copo misturador e transferi-la para um copo de vidro limpo de 50 mL usando uma espátula plástica limpa (Figura 2).
    OBS: Se a amostra for muito dura e puder danificar os componentes do misturador, como as lâminas e o copo misturador, ela pode ser homogeneizada por outros meios, como esmagá-la em argamassas. Os misturadores geralmente não são adequados para homogeneizar materiais duros, amostras congeladas ou amostras facilmente inflamáveis, o que poderia danificar os componentes do misturador. O uso de solventes orgânicos no misturador é desencorajado.
    CUIDADO: Use equipamentos de segurança e certifique-se de que a porta do misturador esteja adequadamente fechada, pois as lâminas do misturador giram em altas velocidades.

2. Limpeza do misturador

  1. Adicione água ultrapura (ver Tabela de Materiais) à marca do copo misturador vazio.
  2. Insira o copo misturador no misturador e execute o procedimento de mistura padrão.
  3. Retire o copo da batedeira e despeje o esgoto. Se necessário, repita o processo com água ultrapura várias vezes até que a água permaneça limpa mesmo após a mistura.
  4. Retire as lâminas contaminadas e a vedação do diafragma do misturador e limpe-as cuidadosamente com água ultrapura.
    NOTA: Use detergentes neutros para melhorar a eficiência da limpeza, especialmente quando se trata de amostras com alto teor de gordura, pois a gordura adere facilmente à superfície do inventário do laboratório.
    CUIDADO: Use equipamentos de proteção adequados, como luvas, ao remover e limpar as lâminas para reduzir o risco de possíveis lesões de suas bordas cortantes.
  5. Secar os componentes limpos no secador a 105 °C e reinseri-los no misturador.
    NOTA: Certifique-se de que os componentes do misturador estão completamente secos antes de os reinstalar no misturador, para evitar o transporte da água para a amostra seguinte.

3. Pesagem da amostra

  1. Retirar a tampa do recipiente de reação de 100 mL de trifluorometoxil-politetrafluoretileno TFM-PTFE33.
  2. Coloque o recipiente de reação aberto na balança analítica e certifique-se de que a balança seja nivelada e zerada antes de cada medição (Figura 3).
    NOTA: A pesagem deve ser realizada à temperatura ambiente. Evite áreas onde flutuações severas de temperatura e fluxo de ar possam afetar o peso medido. Certifique-se de que a área de pesagem esteja limpa e livre de contaminantes.
  3. Transferir a amostra homogeneizada para o recipiente de reação usando uma espátula plástica e pesar 250 mg da amostra. Não pesar a amostra abaixo do limite mínimo de peso da balança analítica.
  4. Quando a pesagem estiver completa, coloque a tampa de cobertura no recipiente de reação para proteger a amostra de contaminação.
    NOTA: Exceder o limite de peso do procedimento de digestão pode resultar em digestão incompleta. Manusear a amostra e os recipientes de reação com cuidado para evitar qualquer contaminação externa.

4. Adição de ácido

  1. Despeje aproximadamente 40,0 mL de HNO3 em peso 68% e 5,0 mL de 30% em peso H2O2 em copos de vidro separados de 50 mL, respectivamente.
    NOTA: Os produtos químicos devem ser de alta pureza com impurezas metálicas residuais inferiores a 1,0 μg/L (ppb), idealmente na faixa ng/L (ppt). Traços de impurezas metálicas afetam a precisão e a repetibilidade da determinação elementar.
  2. Colocar os recipientes de reacção num exaustor, abrir as tampas da tampa e adicionar os volumes abaixo mencionados de 68% em peso de HNO3 e 30% em peso de H2O2 com pipetas automáticas de 1 ml ou 5 ml, de acordo com as seguintes especificações:
    1. Brócolis, cogumelos, salsichas e macarrão; para 250 mg de amostra adicionar 5,0 mL 68% em peso HNO3 e 1,0 mL 30% em peso H2O2. Prepare três réplicas para cada amostra.
    2. Para determinar a exactidão do método (em termos de recuperação, Rec), utilizar o procedimento descrito no ponto 4.2.1 e adicionar 37,5 μL de solução padrão multielemento ICP 100 mg/L (ver Tabela de Materiais) nos recipientes de reacção utilizando uma pipeta automática de 200 μL. Para cada amostra, prepare três repetições.
      NOTA: O volume de 37,5 μL foi selecionado por corresponder a um aumento de 15,0 μg/L para as soluções fortificadas das amostras em comparação com a concentração nas soluções não fortificadas das amostras. Além disso, o aumento da concentração para a solução fortificada das amostras corresponde à concentração final que ainda está na faixa de concentração linear para cada analito medido.
    3. Preparar uma amostra em branco utilizando o mesmo volume de 68% em peso HNO3 e 30% em peso H2O2 utilizado para a digestão de amostras de alimentos na etapa 4.2.1. Para uma amostra em branco, não adicione a amostra aos recipientes de reacção.
      CUIDADO: OHNO 3 usado para digestão é corrosivo e produz fumos. Por esta razão, a adição de ácido deve ser realizada em um exaustor de fumaça. Devem ser utilizados equipamentos de proteção laboratoriais padrão (luvas, óculos de segurança e jaleco de laboratório). Se houver contato com ácido, a área afetada deve ser imediatamente enxaguada sob a corrente de água fria, e a ajuda médica deve ser procurada.
  3. Coloque a tampa da tampa nos recipientes de reação e permita que as amostras reajam com a adição de 68% em peso de HNO3 e 30% em peso de H2O2 por 2-3 min.
  4. Rosqueie a tampa de rosca no vaso e aperte as tampas da tampa.
  5. Agite o recipiente de reação usando movimentos leves das mãos para incorporar totalmente as amostras em produtos químicos.
    OBS: Não deixe os espécimes nas paredes ou tampas dos vasos de reação, pois existe a possibilidade de que eles não sejam completamente digeridos.

