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Chemistry

Preparación de muestras de alimentos mediante homogeneización y digestión ácida húmeda asistida por microondas para la determinación de múltiples elementos con ICP-MS

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/65624
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Chemistry and Chemical Engineering, University of Maribor

Summary

El protocolo presentado describe la homogeneización de muestras con un mezclador de laboratorio, la digestión ácida de muestras de alimentos utilizando una mezcla de 68% en peso deHNO3 y 30% en peso deH2O2a través de digestión ácida húmeda asistida por microondas, y la determinación de elementos múltiples realizada con espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente. 

Abstract

La preparación de la muestra es crucial para la determinación elemental, y existen varias técnicas, una de las cuales implica la homogeneización seguida de la digestión ácida. Se requiere un cuidado especial durante la manipulación de la muestra en la etapa de preparación para eliminar o minimizar la posible contaminación y pérdida de analito. La homogeneización es un proceso que reduce simultáneamente el tamaño de partícula y distribuye uniformemente los componentes de la muestra. Después de la homogeneización, la muestra se somete a una digestión ácida, en la que se digiere con ácidos y productos químicos auxiliares a temperaturas elevadas, transformando las muestras sólidas en estado líquido. En este proceso, los metales de la muestra original reaccionan con los ácidos para formar sales solubles en agua. Las muestras preparadas mediante digestión ácida son adecuadas para el análisis elemental utilizando técnicas como la espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente, la espectroscopia de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente, la espectroscopia de absorción atómica, los métodos electroquímicos y otras técnicas analíticas. En este trabajo se detalla la preparación de muestras de alimentos para la determinación de elementos múltiples mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente. El procedimiento paso a paso implica el proceso de homogeneización utilizando un mezclador de tamaño de laboratorio con cuchillas de cerámica, seguido de la digestión ácida en recipientes cerrados utilizando la digestión ácida húmeda asistida por microondas. Una mezcla de 5,0 mL de 68% en peso deHNO3 y 1,0 mL de 30% en peso deH2O2 sirve como reactivo auxiliar. Esta guía proporciona una explicación de los procesos involucrados en ambas etapas.

Introduction

El análisis elemental es un proceso analítico para determinar la composición elemental de varias muestras. Se puede utilizar para controlar la ingesta de metales en el cuerpo humano (especialmente metales pesados1) ya que sus altas concentraciones pueden causar problemas de salud no deseados. Los metales pesados también son uno de los principales contaminantes ambientales, por lo tanto, es necesario el control de su presencia en el medio ambiente2. Además, el análisis elemental puede emplearse para determinar el origen geográfico de los productos alimenticios3 y para controlar la calidad de los alimentos y los recursos hídricos4. Además, se utiliza para la determinación de micro y macronutrientes en los suelos5 y para obtener información sobre los procesos geológicos a lo largo de la historia mediante el examen de la composición química de minerales y sedimentos6. También se han realizado estudios para determinar la presencia de metales raros en residuos eléctricos y electrónicos para su posterior regeneración de metales7, para evaluar el éxito de los tratamientos farmacológicos8 y para verificar la composición elemental de los implantes metálicos9.

La espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) y la espectroscopia de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) son técnicas comúnmente utilizadas para el análisis elemental de diversas muestras10. Permiten la determinación simultánea de múltiples elementos con límites de detección (LOD) y límites de cuantificación (LOQ) tan bajos como ng/L. En general, ICP-MS tiene valores de LOD11 más bajos y un rango de concentración lineal más amplio en comparación con ICP-OES12. Otras técnicas para determinar la composición elemental son la espectrometría de emisión óptica de plasma inducida por microondas13 y varias variantes de espectroscopia de absorción atómica (AAS), incluida la espectroscopia de absorción atómica de llama, la espectroscopia de absorción atómica electrotérmica2, la espectroscopia de absorción atómica de vapor frío y la espectroscopia de absorción atómica de generación de hidruros14. Además, la determinación elemental con bajo LOD y LOQ es posible con diferentes métodos electroanalíticos, especialmente con voltamperometría de stripping anódico15,16. Por supuesto, existen otros métodos para determinar la composición elemental de las muestras, pero no se emplean con tanta frecuencia como los métodos mencionados anteriormente.

La determinación elemental directa de muestras sólidas es factible utilizando espectroscopía de ruptura inducida por láser y fluorescencia de rayos X17. Sin embargo, para la determinación elemental con ICP-MS, ICP-OES y AAS es necesario convertir las muestras sólidas en estado líquido. Para ello, la digestión ácida se realiza utilizando ácidos y reactivos auxiliares (en la mayoría de los casosH2O2). La digestión ácida se realiza a temperatura y presión elevadas, convirtiendo la parte orgánica de la muestra en productos gaseosos y convirtiendo los elementos metálicos en sales solubles en agua, disolviéndolos así en la solución18.

Hay dos tipos principales de digestión ácida, la digestión de vasos abiertos y la digestión de vasos cerrados. La digestión en recipiente abierto es rentable14 pero tiene limitaciones, como la temperatura máxima de digestión, que coincide con la temperatura de ebullición de los ácidos a presión atmosférica. La muestra se puede calentar en placas calefactoras, bloques calefactores, baños de agua, baños de arena2 y microondas19. Al calentar la muestra de esa manera, gran parte del calor generado se pierde en el entorno20, lo que prolonga el tiempo de digestión14. Otras desventajas de la digestión en recipientes abiertos incluyen un mayor consumo de productos químicos, la mayor posibilidad de contaminación del ambiente circundante y la posible pérdida de analitos debido a la formación de componentes volátiles y su evaporación de la mezcla de reacción21.

Los sistemas de recipientes cerrados son más convenientes para la digestión de muestras orgánicas e inorgánicas en comparación con los sistemas de recipientes abiertos. Los sistemas de recipientes cerrados utilizan una variedad de fuentes de energía para calentar las muestras, como el calentamiento por conducción y las microondas22. Los métodos de digestión que utilizan microondas incluyen la combustión inducida por microondas23, los sistemas de cámara de reacción única24 y la digestión ácida húmeda asistida por microondas (MAWD) de uso común25,26. MAWD permite la digestión a temperaturas de funcionamiento más altas, que oscilan entre 220 °C y 260 °C y presiones máximas de hasta 200 bar, dependiendo de las condiciones de trabajo del instrumento27.

La eficiencia y la tasa de MAWD dependen de varios factores, incluyendo la composición química de las muestras, la temperatura máxima, el gradiente de temperatura, la presión en el recipiente de reacción, la cantidad de ácidos añadidos y la concentración de ácidos utilizados28. En MAWD, la digestión ácida completa se puede lograr en unos pocos minutos debido a las condiciones de reacción elevadas en comparación con las digestiones más duraderas en sistemas de recipientes abiertos. Se requieren volúmenes y concentraciones más bajos de ácidos en MAWD, lo que está en línea con las pautas actuales de química verde29. En MAWD, se necesita una cantidad menor de muestra en comparación con la digestión en recipiente abierto para realizar la digestión ácida, por lo general, hasta 500 mg de muestra son suficientes 30,31,32. Se pueden digerir grandes cantidades de muestras, pero requieren una mayor cantidad de productos químicos.

Dado que el instrumento para MAWD controla automáticamente las condiciones de reacción y la persona no entra en contacto directo con los productos químicos durante el calentamiento, MAWD es más seguro de operar que las digestiones de recipientes abiertos. Sin embargo, la persona siempre debe proceder con precaución al agregar productos químicos a los recipientes de reacción para evitar que entren en contacto con el cuerpo y causen daño. Los recipientes de reacción también deben abrirse lentamente, ya que la presión se acumula en su interior durante la digestión ácida.

Aunque la digestión ácida es una técnica útil para la preparación de muestras para la determinación elemental, la persona que la realiza debe ser consciente de sus posibles limitaciones. La digestión ácida puede no ser adecuada para todas las muestras, especialmente aquellas con matrices complejas y aquellas que son altamente reactivas o podrían reaccionar explosivamente. Por lo tanto, la composición de la muestra siempre debe evaluarse para seleccionar los productos químicos y las condiciones de reacción apropiados para una digestión completa que disuelva todos los elementos deseados en la solución. Otras preocupaciones que el usuario debe tener en cuenta y abordar son las impurezas y la pérdida de analitos en cada paso de la preparación de la muestra. La digestión ácida debe realizarse siempre de acuerdo con normas específicas o mediante protocolos.

El protocolo que se describe a continuación proporciona instrucciones para la homogeneización de muestras de alimentos en un mezclador de tamaño de laboratorio, un procedimiento para limpiar los componentes del mezclador, pesar adecuadamente la muestra, agregar productos químicos, realizar la digestión ácida mediante MAWD, limpiar los recipientes de reacción una vez completada la digestión, preparar las muestras para la determinación elemental y realizar una determinación cuantitativa de múltiples elementos con ICP-MS. Siguiendo las instrucciones que se dan a continuación, se debería poder preparar una muestra adecuada para la determinación elemental y realizar las mediciones de las muestras digeridas.

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Protocol

1. Homogeneización de muestras

  1. Con un cuchillo de cerámica limpio, corte manualmente las muestras de alimentos (brócoli, champiñones, salchichas y fideos) en trozos más pequeños para acelerar el proceso de secado. Prepare suficientes muestras para un mínimo de 6 réplicas de la digestión ácida (asegúrese de que la masa mínima de las muestras secas sea de 1500 mg).
    NOTA: Al aumentar el área de superficie de la muestra, se expone una porción más grande de la muestra al aire circundante calentado, lo que aumenta la tasa de evaporación del agua.
  2. Colocar la muestra en un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml y secarla a 105 °C con un peso constante utilizando un secador.
  3. Retire el vaso de vidrio con la muestra de la secadora e insértelo en el desecador.
  4. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente.
    NOTA: Las muestras deben pesarse a una temperatura constante para garantizar que el peso refleje con precisión la masa. Las variaciones de temperatura pueden afectar el volumen y la densidad de las muestras medidas.
  5. Abra el desecador y transfiera el vaso de vidrio con la muestra en la balanza analítica. Mida el peso del vaso de vidrio con la muestra.
  6. Una vez completado el pesaje, vuelva a colocar la muestra en la secadora.
    NOTA: Si la muestra se encogió significativamente durante el secado, se podría transferir a un vaso de vidrio más pequeño utilizando una espátula de plástico para un pesaje más conveniente.
  7. Repita el proceso como se describe en los pasos 1.3-1.6 hasta lograr un peso constante de la muestra.
  8. Introduzca la muestra heterogénea seca en el vaso mezclador (véase la tabla de materiales), asegurándose de que no supere el volumen máximo del vaso mezclador.
  9. Inserte el vaso mezclador en el mezclador y cierre la puerta de protección (Figura 1).
  10. Presione el botón de inicio para activar las cuchillas para moler y mezclar la muestra.
  11. Realice la molienda hasta que la muestra se convierta en un polvo fino o en una pasta homogénea. Para lograr dicho producto, repita el proceso de molienda varias veces.
  12. Cuando la muestra esté homogeneizada, apague el mezclador, abra la puerta de protección y retire el vaso de precipitados del mezclador.
  13. Retire la muestra homogeneizada del vaso mezclador y transfiérala a un vaso de precipitados de vidrio limpio de 50 ml con una espátula de plástico limpia (Figura 2).
    NOTA: Si la muestra es demasiado dura y podría dañar los componentes de la mezcladora, como las cuchillas y el vaso de precipitados de la mezcladora, se puede homogeneizar por otros medios, como triturarla en morteros. Los mezcladores no suelen ser adecuados para homogeneizar materiales duros, muestras congeladas o muestras fácilmente inflamables, lo que podría dañar los componentes del mezclador. Se desaconseja el uso de disolventes orgánicos en el mezclador.
    PRECAUCIÓN: Use equipo de seguridad y asegúrese de que la puerta de la batidora esté bien cerrada a medida que las cuchillas de la batidora giran a altas velocidades.

2. Limpieza del mezclador

  1. Añada agua ultrapura (véase la tabla de materiales) a la marca del vaso mezclador vacío.
  2. Inserte el vaso mezclador en el mezclador y realice el procedimiento de mezcla estándar.
  3. Saque el vaso de precipitados de la batidora y vierta las aguas residuales. Si es necesario, repita el proceso con agua ultrapura varias veces hasta que el agua permanezca limpia incluso después de mezclar.
  4. Retire las cuchillas y el sello de diafragma contaminados de la batidora y límpielos a fondo con agua ultrapura.
    NOTA: Utilice detergentes neutros para mejorar la eficiencia de la limpieza, especialmente cuando se trata de muestras con un alto contenido de grasa, ya que la grasa se adhiere fácilmente a la superficie del inventario del laboratorio.
    PRECAUCIÓN: Use el equipo de protección adecuado, como guantes, al quitar y limpiar las cuchillas para reducir el riesgo de posibles lesiones por sus bordes afilados.
  5. Seque los componentes limpios en la secadora a 105 °C y vuelva a insertarlos en la batidora.
    NOTA: Asegúrese de que los componentes del mezclador estén completamente secos antes de volver a instalarlos en el mezclador, para evitar el arrastre del agua a la siguiente muestra.

3. Pesaje de muestras

  1. Retire la tapa del recipiente de reacción TFM-PTFE de 100 ml de trifluorometoxilo-politetrafluoroetileno33.
  2. Coloque el recipiente de reacción abierto en la balanza analítica y asegúrese de que la balanza esté nivelada y puesta a cero antes de cada medición (Figura 3).
    NOTA: El pesaje debe realizarse a temperatura ambiente. Evite las áreas donde las fluctuaciones severas de temperatura y el flujo de aire puedan afectar el peso medido. Asegúrese de que el área de pesaje esté limpia y libre de contaminantes.
  3. Transfiera la muestra homogeneizada al recipiente de reacción con una espátula de plástico y pese 250 mg de la muestra. No pese la muestra por debajo del límite de peso mínimo de la balanza analítica.
  4. Una vez finalizado el pesaje, coloque la tapa de la tapa en el recipiente de reacción para proteger la muestra de la contaminación.
    NOTA: Exceder el límite de peso del procedimiento de digestión puede resultar en una digestión incompleta. Manipule la muestra y los recipientes de reacción con cuidado para evitar cualquier contaminación externa.