5. Digestão ácida úmida assistida por micro-ondas

  1. Ligue o sistema de micro-ondas (consulte a Tabela de Materiais) para digestão ácida pressionando o botão de partida (Figura 4).
  2. Abra a porta do forno de micro-ondas e retire o rack.
  3. Distribua os recipientes de reação fechados simetricamente no rack para garantir a irradiação uniforme das amostras por micro-ondas.
  4. Insira o rack na câmara de micro-ondas e monte-o em um suporte (Figura 5).
  5. Feche a porta do micro-ondas.
  6. Defina um programa de digestão adequado na tela sensível ao toque do forno de micro-ondas usando uma ferramenta em forma de caneta. Escolha um gradiente de temperatura apropriado, a temperatura final e o número de amostras a serem digeridas. O programa de digestão recomendado para diferentes amostras de alimentos está listado abaixo:
    1. Brócolis, cogumelos, salsichas e macarrão: aumento de 10 min para 160 °C, aumento de 10 min para 200 °C, 15 min para 200 °C, potência máxima de 900 W.
  7. Inicie o programa de digestão e monitore a mudança nas condições de reação na tela. Pare o processo de digestão se a temperatura não aumentar de acordo com o programa prescrito.
    NOTA: Durante a digestão, picos repentinos de temperatura podem ser vistos na tela do forno de micro-ondas. Eles ocorrem quando as amostras reagem exotermicamente com os produtos químicos. O sistema de micro-ondas irá regular automaticamente a temperatura, ajustando a potência de saída.
  8. Aguarde até que a digestão assistida por micro-ondas seja concluída e a temperatura da amostra diminua.
  9. Abra a porta do forno de micro-ondas e retire o rack da câmara do forno de micro-ondas. Feche a porta e desligue o instrumento.
  10. Retire os recipientes de reação do rack e espere que eles esfriem até a temperatura ambiente.
  11. Abra lentamente as tampas da tampa manualmente para liberar os gases formados durante a digestão ácida. Gire os vasos de reação na direção da exausta (Figura 6).
  12. Remova completamente a tampa e lave a tampa e as paredes do recipiente de reação com uma pequena quantidade de água ultrapura.
  13. Transferir quantitativamente o conteúdo do recipiente de reacção para um balão volumétrico de vidro limpo de 25 ml através de um funil de vidro através de uma lavagem repetida da tampa e do recipiente de reacção com água ultrapura.
  14. Diluir a amostra com água ultrapura até à marca do balão volumétrico. Fechar o balão volumétrico com uma rolha e misturar o conteúdo do balão volumétrico.
    NOTA: Deve proceder-se a uma diluição adicional das amostras digeridas com água ultrapura, uma vez que estas devem conter menos de 5% (V/V) de ácido residual34 e menos de 2 g/L de elementos dissolvidos, também designados por sólidos dissolvidos totais35.
  15. Pegue uma seringa de plástico de 20 mL e conecte-a a um filtro de seringa de poliamida (25 mm de diâmetro, tamanho de poro de 0,20 μm). Encha a seringa de plástico com a amostra diluída e filtre o seu conteúdo num tubo de centrífuga de plástico de 50 ml aplicando pressão. Use uma nova seringa plástica e um filtro de seringa para cada amostra para evitar qualquer contaminação cruzada.
    NOTA: As amostras precisam ser filtradas para remover quaisquer materiais insolúveis ou partículas sólidas que possam permanecer não digeridas após a MAWD. Essas partículas podem interferir nas medidas de determinação elementar por obstruir os componentes do instrumento. Ao filtrar as amostras, certifique-se de descartar as primeiras gotas. Use filtros hidrofílicos (feitos de poliamida) para soluções aquosas. Os filtros hidrofóbicos (PTFE) não são adequados para a filtração de soluções aquosas, pois requerem maior pressão aplicada, o que poderia resultar em ruptura da membrana36.
  16. Fechar o tubo da centrífuga plástica de 50 mL com tampa de rosca e colocar a amostra na geladeira até as medições.
    NOTA: As amostras digeridas são armazenadas na geladeira em temperaturas mais baixas para preservá-las e estender seu tempo de armazenamento.

6. Limpeza do vaso de reação

  1. Após as amostras digeridas serem transferidas para frascos volumétricos de 50 mL, adicionar 5,0 mL de HNO3 em peso 68% e 5,0 mL de água ultrapura com pipetas automáticas de 5 mL nos vasos de reação.
  2. Feche os recipientes de reação com as tampas da tampa e insira-os no rack. Transfira o rack para a câmara do forno de micro-ondas.
  3. Aplique o seguinte programa de micro-ondas: aumento de 15 min para 160 °C, aumento de 10 min para 180 °C, potência máxima de 900 W.
  4. Monitorar as condições de reação durante o aquecimento. Após o aquecimento ser concluído, deixe os recipientes de reação esfriarem.
  5. Abra o forno de micro-ondas, retire os recipientes de reação do rack e abra-os lentamente no exaustor.
  6. Descarte o conteúdo dos recipientes de reação em recipientes de resíduos plásticos.
  7. Lave os vasos de reação com água ultrapura para remover qualquer excesso de material ou produtos químicos.
  8. Secar os recipientes de reacção no secador a 105 °C antes da próxima utilização.
    NOTA: O mesmo procedimento de micro-ondas (tempo, potência, gradiente de temperatura e volume de produtos químicos) usado para a digestão ácida das amostras pode ser usado para limpar os vasos de reação. Alternativamente, os vasos de reação podem ser limpos sem o sistema de micro-ondas, submergindo-os em HNO3 ou HCl concentrado por várias horas e enxaguando-os com água ultrapura.