4. Adición de ácido

  1. Vierta aproximadamente 40,0 ml de HNO3 al 68 % en peso y 5,0 ml de 30 % en peso de H2O2 en vasos de precipitados de vidrio de 50 ml separados, respectivamente.
    NOTA: Los productos químicos deben ser de alta pureza con impurezas de metales traza de menos de 1,0 μg/L (ppb), idealmente en el rango de ng/L (ppt). Las impurezas de trazas de metales afectan la precisión y la repetibilidad de la determinación elemental.
  2. Coloque los recipientes de reacción en una campana extractora, abra las tapas de la tapa y agregue los volúmenes mencionados a continuación de 68 % en peso de HNO3 y 30 % en peso de H2O2 con pipetas automáticas de 1 ml o 5 ml, de acuerdo con las siguientes especificaciones:
    1. brócoli, champiñones, salchichas y fideos; por 250 mg de muestra añadir 5,0 mL 68% en peso de HNO3 y 1,0 mL 30% en peso de H2O2. Prepare tres réplicas para cada muestra.
    2. Para determinar la precisión del método (en términos de recuperación, Rec), utilice el procedimiento descrito en el paso 4.2.1 y añada 37,5 μL de solución patrón multielemento ICP de 100 mg/L (véase la Tabla de materiales) en los recipientes de reacción utilizando una pipeta automática de 200 μL. Para cada muestra, prepare tres réplicas.
      NOTA: Se seleccionó el volumen de 37,5 μL porque corresponde a un aumento de 15,0 μg/L para las soluciones enriquecidas de las muestras en comparación con la concentración en las soluciones no enriquecidas de las muestras. Además, el aumento de la concentración para la solución enriquecida de las muestras corresponde a la concentración final que todavía se encuentra en el rango de concentración lineal para cada analito medido.
    3. Preparar una muestra en blanco utilizando el mismo volumen de 68 % en peso de HNO3 y 30 % en peso deH2O2 que se utiliza para la digestión de muestras de alimentos en el paso 4.2.1. Para una muestra en blanco, no agregue la muestra a los recipientes de reacción.
      PRECAUCIÓN: El HNO3 utilizado para la digestión es corrosivo y produce humos. Por esta razón, la adición de ácido debe realizarse en una campana extractora. Se debe emplear equipo de protección de laboratorio estándar (guantes, gafas de seguridad y bata de laboratorio). Si hay contacto con ácido, el área afectada debe enjuagarse inmediatamente con un chorro de agua fría y se debe buscar ayuda médica.
  3. Coloque la tapa de la tapa en los recipientes de reacción y deje que las muestras reaccionen con el 68% en peso de HNO3 y el 30% en peso de H2O2 durante 2-3 min.
  4. Atornille la tapa de la rosca en el recipiente y apriete las tapas de la tapa.
  5. Agite el recipiente de reacción con ligeros movimientos de la mano para incorporar completamente las muestras a los productos químicos.
    NOTA: No deje las muestras en las paredes o tapas de los recipientes de reacción, ya que existe la posibilidad de que no se digieran por completo.

5. Digestión ácida húmeda asistida por microondas

  1. Encienda el sistema de microondas (consulte la Tabla de materiales) para la digestión ácida presionando el botón de inicio (Figura 4).
  2. Abra la puerta del horno microondas y retire la rejilla.
  3. Distribuya los recipientes de reacción cerrados simétricamente en el bastidor para garantizar una irradiación uniforme de las muestras mediante microondas.
  4. Inserte la rejilla en la cámara del microondas y móntela en un soporte (Figura 5).
  5. Cierre la puerta del horno microondas.
  6. Establezca un programa de digestión adecuado en la pantalla táctil del horno microondas con una herramienta en forma de bolígrafo. Elija un gradiente de temperatura adecuado, la temperatura final y el número de muestras que se van a digerir. El programa de digestión recomendado para diferentes muestras de alimentos se enumera a continuación:
    1. Brócoli, champiñones, salchichas y fideos: 10 min de aumento a 160 °C, 10 min de aumento a 200 °C, 15 min a 200 °C, potencia máxima de 900 W.
  7. Inicie el programa de digestión y controle el cambio en las condiciones de reacción en la pantalla. Detenga el proceso de digestión si la temperatura no aumenta de acuerdo con el programa prescrito.
    NOTA: Durante la digestión, se pueden ver picos repentinos de temperatura en la pantalla del horno microondas. Se producen cuando las muestras reaccionan exotérmicamente con los productos químicos. El sistema de microondas regulará automáticamente la temperatura ajustando la potencia de salida.
  8. Espere hasta que se complete la digestión asistida por microondas y la temperatura de la muestra disminuya.
  9. Abra la puerta del horno microondas y retire la rejilla de la cámara del horno microondas. Cierre la puerta y apague el instrumento.
  10. Retire los recipientes de reacción de la rejilla y espere a que se enfríen a temperatura ambiente.
  11. Abra lentamente las tapas de las tapas manualmente para liberar los gases formados durante la digestión ácida. Gire los recipientes de reacción en la dirección de la campana extractora (Figura 6).
  12. Retire completamente la tapa y enjuague la tapa y las paredes del recipiente de reacción con una pequeña cantidad de agua ultrapura.
  13. Transfiera cuantitativamente el contenido del recipiente de reacción a un matraz volumétrico de vidrio limpio de 25 ml a través de un embudo de vidrio enjuagando repetidamente la tapa y el recipiente de reacción con agua ultrapura.
  14. Diluir la muestra con agua ultrapura hasta la marca del matraz aforado. Cierre el matraz aforado con un tapón y mezcle el contenido del matraz aforado.
    NOTA: Se debe realizar una dilución adicional de las muestras digeridas con agua ultrapura, ya que deben contener menos del 5% (V/V) de ácidoresidual 34 y menos de 2 g/L de elementos disueltos, también denominados sólidos disueltos totales35.
  15. Tome una jeringa de plástico de 20 ml y conéctela con un filtro de jeringa de poliamida (25 mm de diámetro, tamaño de poro de 0,20 μm). Llene la jeringa de plástico con la muestra diluida y filtre su contenido en un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml aplicando presión. Utilice una jeringa de plástico nueva y un filtro de jeringa para cada muestra para evitar cualquier contaminación cruzada.
    NOTA: Las muestras deben filtrarse para eliminar cualquier material insoluble o partículas sólidas que puedan quedar sin digerir después de MAWD. Estas partículas pueden interferir con las mediciones de determinación elemental al obstruir los componentes del instrumento. Al filtrar las muestras, asegúrese de desechar el primer par de gotas. Utilice filtros hidrófilos (hechos de poliamida) para soluciones acuosas. Los filtros hidrófobos (PTFE) no son adecuados para la filtración de soluciones acuosas, ya que requieren una presión aplicada más alta, lo que podría provocar la ruptura de la membrana36.
  16. Cierre el tubo de centrífuga de plástico de 50 ml con un tapón de rosca y coloque la muestra en el refrigerador hasta las mediciones.
    NOTA: Las muestras digeridas se almacenan en el refrigerador a temperaturas más bajas para conservarlas y prolongar su tiempo de almacenamiento.