7. Determinação multielementar com ICP-MS

  1. Retirar do frigorífico os tubos de centrífuga de plástico de 50 ml que contêm as amostras digeridas e deixá-los aquecer à temperatura ambiente.
  2. Diluir as amostras por um factor de 10 para diminuir a concentração de ácido na amostra digerida e diminuir a concentração do componente da matriz da amostra. Com uma pipeta automática, transfira 2,50 mL da amostra para um balão volumétrico de vidro de 25 mL e, em seguida, preencha-a até a marca com água ultrapura.
  3. Transferir as amostras diluídas para os tubos de plástico de 15 ml e colocá-las nas posições adequadas no amostrador automático.
  4. Preparar o instrumento ICP-MS (ver Tabela de Materiais) para as medições:
    1. Ligue a ventilação e o chiller que abastece o ICP-MS com água de resfriamento e resfria seus componentes.
    2. Use o software compatível para garantir que a solução de enxágue (1% em peso de HNO3) flua continuamente do amostrador automático para o ICP-MS sem pulsar.
    3. Abrir botijões de gás Ar (99,999% de pureza) e He (99,999% de pureza) para abastecer o ICP-MS com ambos os gases. Verifique o fluxo de gás no software e ajuste-o, se necessário.
      NOTA: Use célula de colisão com gás He quando interferências espectrais são esperadas devido à formação de íons poliatômicos (por exemplo, 40Ar16O+ interferindo com 56Fe+)37.
    4. Ligue o plasma e calibre o instrumento usando a solução de afinação (consulte Tabela de Materiais).
    5. Uma vez calibrado o instrumento (posição da tocha, tensão de ganho, tensão da lente, massa/resolução, calibração de pulso/analógico (P/A), calibração de banco de dados (DB) e validação), selecione o método de medição desejado e realize as medições.
  5. Ao trabalhar com amostras desconhecidas, realizar uma determinação semiquantitativa para obter informações sobre quais elementos estão presentes na amostra e sua concentração aproximada.
    NOTA: É aconselhável diluir adicionalmente as amostras para a determinação semiquantitativa, uma vez que os detectores têm um limite da concentração de elementos que podem detectar de uma só vez. Concentrações de amostra mais baixas podem prolongar a vida útil dos componentes do instrumento.
  6. Depois de obter os dados sobre as concentrações aproximadas dos elementos nas amostras, crie um método para a determinação elementar quantitativa no software. Selecione as condições de operação do ICP-MS (Tabela 1) e selecione os elementos desejados (no presente caso, Fe, Mn e Zn). Determinar o número e as concentrações de soluções da norma necessárias para criar uma curva de calibração (por vezes referida como curva analítica ou curva de trabalho) (Quadro 1).
    NOTA: Preparar pelo menos seis concentrações diferentes como pontos de calibração para a curva de calibração.
  7. Preparar soluções de padrão para a curva de calibração. Usando pipetas automáticas, pipetar o volume necessário de soluções padrão multielementos de 100 mg/L em balões volumétricos de vidro de 25 mL, para preparar soluções de padrões com as seguintes concentrações: 1,0 μg/L, 2,5 μg/L, 5,0 μg/L, 10,0 μg/L, 20,0 μg/L, 30,0 μg/L, 40,0 μg/L e 50,0 μg/L. Encha os frascos até a marca com 1% em peso de HNO3. Além disso, prepare um espaço em branco de calibração usando a solução de HNO3 em peso de 1%.
  8. Transfira as soluções preparadas do padrão e das amostras para os tubos plásticos de 15 mL, coloque-as no amostrador automático e inicie o instrumento seguindo o procedimento descrito na etapa 7.4.
  9. Realizar a medição quantitativa dos elementos selecionados utilizando a metodologia da curva de calibração.
  10. Quando as medições forem concluídas, desligue o plasma, feche as fontes de gás Ar e He, desligue o chiller ICP-MS e desligue o sistema de ventilação.

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Representative Results

Homogeneização
Todas as amostras foram secas até uma massa constante com o secador de laboratório para eliminar qualquer umidade. A transferência da amostra para um exsicador permitiu que ela resfriasse até a temperatura ambiente sem ligar a umidade do ambiente circundante. As amostras de alimentos foram então homogeneizadas em misturador de laboratório para obtenção de um pó fino. As partículas homogeneizadas resultantes foram uniformes em tamanho e uniformemente distribuídas, garantindo que as subamostras (amostras retiradas de uma amostra maior) usadas para digestão ácida fossem representativas. As amostras foram facilmente removíveis do copo misturador com o auxílio de uma espátula plástica, com exceção da amostra de carne seca, que foi mais difícil de remover devido ao seu maior teor de gordura. O maior teor de gordura fez com que a amostra aderisse parcialmente às paredes de vidro do copo misturador. A comparação entre amostras frescas, secas e homogeneizadas é apresentada na Figura 2.

Os componentes do instrumento tiveram que ser limpos várias vezes com água ultrapura para eliminar todas as partículas de alimentos que permaneceram no misturador.

É essencial garantir que a massa pesada da amostra não exceda o valor máximo permitido nos recipientes de reacção. A pesagem foi realizada utilizando-se balança analítica à temperatura constante e espátula plástica para evitar contaminação com metais que possam advir de espátulas metálicas.

Digestão ácida
Todas as amostras utilizadas no protocolo foram amostras de alimentos contendo várias quantidades de carboidratos, proteínas e gorduras. HNO3, em combinação com H2O2, é adequado para a digestão dessas moléculas, e outros produtos químicos não são necessários. Os produtos químicos foram tratados em uma capela de fumaça, uma vez que o HNO3 forma fumos. Após a adição dos produtos químicos nos recipientes de reação TFM-PTFE, as tampas de cobertura foram montadas na parte superior dos recipientes de reação e foram bem seladas para evitar possível contaminação e perda do analito. Os vasos de reação foram distribuídos simetricamente no rack para garantir uma irradiação uniforme de micro-ondas dentro do sistema de micro-ondas.

Durante a digestão ácida, a porta do sistema de micro-ondas foi fechada e a porta não pôde ser aberta até o final do protocolo. Todo o processo de digestão ácida pode ser monitorado na tela do aparelho, mostrando a mudança de temperatura com o tempo (Figura 7).

Após a digestão ácida ter sido concluída e as soluções das amostras digeridas terem resfriado à temperatura ambiente, os vasos de reação foram abertos no exaustor. Eles foram abertos o mais devagar possível. Se a pressão for liberada muito rapidamente, até mesmo pequenas gotículas da mistura de reação podem escapar, resultando na perda do analito. Quando os vasos de reação foram abertos, um gás amarelo ou amarelo-alaranjado foi liberado (Figura 8). A coloração dos vapores pode ser atribuída ao NO2, que forma fumos alaranjados em temperaturas mais elevadas. O aumento da pressão nos vasos de reação foi devido à oxidação das amostras de alimentos com HNO3, resultando na formação de gases como CO2, H2O, NO, etc. Após a desgaseificação dos vasos de reação, uma solução amarelo-clara ou incolor da amostra digerida permaneceu no vaso de reação, indicando que a digestão ácida total por MAWD havia sido alcançada. Isso foi confirmado pela ausência de partículas visíveis deixadas na solução.

A etapa final do preparo das amostras envolveu a diluição das amostras digeridas com água ultrapura para reduzir a acidez residual (AR). Altos valores de RA interferem nas medidas, aumentando o sinal de fundo. A diluição também diminui a concentração de íons metálicos na amostra líquida26. Ao transferir a solução das amostras digeridas para frascos volumétricos, os componentes do recipiente de reação foram cuidadosamente lavados com água ultrapura para transferir completamente o analito. Um problema que ocorre é que pequenas gotas de água ultrapura, que podem conter o analito de interesse, aderem às paredes dos vasos de reação. Após diluição com água ultrapura até a marca de 25 mL, todas as amostras tornaram-se incolores. As soluções finais das amostras digeridas continham sais solúveis em água, pois os elementos metálicos presentes na amostra reagiram com o HNO3 formando nitratos altamente solúveis. Técnicas de análise elementar podem determinar os íons metálicos que formam sais solúveis em água. Ao filtrar as soluções diluídas, é importante descartar as primeiras gotas para garantir que quaisquer partículas ou contaminantes sejam removidos. Após a filtração, as soluções foram bem seladas para evitar qualquer vazamento e, em seguida, armazenadas na geladeira.

A principal limitação do procedimento de digestão ácida é o rendimento da amostra. O sistema MAWD pode digerir apenas um número limitado de amostras por vez. Além disso, cada etapa de digestão e preparação subsequente da amostra pode levar várias horas para ser concluída. Além disso, a limpeza do vaso de reação também é demorada, mas é crucial para minimizar o risco de contaminação cruzada entre as amostras.

Determinação multielementar com ICP-MS
Para cada elemento, foi construída uma curva de calibração. Eles foram obtidos plotando-se a intensidade em função das concentrações dos analitos (Figura 9). Os intervalos lineares de concentração para todos os elementos medidos estavam na faixa de 1,0 μg/L a 50,0 μg/L.

O LOD e o LOQ para cada elemento foram calculados usando a Equação 1 e a Equação 2, respectivamente. Em ambas as equações, sblank representa o desvio padrão das diversas medidas de calibração em branco (10 repetições)38,39, enquanto b1 representa a inclinação da curva de calibração.

Equation 1(1)

Equation 2(2)

Os LODs obtidos foram 0,5 ng/L, 2,8 ng/L, 2,8 ng/L e 3,2 ng/L para Mn,, Fe e Zn, respectivamente. Os LOQs obtidos foram 1,6 ng/L, 9,2 ng/L, 9,5 ng/L e 10,8 ng/L para Mn,, Fe e Zn, respectivamente.

Foram realizadas seis digestãos repetidas de cada amostra. Três digestãos replicadas de cada amostra foram realizadas sem picar a amostra com soluções padrão, e três digestãos replicadas foram realizadas com a adição de uma solução de uma quantidade conhecida de analito padrão para testar a exatidão (teste de recuperação de espícula40) e precisão de toda a metodologia. Para a determinação da exatidão antes do procedimento de digestão, 37,5 μL de 100 mg/L de solução padrão multielemento ICP foram pipetados nos recipientes de reação contendo a amostra, o que resultou em um aumento da concentração de 15,0 μg/L nas amostras fortificadas que foram diluídas por um fator de 10. Isso também correspondeu a um aumento de 15,0 μg por grama de amostra para cada íon metálico medido. A exatidão e a precisão foram determinadas por meio de Rec e desvio padrão relativo (RSD), respectivamente.

A precisão de um método analítico pode ser avaliada pelo teste de recuperação de espículas. Para este efeito, é adicionada à amostra uma solução de uma quantidade conhecida de padrão de analito, que é então digerida nas mesmas condições de reacção que as amostras que não são fortificadas41. O Rec é calculado usando a equação 3, onde γi é a concentração medida das amostras fortificadas após a digestão, enquanto γt representa a concentração determinada da amostra não cravada considerando o aumento da solução adicionada do padrão do analito. As γi e γt são médias das três réplicas. O método analítico é considerado exato quando o Rec está na faixa de 80,00%-120,00%42.

Equation 3(3)

A precisão de um método analítico é avaliada com RSD. Descreve a proximidade de concordância entre os resultados independentes, que foram obtidos através de várias medidas replicadas. A DSR é calculada usando a equação 4, onde sm representa o desvio padrão das medidas replicadas para a determinação da concentração, enquanto Equation 4 representa o valor médio das concentrações determinadas. O método analítico é considerado preciso se o valor de RSD for inferior a 20,00%43.