6. Limpieza del recipiente de reacción

  1. Después de transferir las muestras digeridas a matraces aforuados de 50 ml, añadir 5,0 ml de HNO3 al 68 % en peso y 5,0 ml de agua ultrapura con pipetas automáticas de 5 ml en los recipientes de reacción.
  2. Cierre los recipientes de reacción con las tapas de la tapa e insértelos en la rejilla. Transfiera la rejilla a la cámara del horno microondas.
  3. Aplicar el siguiente programa de microondas: aumento de 15 min a 160 °C, aumento de 10 min a 180 °C, potencia máxima 900 W.
  4. Controle las condiciones de reacción durante el calentamiento. Una vez completado el calentamiento, deje que los recipientes de reacción se enfríen.
  5. Abra el horno microondas, retire los recipientes de reacción de la rejilla y ábralos lentamente en la campana extractora.
  6. Deseche el contenido de los recipientes de reacción en contenedores de residuos plásticos.
  7. Enjuague los recipientes de reacción con agua ultrapura para eliminar cualquier exceso de material o productos químicos.
  8. Seque los recipientes de reacción en la secadora a 105 °C antes del siguiente uso.
    NOTA: Se puede utilizar el mismo procedimiento de microondas (tiempo, potencia, gradiente de temperatura y volumen de productos químicos) utilizado para la digestión ácida de las muestras para limpiar los recipientes de reacción. Alternativamente, los recipientes de reacción se pueden limpiar sin el sistema de microondas sumergiéndolos en HNO3 o HCl concentrado durante varias horas y enjuagándolos con agua ultrapura.

7. Determinación de elementos múltiples con ICP-MS

  1. Saca del refrigerador los tubos de centrífuga de plástico de 50 ml que contienen las muestras digeridas y deja que se calienten a temperatura ambiente.
  2. Diluir las muestras por un factor de 10 para disminuir la concentración de ácido en la muestra digerida y disminuir la concentración del componente de la matriz de la muestra. Con una pipeta automática, transfiera 2,50 ml de la muestra a un matraz aforado de vidrio de 25 ml y luego llénelo hasta la marca con agua ultrapura.
  3. Transfiera las muestras diluidas a los tubos de plástico de 15 ml y colóquelas en las posiciones adecuadas en el muestreador automático.
  4. Prepare el instrumento ICP-MS (ver Tabla de Materiales) para las mediciones:
    1. Encienda la ventilación y el enfriador que suministra agua de refrigeración al ICP-MS y enfría sus componentes.
    2. Utilice el software compatible para asegurarse de que la solución de enjuague (1 % en peso de HNO3) fluya continuamente desde el muestreador automático hasta el ICP-MS sin pulsaciones.
    3. Cilindros de gas Open Ar (99,999% de pureza) y He (99,999% de pureza) para suministrar ambos gases al ICP-MS. Compruebe el flujo de gas en el software y ajústelo si es necesario.
      NOTA: Utilice la celda de colisión con gas He cuando se esperen interferencias espectrales debidas a la formación de iones poliatómicos (por ejemplo, 40Ar16O+ que interfieren con 56Fe+)37.
    4. Ponga en marcha el plasma y calibre el instrumento utilizando la solución de afinación (consulte la Tabla de materiales).
    5. Una vez calibrado el instrumento (posición de la antorcha, voltaje de ganancia, voltaje de la lente, masa/resolución, calibración de pulso/analógico (P/A), calibración de base de datos (DB) y validación), seleccione el método de medición deseado y realice las mediciones.
  5. Cuando se trabaja con muestras desconocidas, se realiza una determinación semicuantitativa para obtener información sobre qué elementos están presentes en la muestra y su concentración aproximada.
    NOTA: Es aconsejable diluir adicionalmente las muestras para la determinación semicuantitativa, ya que los detectores tienen un límite de concentración de elementos que pueden detectar a la vez. Las concentraciones de muestra más bajas pueden prolongar la vida útil de los componentes del instrumento.
  6. Después de obtener los datos sobre las concentraciones aproximadas de los elementos en las muestras, cree un método para la determinación elemental cuantitativa en el software. Seleccione las condiciones de funcionamiento del ICP-MS (Tabla 1) y seleccione los elementos deseados (en este caso Cu, Fe, Mn y Zn). Determine el número y las concentraciones de soluciones del patrón necesarias para crear una curva de calibración (a veces denominada curva analítica o curva de trabajo) (Tabla 1).
    NOTA: Prepare al menos seis concentraciones diferentes como puntos de calibración para la curva de calibración.
  7. Preparar soluciones de patrón para la curva de calibración. Utilizando pipetas automáticas, pipetear el volumen requerido de soluciones patrón multielemento de 100 mg/L en matraces volumétricos de vidrio de 25 mL, para preparar soluciones de patrones con las siguientes concentraciones: 1,0 μg/L, 2,5 μg/L, 5,0 μg/L, 10,0 μg/L, 20,0 μg/L, 30,0 μg/L, 40,0 μg/L y 50,0 μg/L. Llene los matraces hasta la marca con 1 % en peso de HNO3. Además, prepare un blanco de calibración con la solución HNO3 al 1 % en peso.
  8. Transfiera las soluciones preparadas de patrón y muestras a los tubos de plástico de 15 ml, colóquelos en el muestreador automático y ponga en marcha el instrumento siguiendo el procedimiento descrito en el paso 7.4.
  9. Realizar la medición cuantitativa de los elementos seleccionados utilizando la metodología de la curva de calibración.
  10. Una vez completadas las mediciones, apague el plasma, cierre los suministros de gas Ar y He, apague el enfriador ICP-MS y apague el sistema de ventilación.

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Representative Results

Homogeneización
Todas las muestras se secaron hasta obtener una masa constante con el secador de laboratorio para eliminar la humedad. La transferencia de la muestra a un desecador permitió que se enfriara a temperatura ambiente sin retener la humedad del entorno circundante. A continuación, las muestras de alimentos se homogeneizaron utilizando el mezclador de laboratorio para obtener un polvo fino. Las partículas homogeneizadas resultantes fueron uniformes en tamaño y distribuidas uniformemente, asegurando que las submuestras (muestras extraídas de una muestra más grande) utilizadas para la digestión ácida fueran representativas. Las muestras se podían extraer fácilmente del vaso mezclador con la ayuda de una espátula de plástico, excepto la muestra de carne seca, que era más difícil de eliminar debido a su mayor contenido de grasa. El mayor contenido de grasa hizo que la muestra se adhiriera parcialmente a las paredes de vidrio del vaso mezclador. La comparación de muestras frescas, secas y homogeneizadas se muestra en la Figura 2.

Los componentes del instrumento tuvieron que limpiarse varias veces con agua ultrapura para eliminar todas las partículas de comida que quedaban en la batidora.

Es esencial asegurarse de que la masa pesada de la muestra no supere el valor máximo permitido en los recipientes de reacción. El pesaje se realizó mediante una balanza analítica a temperatura constante, y se utilizó una espátula de plástico para evitar la contaminación con metales que puedan surgir de las espátulas metálicas.

Digestión ácida
Todas las muestras utilizadas en el protocolo fueron muestras de alimentos que contenían diversas cantidades de carbohidratos, proteínas y grasas. El HNO3, en combinación con elH2O2, es adecuado para la digestión de estas moléculas, y no se requieren otros productos químicos. Los productos químicos se trataron en una campana extractora, ya que el HNO3 forma humos. Después de agregar los productos químicos en los recipientes de reacción TFM-PTFE, se montaron tapas de cubierta en la parte superior de los recipientes de reacción y se sellaron bien para evitar una posible contaminación y pérdida de analito. Los recipientes de reacción se distribuyeron simétricamente en el bastidor para garantizar una irradiación de microondas uniforme dentro del sistema de microondas.

Durante la digestión ácida, la puerta del sistema de microondas estaba cerrada y la puerta no se podía abrir hasta el final del protocolo. Todo el proceso de digestión ácida se puede monitorear en la pantalla del dispositivo, mostrando el cambio de temperatura con el tiempo (Figura 7).