Equation 5(4)

Todas as amostras foram diluídas com água ultrapura por um fator de 10 antes das medidas de ICP-MS (para o primeiro conjunto de medidas). A diluição diminuiu a concentração dos componentes da matriz introduzidos no analisador. Além disso, ao diluir a amostra, a AR diminui. Uma AR alta pode comprometer a eficiência da ionização do plasma ou resultar em problemas de interferência da matriz. Se a concentração dos analitos após a primeira série de medições for inferior à LOQ, o factor de diluição deve ser inferior a 10. A quantificação dos íons metálicos foi realizada por meio de uma curva de calibração. Os valores dos resultados calculados devem ter a mesma precisão (o mesmo número de valores significativos) que a solução do padrão empregado para a calibração. O teor de íons metálicos na amostra foi expresso em μg por grama de peso (μg/g). Isto foi conseguido multiplicando-se a concentração mássica medida da amostra analisada pelo fator de diluição para obter a concentração na amostra original digerida. Essa concentração de massa foi então multiplicada pelo volume da amostra digerida (25 mL) e, em seguida, dividida pela massa inicial pesada da amostra homogeneizada (a massa ponderada inicial é a massa da amostra que foi pesada no vaso de reação para o MAWD). Todos os valores são relatados como uma média de três réplicas.

O conteúdo relatado dos elementos abaixo é dado como Equation 4 ± sm. O teor de, Mn e Zn na amostra de brócolis foi de 5,9 ± 0,5 μg/g, 32,5 ± 2,7 μg/g e 42,8 ± 0,2 μg/g, respectivamente. A concentração mássica determinada de Fe nas amostras de brócolis excedeu o limite superior da faixa de concentração linear da curva de calibração (isto é, 50,0 μg/L). Assim, a solução da amostra foi diluída com água ultrapura por um fator de 2, e a medida de ICP-MS dessa solução foi realizada. Os resultados mostraram que o brócolis continha 63,0 ± 1,9 μg/g de Fe.

Para o cogumelo, os teores de Zn, Fe, e Mn foram de 35,6 ± 1,4 μg/g, 30,4 ± 1,3 μg/g, 18,5 ± 1,0 μg/g e 5,4 ± 0,3 μg/g, respectivamente. As salsichas continham 42,2 ± 0,9 μg/g de Fe, 25,1 ± 2,6 μg/g de Zn e 1,0 ± 0,1 μg/g de. A determinação multielemento com ICP-MS da solução digerida, diluída 10 vezes, mostrou que a concentração de Mn foi inferior ao limite inferior da faixa linear de concentração (i.e., 1,0 μg/L). Assim, a solução original da amostra de linguiça foi diluída apenas por um fator de 5, e a determinação multielemento com ICP-MS foi repetida. O teor de Mn nas amostras de salsicha foi determinado em 0,9 ± 0,3 μg/g. Macarrão continha 5,4 ± 2,8 μg/g de Zn, 10,3 ± 1,2 μg/g de Fe, 1,6 ± 0,3 μg/g de e 7,5 ± 0,2 μg/g de Mn.

O Rec para todos os analitos medidos nas quatro amostras estava na faixa de 80,00%-120,00%, indicando a exatidão do método analítico. Os cálculos mostraram que o método analítico foi preciso, pois os valores de RSD foram inferiores a 20,00%, exceto RSD para Zn em amostras de macarrão. Os resultados estão apresentados na Tabela 2.

Figure 1
Figura 1: Misturador de laboratório utilizado para homogeneização de amostras de alimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Comparação das amostras frescas, secas e homogeneizadas. (A-D) Amostras frescas de brócolis, cogumelos, salsicha e macarrão. (E-H) amostras secas de brócolis, cogumelos, salsicha e macarrão. (I-L) amostras homogeneizadas de brócolis, cogumelos, salsicha e macarrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Pesagem da amostra em balança analítica. Isso é realizado de cima, abrindo o retalho superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Sistema de micro-ondas. O sistema de micro-ondas para digestão ácida com tela sensível ao toque lateral para selecionar as condições de reação e monitorar o processo de digestão ácida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Componentes utilizados para digestão ácida assistida por micro-ondas. (A) Rack com 14 vasos de reação para digestão ácida dentro da câmara do forno de micro-ondas. (B) Os vasos de reação TFM-PTFE consistem em 3 partes. Uma vez fechados os recipientes com tampas, nem a amostra nem os gases podem escapar ou entrar nos recipientes de reação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: O interior dos vasos de reação quando abertos na capela de fumos. (A) A coloração amarelo-alaranjada dos fumos deve-se ao NO2 produzido durante a digestão ácida. (B) A coloração amarela da solução da amostra digerida após a maioria dos gases ter escapado do recipiente de reação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Variação da temperatura com o tempo. Um gráfico mostrando a mudança de temperatura em função do tempo durante a digestão ácida com MAWD. T2 significa a temperatura da mistura de reação dentro dos vasos de reação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Abertura dos recipientes de reação sob o exaustor de fumos, onde são liberados gases amarelo-alaranjados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Exemplo de uma curva de calibração para Mn. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: Instrumento ICP-MS utilizado para determinação de múltiplos elementos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Condições operacionais do instrumento ICP-MS. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Valores de rec e RSD de brócolis, cogumelos, salsicha e macarrão. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Discussion

Homogeneização
Para garantir resultados reprodutíveis na determinação elementar, é necessário homogeneizar as amostras antes da digestão ácida devido à sua estrutura e composição complexas e não homogêneas. A homogeneização visa eliminar a heterogeneidade constitucional e distributiva. A mistura da amostra minimiza a heterogeneidade distributiva, redistribuindo uniformemente os componentes por toda a amostra. Da mesma forma, ao reduzir o tamanho das partículas a um tamanho uniforme, a heterogeneidade constitucional é reduzida44. As subamostras obtidas a partir do homogeneizado devem conter a mesma proporção de componentes que a amostra original para serem representativas45.