Una vez completada la digestión ácida y enfriadas las soluciones de las muestras digeridas a temperatura ambiente, se abrieron los recipientes de reacción en la campana extractora. Se abrieron lo más lentamente posible. Si la presión se libera demasiado rápido, incluso pequeñas gotas de la mezcla de reacción pueden escapar, lo que resulta en la pérdida de analito. Cuando se abrieron los recipientes de reacción, se liberó un gas amarillo o amarillo-anaranjado (Figura 8). La coloración de los humos se puede atribuir al NO2, que forma humos anaranjados a temperaturas más altas. El aumento de presión en los recipientes de reacción se debió a la oxidación de las muestras de alimentos conHNO3, lo que resultó en la formación de gases como CO2,H2O, NO, etc. Después de desgasificar los recipientes de reacción, una solución de color amarillo claro o incolora de la muestra digerida permaneció en el recipiente de reacción, lo que indica que se había logrado una digestión ácida total por MAWD. Esto se confirmó aún más por la ausencia de partículas visibles dejadas en la solución.

El paso final de la preparación de la muestra consistió en diluir las muestras digeridas con agua ultrapura para reducir la acidez residual (AR). Los valores altos de RA interfieren con las mediciones al aumentar la señal de fondo. La dilución también disminuye la concentración de iones metálicos en la muestra líquida26. Al transferir la solución de muestras digeridas a matraces aforados, los componentes del recipiente de reacción se enjuagaron a fondo con agua ultrapura para transferir completamente el analito. Un problema que se produce es que pequeñas gotas de agua ultrapura, que pueden contener el analito de interés, se adhieren a las paredes de los recipientes de reacción. Después de la dilución con agua ultrapura hasta la marca de 25 ml, todas las muestras se volvieron incoloras. Las soluciones finales de las muestras digeridas contenían sales solubles en agua, ya que los elementos metálicos presentes en la muestra reaccionaban conHNO3 para formar nitratos altamente solubles. Las técnicas de análisis elemental pueden determinar los iones metálicos que forman las sales solubles en agua. Al filtrar las soluciones diluidas, es importante desechar las primeras gotas para asegurarse de que se eliminen las partículas o contaminantes. Después de la filtración, las soluciones se sellaron herméticamente para evitar fugas y luego se almacenaron en el refrigerador.

La principal limitación del procedimiento de digestión ácida es el rendimiento de las muestras. El sistema MAWD solo puede digerir un número limitado de muestras a la vez. Además, cada paso de digestión y posterior preparación de la muestra puede tardar varias horas en completarse. Además, la limpieza de los recipientes de reacción también requiere mucho tiempo, pero es crucial para minimizar el riesgo de contaminación cruzada entre muestras.

Determinación de elementos múltiples con ICP-MS
Para cada elemento, se construyó una curva de calibración. Se obtuvieron graficando la intensidad en función de las concentraciones de analitos (Figura 9). Los rangos de concentración lineal para todos los elementos medidos estuvieron en el rango de 1,0 μg/L a 50,0 μg/L.

El LOD y el LOQ para cada elemento se calcularon utilizando la Ecuación 1 y la Ecuación 2, respectivamente. En ambas ecuaciones, sen blanco representa la desviación estándar de las diversas mediciones de calibración en blanco (10 repeticiones)38,39, mientras que b1 representa la pendiente de la curva de calibración.

Equation 1(1)

Equation 2(2)

Los LOD obtenidos fueron 0,5 ng/L, 2,8 ng/L, 2,8 ng/L y 3,2 ng/L para Mn, Cu, Fe y Zn, respectivamente. Los LOQ obtenidos fueron 1,6 ng/L, 9,2 ng/L, 9,5 ng/L y 10,8 ng/L para Mn, Cu, Fe y Zn, respectivamente.

Se realizaron seis digestiones repetidas de cada muestra. Se realizaron tres digestiones repetidas de cada muestra sin añadir la muestra con soluciones de patrón, y se realizaron tres digestiones repetidas con la adición de una solución de una cantidad conocida de analito patrón para probar la exactitud (prueba de recuperación de picos40) y la precisión de toda la metodología. Para determinar la precisión antes del procedimiento de digestión, se pipetearon 37,5 μL de solución estándar multielemento ICP de 100 mg/L en los recipientes de reacción que contenían la muestra, lo que dio como resultado un aumento de la concentración de 15,0 μg/L en muestras enriquecidas que se diluyeron en un factor de 10. Esto también correspondió a un aumento de 15,0 μg por gramo de muestra por cada ion metálico medido. La exactitud y la precisión se determinaron mediante Rec y desviación estándar relativa (RSD), respectivamente.

La precisión de un método analítico puede evaluarse mediante la prueba de recuperación de la espiga. Para ello, se añade a la muestra una solución de una cantidad conocida de patrón de analito, que luego se digiere en las mismas condiciones de reacción que las muestras que no están enriquecidas41. El Rec se calcula utilizando la Ecuación 3, donde γ i es la concentración medida de las muestras enriquecidas después de la digestión, mientras que γt representa la concentración determinada de la muestra sin espiga considerando el aumento de la solución añadida del patrón analicto. Los γi y γt son promedios de las tres réplicas. Se considera que el método analítico es preciso cuando Rec se encuentra en el rango de 80,00%-120,00%42.

Equation 3(3)

La precisión de un método analítico se evalúa con RSD. Describe la cercanía de concordancia entre los resultados independientes, que se obtuvieron a través de varias mediciones replicadas. La DSR se calcula utilizando la Ecuación 4, donde sm representa la desviación estándar de las mediciones repetidas para la determinación de la concentración, mientras que Equation 4 representa el valor promedio de las concentraciones determinadas. El método analítico se considera preciso si el valor de RSD es inferior al 20,00%43.

Equation 5(4)

Todas las muestras se diluyeron con agua ultrapura en un factor de 10 antes de las mediciones de ICP-MS (para el primer conjunto de mediciones). La dilución disminuyó la concentración de los componentes de la matriz introducidos en el analizador. Además, al diluir la muestra, la AR disminuye. Una AR alta podría comprometer la eficiencia de la ionización del plasma o provocar problemas de interferencia en la matriz. Si la concentración de los analitos después de la primera serie de mediciones es inferior al límite de detalle, el factor de dilución debe ser inferior a 10. La cuantificación de los iones metálicos se llevó a cabo mediante una curva de calibración. Los valores de los resultados calculados deben tener la misma precisión (el mismo número de cifras significativas) que la solución del patrón empleado para la calibración. El contenido de iones metálicos en la muestra se expresó como μg por gramo de peso (μg/g). Esto se logró multiplicando la concentración másica medida de la muestra analizada por el factor de dilución para obtener la concentración en la muestra digerida original. A continuación, esta concentración de masa se multiplicó por el volumen de la muestra digerida (25 ml) y luego se dividió por la masa pesada inicial de la muestra homogeneizada (la masa ponderada inicial es la masa de la muestra que se pesó en el recipiente de reacción para el MAWD). Todos los valores se notifican como un promedio de tres réplicas.

El contenido de los elementos que figuran a continuación se indica como Equation 4 ± sm. El contenido de Cu, Mn y Zn en la muestra de brócoli fue de 5,9 ± 0,5 μg/g, 32,5 ± 2,7 μg/g y 42,8 ± 0,2 μg/g, respectivamente. La concentración másica determinada de Fe en muestras de brócoli superó el límite superior del rango de concentración lineal de la curva de calibración (es decir, 50,0 μg/L). Por lo tanto, la solución de la muestra se diluyó con agua ultrapura en un factor de 2, y se realizó la medición ICP-MS de esta solución. Los resultados mostraron que el brócoli contenía 63,0 ± 1,9 μg/g de Fe.

Para el hongo, el contenido de Zn, Fe, Cu y Mn fue de 35,6 ± 1,4 μg/g, 30,4 ± 1,3 μg/g, 18,5 ± 1,0 μg/g y 5,4 ± 0,3 μg/g, respectivamente. Las salchichas contenían 42,2 ± 0,9 μg/g de Fe, 25,1 ± 2,6 μg/g de Zn y 1,0 ± 0,1 μg/g de Cu. La determinación multielemento con ICP-MS de la solución digerida, que se diluyó 10 veces, mostró que la concentración de Mn era inferior al límite inferior del rango de concentración lineal (es decir, 1,0 μg/L). Por lo tanto, la solución original de la muestra de salchicha se diluyó solo en un factor de 5 y se repitió la determinación de elementos múltiples con ICP-MS. Se determinó que el contenido de Mn en las muestras de salchichas era de 0,9 ± 0,3 μg/g. Los fideos contenían 5,4 ± 2,8 μg/g de Zn, 10,3 ± 1,2 μg/g de Fe, 1,6 ± 0,3 μg/g de Cu y 7,5 ± 0,2 μg/g de Mn.

El Rec para todos los analitos medidos en las cuatro muestras estuvo en el rango de 80,00%-120,00%, lo que indica la precisión del método analítico. Los cálculos mostraron que el método analítico era preciso, ya que los valores de RSD estaban por debajo del 20,00%, aparte de la RSD para Zn en muestras de fideos. Los resultados se presentan en la Tabla 2.

Figure 1
Figura 1: Mezclador de laboratorio utilizado para la homogeneización de muestras de alimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Comparación de muestras frescas, secas y homogeneizadas. (A-D) Muestras frescas de brócoli, champiñones, salchichas y fideos. (E-H) muestras secas de brócoli, champiñones, salchichas y fideos. (I-L) muestras homogeneizadas de brócoli, champiñones, salchichas y fideos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Pesaje de la muestra en una balanza analítica. Esto se realiza desde arriba abriendo la solapa superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Sistema de microondas. El sistema de microondas para la digestión ácida con pantalla táctil lateral para seleccionar las condiciones de reacción y controlar el proceso de digestión ácida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Componentes utilizados para la digestión ácida asistida por microondas. (A) Rejilla con 14 recipientes de reacción para la digestión ácida dentro de la cámara del horno microondas. (B) Los recipientes de reacción TFM-PTFE constan de 3 partes. Una vez que los recipientes están cerrados con tapas, ni la muestra ni los gases pueden escapar o entrar en los recipientes de reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: El interior de los recipientes de reacción cuando se abren en la campana extractora. (A) La coloración amarillo-anaranjada de los humos se debe al NO2 producido durante la digestión ácida. (B) La coloración amarilla de la solución de la muestra digerida después de que la mayoría de los gases hayan escapado del recipiente de reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Cambio de temperatura con el tiempo. Un gráfico que muestra el cambio de temperatura en función del tiempo durante la digestión ácida con MAWD. T2 representa la temperatura de la mezcla de reacción dentro de los recipientes de reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Apertura de los recipientes de reacción debajo de la campana extractora, donde se liberan los gases amarillo-anaranjados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Ejemplo de una curva de calibración para Mn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Instrumento ICP-MS utilizado para la determinación de elementos múltiples. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cuadro 1: Condiciones de funcionamiento del instrumento ICP-MS. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Valores de Rec y RSD de brócoli, champiñones, salchichas y fideos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Homogeneización
Para garantizar resultados reproducibles en la determinación elemental, es necesario homogeneizar las muestras antes de la digestión ácida debido a su estructura y composición complejas y poco homogéneas. La homogeneización tiene como objetivo eliminar la heterogeneidad constitucional y distributiva. La mezcla de la muestra minimiza la heterogeneidad distribucional al redistribuir uniformemente los componentes en toda la muestra. Del mismo modo, al reducir el tamaño de partícula a un tamaño uniforme, se reduce la heterogeneidad constitucional44. Las submuestras obtenidas del homogeneizado deben contener la misma proporción de componentes que la muestra original para ser representativas45.

La homogeneización se logra aplicando una fuerza para descomponer la muestra en partículas más pequeñas46. Las muestras pueden homogeneizarse cortando, picando, cortando, triturando, moliendo o mezclando. Sin embargo, el método apropiado debe considerar el grado de dureza, fragilidad, abrasividad, elasticidad, forma y capacidad de adherirse a los componentes del homogeneizador47.

La muestra puede triturarse manualmente con un mortero o molerse en una variedad de molinos (molino de cuchillas, molino de corte, molino de bolas, molino mezclador, etc.) y otras formas de homogeneizadores48. Los pequeños mezcladores de tamaño de laboratorio con cuchillas de cerámica o metal se utilizan comúnmente para la homogeneización, ya que reducen rápidamente el tamaño de partícula al desintegrar y mezclar simultáneamente la muestra. La molienda de muestras en partículas homogéneas más pequeñas aumenta el área de superficie específica, lo que acelera la digestión ácida por MAWD.

Sin embargo, se debe tener cuidado para evitar cualquier contaminación debido a la abrasión durante la molienda. Las muestras no deben homogeneizarse con cuchillas que contengan los mismos metales que los elementos que se determinarán después de la digestión ácida. En consecuencia, las cuchillas de cerámica se utilizan con más frecuencia en comparación con las cuchillas de metal. La homogeneización suele ser un factor importante que contribuye a la contaminación cruzada, generalmente debido a la limpieza inadecuada del inventario y los componentes de los instrumentos, lo que da lugar a errores sistemáticos. Después de su uso, cada componente del mezclador debe limpiarse a fondo y lavarse con agua ultrapura.

La molienda criogénica se utiliza cuando se homogeneizan muestras que son más difíciles de romper. La muestra se congela con nitrógeno líquido (que tiene -196 °C), lo que la hace quebradiza y más fácil de homogeneizar49,50.

Digestión ácida
Uno de los ácidos oxidantes más utilizados en los procedimientos de digestión ácida es el HNO3. Por lo general, se utiliza en combinación con una baja cantidad deH2O2, lo que aumenta el poder oxidante del ácido, mejorando así la eficiencia de la digestión20. Una mezcla de estas dos sustancias químicas se utiliza con frecuencia para la digestión de muestras orgánicas, incluidas las muestras de alimentos51. La digestión de muestras orgánicas en MAWD se lleva a cabo a presiones y temperaturas elevadas que superan el punto de ebullición (121 °C) del azeótropo HNO3 a presión atmosférica27. En MAWD, el punto de ebullición de HNO3 se eleva a 176 °C a medida que la presión aumenta a 5 atm27. La temperatura a la que se realiza la digestión ácida en MAWD no se puede lograr en sistemas abiertos porque el HNO3 se evaporaría, reduciendo la eficiencia de la digestión ácida.