A homogeneização é obtida aplicando-se uma força para quebrar a amostra em partículas menores46. As amostras podem ser homogeneizadas por corte, picagem, cisalhamento, esmagamento, moagem ou mistura. No entanto, o método adequado deve considerar o grau de dureza, fragilidade, abrasividade, elasticidade, forma e capacidade de adesão da amostra ao método dos componentes do homogeneizador47.

A amostra pode ser triturada manualmente com pilão e argamassa ou moída em uma variedade de moinhos (moinho de facas, moinho de corte, moinho de bolas, moinho misturador, etc.), e outras formas de homogeneizadores48. Misturadores pequenos de laboratório com lâminas cerâmicas ou metálicas são comumente usados para homogeneização, pois reduzem rapidamente o tamanho da partícula desintegrando e misturando simultaneamente a amostra. A moagem de amostras em partículas homogêneas menores aumenta a área superficial específica, o que acelera a digestão ácida por MAWD.

No entanto, deve-se tomar cuidado para evitar qualquer contaminação devido à abrasão durante a moagem. As amostras não devem ser homogeneizadas com lâminas contendo os mesmos metais que os elementos a determinar após digestão ácida. Consequentemente, as lâminas cerâmicas são mais frequentemente utilizadas em comparação com as lâminas metálicas. A homogeneização é frequentemente um importante fator que contribui para a contaminação cruzada, geralmente a partir de componentes de inventário e instrumentos limpos inadequadamente, resultando em erros sistemáticos. Após o uso, cada componente do misturador deve ser cuidadosamente limpo e lavado com água ultrapura.

A moagem criogênica é usada para homogeneizar amostras que são mais difíceis de quebrar. A amostra é congelada com nitrogênio líquido (que tem -196 °C), tornando-a quebradiça e de fácil homogeneização49,50.

Digestão ácida
Um dos ácidos oxidantes mais utilizados em procedimentos de digestão ácida é o HNO3. Geralmente é usado em combinação com uma baixa quantidade de H2O2, o que aumenta o poder oxidante do ácido, melhorando assim a eficiência da digestão20. Uma mistura desses dois produtos químicos é frequentemente utilizada para a digestão de amostras orgânicas, incluindo amostras de alimentos51. A digestão de amostras orgânicas em MAWD é realizada a pressões e temperaturas elevadas que excedem o ponto de ebulição (121 °C) do azeótropo HNO3 à pressão atmosférica27. No MAWD o ponto de ebulição do HNO3 sobe para 176 °C à medida que a pressão é aumentada para 5 atm27. A temperatura na qual a digestão ácida é realizada no MAWD não pode ser alcançada em sistemas abertos porque o HNO3 evaporaria, reduzindo a eficiência da digestão ácida.

Durante a digestão em vasos fechados por MAWD, o HNO3 reage com a amostra orgânica sob condições adversas de reação, formando produtos gasosos como CO2, H2O e NO (Equação 5)52,53. O benefício do uso de vasos de reação fechados é o menor volume e concentração do ácido necessário para a digestão, já que o HNO3 está constantemente sendo regenerado. Esse processo de regeneração ocorre enquanto o O2 estiver presente no vaso de reação. A fonte primária de O2 é H2O2, que é termicamente instável e se decompõe em H2O e O2 (Equação 6). No vaso de reação, o NO reage com o NO2 para formar o NO2 (Equação 7). O NO2 formado dissolve-se em H2O, resultando na formação do HNO3 e do HNO2 (Equação 8). O HNO2 produzido degrada-se posteriormente em H2O, NO2 e NO (Equação 9), completando o mecanismo de regeneração53,54. Os recém-formados NO e NO2 reagem então pelos processos acima mencionados.

Equation 6(5)

Onde n representa o número de átomos de carbono.

Equation 7(6)

Equation 8(7)

Equation 9(8)

Equation 10(9)

Quando amostras orgânicas reagem com HNO3, os metais presentes em sua estrutura química formarão nitratos solúveis em água55. Como o MAWD visa converter sólidos em líquidos, a formação de sais solúveis em água é desejada.

Para diferentes amostras, diferentes combinações de ácidos podem ser empregadas devido à complexidade da composição da amostra. Como amostras orgânicas e especialmente inorgânicas menos facilmente degradáveis não podem ser dissolvidas apenas com HNO3, outros ácidos como HCl, HF, HClO4 e H2SO4 também são usados21,56.

O HCl não oxidante em temperaturas elevadas é utilizado para a digestão de sais como carbonatos, fosfatos, óxidos, boratos, sulfetos e fluoretos28,55. Quando o HCl é combinado com o HNO3 em uma razão molar de 3:1, a aqua regia é formada, o que melhora a capacidade oxidante em comparação com o HCl e o HNO3 isoladamente devido à formação de cloreto de nitrosila (NOCl), Cl2 e H2O (Equação 10)57. Aqua regia é capaz de dissolver metais nobres como Au, Pt, Pd28.

Equation 11(10)

Para a digestão de silicatos, o HF é frequentemente utilizado, uma vez que quebra fortes ligações entre Si e O. Quando o HF interage com amostras de silicato (minerais, solo), forma-se ácido hexafluorosilícico (H2SiF6) (Equação 11)19,58. No entanto, apesar da capacidade do HF de digerir silicatos, ele apresenta várias desvantagens, incluindo a formação de sais insolúveis de flúor6, a formação de produtos voláteis com metais pesados19 e SiF volátil427. Além disso, o HF não pode ser usado com vidraria e vasos de reação de quartzo, pois os dissolve18.

Equation 12(11)

Vasos de reação para digestão ácida
Os vasos de reação usados no MAWD são projetados para suportar altas temperaturas e pressões elevadas durante a digestão ácida. Esses vasos de reação também apresentam boa permeabilidade ao micro-ondas, permitindo a passagem de micro-ondas sem serem absorvidos20. As micro-ondas que passarem pelos vasos de reação atingirão as moléculas de água, que efetivamente as absorverão, uma vez que são polares, consequentemente aquecendo a solução que contém a amostra59. Apenas a fase líquida nos vasos reacionais absorve a radiação de micro-ondas enquanto a fase gasosa não, resultando em um alto aumento da temperatura com um ligeiro aumento da pressão18.

Para minimizar a contaminação e a perda de analitos, os vasos de reação são hermeticamente fechados, impedindo que qualquer material escape ou entre nos vasos.

Os materiais mais utilizados para vasos de reação são o politetrafluoretileno (PTFE) sintético, o PTFE copolimerizado conhecido como TFM, o alcano perfluoroalcóxi (PFA) e o quartzo52,60. Esses materiais são quimicamente inertes à maioria dos produtos químicos usados na digestão ácida, exceto para vasos de quartzo, nos quais o HF se dissolve. O uso de apenas um tipo de vaso de reação em cada experimento é crucial, pois o uso de diferentes tipos de vasos pode resultar em diferentes condições de reação quando submetidos ao aquecimento por micro-ondas. Em temperaturas de reação mais baixas, vasos de reação de PTFE, PFA e TFM-PTFE são usados, enquanto em temperaturas acima de 300 °C são recomendados vasos de quartzo52. Isso ocorre porque os polímeros se deterioram e se decompõem em temperaturas mais altas.

Avaliação da eficiência da digestão ácida
Existem várias maneiras de avaliar a eficiência da digestão ácida. A cor da solução pode ser usada para avaliar se houve digestão completa ou parcial da amostra. Geralmente, uma coloração incolor ou ligeiramente amarela da solução é um indicador de digestão bem-sucedida, enquanto a cor amarela, laranja, verde ou marrom mais escura da solução sugere que o processo de digestão não foi bem-sucedido, o que significa que a digestão parcial ocorreu61. Em alguns casos, partículas orgânicas ou inorgânicas não digeridas podem estar presentes na mistura de reação após a digestão, exigindo filtração antes que a amostra possa ser introduzida no instrumento para determinação elementar. A remoção de partículas não digeridas evita o entupimento do sistema e a instabilidade do plasma no caso de ICP-OES e ICP-MS31.

A eficiência da digestão ácida também pode ser avaliada experimentalmente através de medidas de teor de carbono residual (CCR) e AR. O CCR representa a quantidade de carbono orgânico remanescente na solução que não foi convertida em CO2 durante a digestão62. Um valor mais baixo de CCR é preferido para reduzir interferências não espectrais e espectrais (por exemplo, 40Ar12C+) na determinação elementar63,64. As medidas do CCR são realizadas por ICP-OES. O teor de carbono é determinado em um comprimento de onda de emissão de 193,091 nm 65,66,67. A eficiência da digestão ácida está relacionada ao consumo de produtos químicos. Quanto mais ácido for consumido, menores serão os valores de CCR25.

O ácido é continuamente consumido durante a digestão, pois reage com a amostra. Na maioria dos casos, uma pequena quantidade de ácido permanece sem reação. A quantidade de AR pode ser determinada por titulação com NaOH10 ou KOH 25,54. Valores mais baixos de AR são preferidos, pois a maior concentração de ácido na solução final digerida pode aumentar o sinal de fundo em técnicas analíticas como ICP-MS25 e ICP-OES68. Valores mais elevados de AR também podem indicar o uso de menor concentração inicial de ácido para digestão69.

Determinação multielementar com ICP-MS
A ICP-MS é composta por vários componentes. A bomba peristáltica bombeia a solução da amostra do amostrador automático para o nebulizador. A amostra líquida é então convertida em aerossol pelo nebulizador, misturando-a com gás Ar. Posteriormente, a câmara de pulverização filtra as gotículas de aerossol, permitindo assim a introdução da mais fina fração de gotículas de aerossol no plasma70. O plasma de ar é gerado e mantido dentro da tocha pela bobina de radiofrequência, resultando em temperaturas de aproximadamente 10.000 K70. O aerossol é atomizado e ionizado no plasma Ar. Os íons então continuam através da interface para a região de alto vácuo. A óptica iônica guia os íons através da célula de colisão, onde a corrente de gás He colide com os íons monoatômicos dos analitos e íons poliatômicos. Como os íons poliatômicos são maiores que os analitos de mesma massa nominal, eles colidem mais frequentemente com He, perdem mais energia cinética e, assim, são eficientemente removidos71. Na etapa seguinte, os íons atingem o analisador de massa (no presente caso, quadrupolo). No analisador de massa, os íons são separados com base em sua relação massa/carga (m/z)72. Após a separação por m/z, os íons atingem o detector (no presente caso, um multiplicador de elétrons) (Figura 10).

Etapas críticas e limitações
Existem várias etapas críticas e algumas limitações dentro do protocolo. Garantir que as amostras estejam totalmente secas antes de continuar o processo e evitar a contaminação são etapas cruciais na homogeneização. Para evitar contaminação, deve-se esforçar para manter todos os utensílios de vidro limpos durante todo o processo73, pois isso pode afetar a precisão da análise. Em caso de contaminação, a amostra deve ser descartada e o processo de preparação repetido, o que pode ser demorado. Ao aplicar este protocolo a outras amostras não descritas neste protocolo, a digestão completa pode não ser alcançada, pois algumas amostras podem exigir temperaturas mais altas e produtos químicos diferentes para dissolver completamente todos os metais presentes na amostra. Para a digestão ácida, são necessários produtos químicos de alta pureza, o que pode ser caro. O uso de produtos químicos de alta pureza ajuda a minimizar as interferências, garantindo maior confiabilidade, precisão e precisão das medições realizadas pelo ICP-MS. O processo de preparação da amostra é demorado e tem um baixo rendimento de amostra, pois a preparação pode durar vários dias (secagem, homogeneização, digestão ácida), limitando o número de amostras que podem ser preparadas em um dia.