Durante la digestión en recipientes cerrados por MAWD, el HNO3 reacciona con la muestra orgánica en condiciones de reacción adversas, formando productos gaseosos como CO2,H2O y NO (Ecuación 5)52,53. La ventaja de utilizar recipientes de reacción cerrados es el menor volumen y concentración del ácido necesario para la digestión, ya que elHNO3 se regenera constantemente. Este proceso de regeneración ocurre mientras elO2 está presente en el recipiente de reacción. La fuente primaria deO2 esH2O2, que es térmicamente inestable y se descompone enH2, O yO2 (Ecuación 6). En el recipiente de reacción, el NO reacciona con elO2 para formar el NO2 (Ecuación 7). El NO2 formado se disuelve en H2O, lo que da lugar a la formación de HNO3 y HNO2 (Ecuación 8). ElHNO2 producido posteriormente se degrada enH2O, NO2 y NO (Ecuación 9), completando el mecanismo de regeneración53,54. Los recién formados NO y NO2 reaccionan mediante los procesos mencionados anteriormente.

Equation 6(5)

Donde n representa el número de átomos de carbono.

Equation 7(6)

Equation 8(7)

Equation 9(8)

Equation 10(9)

Cuando las muestras orgánicas reaccionan con HNO3, los metales presentes en su estructura química formarán nitratos solubles en agua55. Dado que MAWD tiene como objetivo convertir sólidos en líquidos, se desea la formación de sales solubles en agua.

Para diferentes muestras, se pueden emplear diferentes combinaciones de ácidos debido a la complejidad de la composición de la muestra. Dado que las muestras orgánicas y especialmente inorgánicas menos fácilmente degradables no se pueden disolver únicamente con HNO3, también se utilizan otros ácidos como HCl, HF, HClO4 y H2SO4 21,56.

El HCl no oxidante a temperaturas elevadas se utiliza para la digestión de sales como carbonatos, fosfatos, óxidos, boratos, sulfuros y fluoruros28,55. Cuando el HCl se combina conHNO3 en una proporción molar de 3:1, se forma agua regia, lo que mejora las capacidades oxidantes en comparación con HCl yHNO3 solos debido a la formación de cloruro de nitrosilo (NOCl), Cl2 yH2O (Ecuación 10)57. El agua regia es capaz de disolver metales nobles como Au, Pt, Pd28.

Equation 11(10)

Para la digestión de silicatos, el HF se utiliza con frecuencia, ya que rompe fuertes enlaces entre Si y O. Cuando el HF interactúa con muestras de silicato (minerales, suelo), se forma ácido hexafluorosilícico (H2SiF6) (Ecuación 11)19,58. Sin embargo, a pesar de la capacidad del HF para digerir silicatos, presenta varios inconvenientes, como la formación de sales de fluoruro insolubles6, la formación de productos volátiles con metales pesados19 y el volátil SiF427. Además, el HF no se puede utilizar con cristalería y recipientes de reacción de cuarzo, ya que los disuelve18.

Equation 12(11)

Recipientes de reacción para la digestión ácida
Los recipientes de reacción utilizados en MAWD están diseñados para soportar altas temperaturas y presiones elevadas durante la digestión ácida. Estos recipientes de reacción también exhiben una buena permeabilidad a las microondas, lo que permite que las microondas pasen sin ser absorbidas20. Las microondas que pasan a través de los recipientes de reacción alcanzarán las moléculas de agua, que las absorberán eficazmente ya que son polares, calentando así la solución que contiene la muestra59. Solo la fase líquida en los recipientes de reacción absorbe la radiación de microondas, mientras que la fase gaseosa no lo hace, lo que resulta en un alto aumento de temperatura con un ligero aumento de la presión18.

Para minimizar la contaminación y la pérdida de analito, los recipientes de reacción están sellados herméticamente, lo que evita que cualquier material se escape o entre en los recipientes.

Los materiales más utilizados para los recipientes de reacción son el politetrafluoroetileno sintético (PTFE), el PTFE copolimerizado conocido como TFM, el alcano perfluoroalcoxi (PFA) y el cuarzo52,60. Estos materiales son químicamente inertes a la mayoría de los productos químicos utilizados en la digestión ácida, excepto los recipientes de cuarzo, en los que se disuelve el HF. El uso de un solo tipo de recipiente de reacción en cada experimento es crucial, ya que el uso de diferentes tipos de recipientes puede dar lugar a diferentes condiciones de reacción cuando se somete al calentamiento por microondas. A temperaturas de reacción más bajas, se utilizan recipientes de reacción de PTFE, PFA y TFM-PTFE, mientras que a temperaturas superiores a 300 °C, se recomiendan recipientes de cuarzo52. Esto se debe a que los polímeros se deterioran y se descomponen a temperaturas más altas.

Evaluación de la eficiencia de la digestión ácida
Hay varias formas de evaluar la eficiencia de la digestión ácida. El color de la solución se puede utilizar para evaluar si se ha producido una digestión completa o parcial de la muestra. Por lo general, una coloración incolora o ligeramente amarilla de la solución es un indicador de digestión exitosa, mientras que el color amarillo, naranja, verde o marrón más oscuro de la solución sugiere que el proceso de digestión no tuvo éxito, lo que significa que se produjo una digestión parcial61. En algunos casos, las partículas orgánicas o inorgánicas no digeridas pueden estar presentes en la mezcla de reacción después de la digestión, lo que requiere filtración antes de que la muestra pueda introducirse en el instrumento para la determinación elemental. La eliminación de las partículas no digeridas evita la obstrucción del sistema y la inestabilidad del plasma en el caso de ICP-OES e ICP-MS31.

La eficiencia de la digestión ácida también se puede evaluar experimentalmente a través de mediciones del contenido de carbono residual (RCC) y RA. RCC representa la cantidad de carbono orgánico que permanece en la solución y que no se convirtió en CO2 durante la digestión62. Se prefiere un valor más bajo de RCC para reducir las interferencias espectrales y no espectrales (por ejemplo, 40Ar12C+) en la determinación elemental63,64. Las mediciones de RCC se realizan mediante ICP-OES. El contenido de carbono se determina a una longitud de onda de emisión de 193,091 nm 65,66,67. La eficiencia de la digestión ácida está relacionada con el consumo de productos químicos. Cuanto más ácido se consuma, menores serán los valores de RCC25.

El ácido se consume continuamente durante la digestión a medida que reacciona con la muestra. En la mayoría de los casos, una pequeña cantidad de ácido permanece sin reaccionar. La cantidad de AR se puede determinar mediante titulación con NaOH10 o KOH 25,54. Se prefieren valores más bajos de AR, ya que la mayor concentración de ácido en la solución final digerida puede aumentar la señal de fondo en técnicas analíticas como ICP-MS25 e ICP-OES68. Los valores más altos de AR también pueden indicar el uso de una concentración inicial de ácido más baja para la digestión69.

Determinación de elementos múltiples con ICP-MS
La ICP-MS consta de varios componentes. La bomba peristáltica bombea la solución de muestra desde el muestreador automático hasta el nebulizador. A continuación, el nebulizador convierte la muestra líquida en aerosol mezclándola con gas Ar. Posteriormente, la cámara de pulverización filtra las gotas de aerosol, lo que permite la introducción de la fracción más fina de gotas de aerosol en el plasma70. El plasma Ar es generado y mantenido dentro de la antorcha por la bobina de radiofrecuencia, lo que resulta en temperaturas de aproximadamente 10.000 K70. El aerosol se atomiza e ioniza en el plasma Ar. Luego, los iones continúan a través de la interfaz hacia la región de alto vacío. La óptica iónica guía a los iones a través de la celda de colisión, donde la corriente de gas He choca con los iones monoatómicos de los analitos y los iones poliatómicos. Dado que los iones poliatómicos son más grandes que los analitos de la misma masa nominal, chocan con mayor frecuencia con He, pierden más energía cinética y, por lo tanto, se eliminan de manera eficiente71. En el siguiente paso, los iones llegan al analizador de masas (en este caso, cuadrupolo). En el analizador de masas, los iones se separan en función de su relación masa-carga (m/z)72. Tras la separación por m/z, los iones llegan al detector (en este caso, un multiplicador de electrones) (Figura 10).

Pasos críticos y limitaciones
Hay varios pasos críticos y algunas limitaciones dentro del protocolo. Asegurarse de que las muestras estén completamente secas antes de continuar con el proceso y evitar la contaminación son pasos cruciales en la homogeneización. Para evitar la contaminación, se debe hacer un esfuerzo para mantener limpia toda la cristalería durante todo el proceso73, ya que puede afectar la precisión del análisis. En caso de contaminación, la muestra debe desecharse y repetirse el proceso de preparación, lo que puede llevar mucho tiempo. Al aplicar este protocolo a otras muestras no descritas en este protocolo, es posible que no se logre una digestión completa, ya que algunas muestras pueden requerir temperaturas más altas y diferentes productos químicos para disolver completamente todos los metales presentes en la muestra. Para la digestión ácida, se necesitan productos químicos de alta pureza, que pueden ser costosos. El uso de productos químicos de alta pureza ayuda a minimizar las interferencias, lo que garantiza una mayor fiabilidad, exactitud y precisión de las mediciones realizadas por ICP-MS. El proceso de preparación de muestras requiere mucho tiempo y tiene un bajo rendimiento de muestras, ya que la preparación puede durar varios días (secado, homogeneización, digestión ácida), lo que limita el número de muestras que se pueden preparar en un día.

Al realizar la determinación de elementos múltiples con ICP-MS, se pueden encontrar interferencias espectrales (poliatómicas e isobáricas). Las interferencias poliatómicas, que generalmente ocurren en el plasma, combinan al menos dos isótopos, mientras que las interferencias isobáricas representan isótopos de otros elementos con el mismo m/z que los analitos medidos74. Es importante eliminar estas interferencias (por ejemplo, con una celda de colisión). Además de las interferencias espectrales, los resultados también se ven afectados por interferencias no espectroscópicas que consisten en la introducción de la muestra en el instrumento ICP-MS, la distribución del tamaño de las gotas de aerosol, la estabilidad del plasma, el transporte de iones a través de la interfaz, etc.75.

El protocolo descrito en este documento tiene potencial para otras aplicaciones además de la de las muestras de alimentos. Con ligeras modificaciones en los pasos de homogeneización y digestión ácida, podría adaptarse para la preparación de muestras inorgánicas, suelo76, residuos electrónicos28, etc. Los ajustes pueden implicar el uso de diferentes productos químicos, la variación de sus volúmenes y la alteración de la temperatura de digestión para adaptarse a diferentes tipos de muestras. Además, a medida que la tecnología y las metodologías evolucionan, se podrían incorporar más mejoras y automatización en el protocolo, aumentando su eficiencia y reduciendo el tiempo total de preparación de la muestra.

En resumen, este protocolo demuestra la homogeneización de muestras de alimentos en un mezclador de laboratorio, la digestión ácida húmeda asistida por microondas utilizando una mezcla de 68% en peso deHNO3 y 30% en peso deH2O2a una temperatura y presión elevadas, y la determinación elemental con ICP-MS. El protocolo se puede utilizar para capacitar al personal en la preparación de muestras para la determinación elemental, ya que el protocolo proporciona instrucciones paso a paso y explica la teoría detrás de la homogeneización, la digestión ácida y la determinación elemental.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen el apoyo financiero de la Agencia Eslovena de Investigación (subvención Nº P2-0414, P2-0118, J1-2470, NK-0001 y J1-4416).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ar gas Messer 7440-37-1 Ar 5.0 gas (purity 99.999%).
AS-10 Autosampler system Shimadzu Autosampler connected to the ICP-MS, containing 68 ports for samples.
Automatic pipettes Sartorius 200 µL, 1 mL, and 5 mL automatic pipettes.
Balance XSE104 Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA Analytical balance scale with a maximum weighing mass of 120 g.
Ceramic knife Ceramic knife used for cutting fresh food samples.
Dessicator Glass desiccator with lumps of silica gel.
ETHOS LEAN Milestone, Sorisole, Italy Microwave system for wet acid digestion in closed 100 mL vessels made of TFM-PTFE.
Fume hood Laboratory fume hood with adjustable air flow.
Glass beakers RASOTHERM CarlRoth GmbH + Co.KG 50 mL, 250 mL glass beakers
Glass funnels Small glass funnels fitting into the neck of volumetric flasks.
He gas Messer 7440-59-7 He 5.0 gas (purity 99.999%).
Hydrogen peroxide ThermoFisher Scientific 7722-84-1 Hxdrogen peroxide 100 volumes 30 wt.% solution. Laboratory reagent grade.
ICP multi-element standard solution VIII Supelco 109492 100 mg/L ICP multi-element standard solution containing 24 elements (Al, B, Ba, Be, Bi, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Ga, K, Li, Mg, Mn, Na, Ni, Pb, Se, Sr, Te, Tl, Zn) in 2 % dilute nitric acid.
ICPMS 2030 Shimadzu Inductively coupled plasma mass spectrometry system for multi-element analysis of digested samples.
ICP-MS Tuning Solution A CarlRoth GmbH + Co.KG 250 mL tuning solution containing 6 elements (Be, Bi, Ce, Co, In, Mn) in 1 % nitric acid.
KIMTECH Purple Nitrile gloves Kimberly-Clark GmbH Disposable Purple Nitrile gloves (S, M or L).
Laboratory coat Any available supplier /
Mixer B-400 BÜCHI Labortechnik AG, Flawil, Switzerland Laboratory mixer with ceramic blades.
Nitric acid ThermoFisher Scientific 7697-37-2 Nitric acid, trace analysis grade, 68 wt%, density 1.42, Primar Plus, For Trace Metal Analysis.
Plastic centrifuge tubes Isolab 50 mL plastic centrifuge tubes with screw caps, single use.
Plastic syringes Injekt B. Braun 2 pice, single use 20 mL syringes.
Plastic tubes for autosampler Shimadzu 046-00147-04 Plastic tubes for autosampler, 15 mL capacity, 16 mm diameter, 100 mm length.
Plastic waste containers Plastic containers for the removal of chemicals after the cleaning procedure of reaction vessels.
Protective googles /
Samples (broccoli, sausage, noodles, zucchini, mushrooms) Fresh samples, which were dried to a constant weight and homogenized during the procedure. The samples were purchased from a local shop.
Spatula Plastic spatula.
Sterilizator Instrumentaria ST 01/02 Instrumentaria Dryer with adjustable temperature.
Syringe filters CHROMAFIL Xtra 729212 Syringe filters with polypropylene housing and polyamide hydrophilic membrane. Membrane diameter 25 mm, membrane pore size 0.2 µm.
Ultrapure water ELGA Labwater, Veolia Water Technologies. Ultrapure water with a resistivity of 18.2 MΩcm, obtained with laboratory water purification system.
Volumetric flasks 25 mL glass volumetric flasks.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Rantaša, M., Majer, D., Finšgar, M. Preparation of Food Samples Using Homogenization and Microwave-Assisted Wet Acid Digestion for Multi-Element Determination with ICP-MS. J. Vis. Exp. (202), e65624, doi:10.3791/65624 (2023).

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