Ao realizar a determinação de múltiplos elementos com ICP-MS, interferências espectrais (poliatômicas e isobáricas) podem ser encontradas. As interferências poliatômicas, que geralmente ocorrem no plasma, combinam pelo menos dois isótopos, enquanto as interferências isobáricas representam isótopos de outros elementos com o mesmo m/z dos analitos medidos74. Eliminar essas interferências (por exemplo, com uma célula de colisão) é importante. Além das interferências espectrais, os resultados também são afetados por interferências não espectroscópicas que consistem na introdução da amostra no instrumento ICP-MS, distribuição do tamanho das gotículas de aerossol, estabilidade do plasma, transporte de íons através da interface etc.75.

O protocolo aqui descrito tem potencial para outras aplicações além das amostras de alimentos. Com pequenas modificações nas etapas de homogeneização e digestão ácida, poderia ser adaptado para a preparação de amostras inorgânicas, solo76, lixo eletrônico28, etc. Os ajustes podem envolver o uso de diferentes produtos químicos, variando seus volumes e alterando a temperatura de digestão para se adequar a diferentes tipos de amostra. Além disso, à medida que a tecnologia e as metodologias evoluem, outras melhorias e automação podem ser incorporadas ao protocolo, aumentando sua eficiência e reduzindo o tempo total de preparação da amostra.

Em resumo, este protocolo demonstra a homogeneização de amostras de alimentos em misturador de laboratório, digestão ácida úmida assistida por micro-ondas usando uma mistura de 68% em peso de HNO3 e 30% em peso de H2O2 em peso a temperatura e pressão elevadas, e determinação elementar com ICP-MS. O protocolo pode ser usado para treinar o pessoal na preparação de amostras para determinação elementar, pois o protocolo fornece instruções passo a passo e explica a teoria por trás da homogeneização, digestão ácida e determinação elementar.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem o apoio financeiro da Agência Eslovena de Pesquisa (Grant Nos. P2-0414, P2-0118, J1-2470, NK-0001 e J1-4416).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ar gas Messer 7440-37-1 Ar 5.0 gas (purity 99.999%).
AS-10 Autosampler system Shimadzu Autosampler connected to the ICP-MS, containing 68 ports for samples.
Automatic pipettes Sartorius 200 µL, 1 mL, and 5 mL automatic pipettes.
Balance XSE104 Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA Analytical balance scale with a maximum weighing mass of 120 g.
Ceramic knife Ceramic knife used for cutting fresh food samples.
Dessicator Glass desiccator with lumps of silica gel.
ETHOS LEAN Milestone, Sorisole, Italy Microwave system for wet acid digestion in closed 100 mL vessels made of TFM-PTFE.
Fume hood Laboratory fume hood with adjustable air flow.
Glass beakers RASOTHERM CarlRoth GmbH + Co.KG 50 mL, 250 mL glass beakers
Glass funnels Small glass funnels fitting into the neck of volumetric flasks.
He gas Messer 7440-59-7 He 5.0 gas (purity 99.999%).
Hydrogen peroxide ThermoFisher Scientific 7722-84-1 Hxdrogen peroxide 100 volumes 30 wt.% solution. Laboratory reagent grade.
ICP multi-element standard solution VIII Supelco 109492 100 mg/L ICP multi-element standard solution containing 24 elements (Al, B, Ba, Be, Bi, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Ga, K, Li, Mg, Mn, Na, Ni, Pb, Se, Sr, Te, Tl, Zn) in 2 % dilute nitric acid.
ICPMS 2030 Shimadzu Inductively coupled plasma mass spectrometry system for multi-element analysis of digested samples.
ICP-MS Tuning Solution A CarlRoth GmbH + Co.KG 250 mL tuning solution containing 6 elements (Be, Bi, Ce, Co, In, Mn) in 1 % nitric acid.
KIMTECH Purple Nitrile gloves Kimberly-Clark GmbH Disposable Purple Nitrile gloves (S, M or L).
Laboratory coat Any available supplier /
Mixer B-400 BÜCHI Labortechnik AG, Flawil, Switzerland Laboratory mixer with ceramic blades.
Nitric acid ThermoFisher Scientific 7697-37-2 Nitric acid, trace analysis grade, 68 wt%, density 1.42, Primar Plus, For Trace Metal Analysis.
Plastic centrifuge tubes Isolab 50 mL plastic centrifuge tubes with screw caps, single use.
Plastic syringes Injekt B. Braun 2 pice, single use 20 mL syringes.
Plastic tubes for autosampler Shimadzu 046-00147-04 Plastic tubes for autosampler, 15 mL capacity, 16 mm diameter, 100 mm length.
Plastic waste containers Plastic containers for the removal of chemicals after the cleaning procedure of reaction vessels.
Protective googles /
Samples (broccoli, sausage, noodles, zucchini, mushrooms) Fresh samples, which were dried to a constant weight and homogenized during the procedure. The samples were purchased from a local shop.
Spatula Plastic spatula.
Sterilizator Instrumentaria ST 01/02 Instrumentaria Dryer with adjustable temperature.
Syringe filters CHROMAFIL Xtra 729212 Syringe filters with polypropylene housing and polyamide hydrophilic membrane. Membrane diameter 25 mm, membrane pore size 0.2 µm.
Ultrapure water ELGA Labwater, Veolia Water Technologies. Ultrapure water with a resistivity of 18.2 MΩcm, obtained with laboratory water purification system.
Volumetric flasks 25 mL glass volumetric flasks.

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Rantaša, M., Majer, D., Finšgar, M. Preparation of Food Samples Using Homogenization and Microwave-Assisted Wet Acid Digestion for Multi-Element Determination with ICP-MS. J. Vis. Exp. (202), e65624, doi:10.3791/65624 (2023).

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