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Chemistry

Aufbereitung von Lebensmittelproben mittels Homogenisierung und mikrowellenunterstütztem Nasssäureaufschluss zur Multielementbestimmung mit ICP-MS

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/65624
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Chemistry and Chemical Engineering, University of Maribor

Summary

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Probenhomogenisierung mit einem Labormischer, den Säureaufschluss von Lebensmittelproben mit einem Gemisch aus 68 Gew.-% HNO3 und 30 Gew.-% H2O2 mittels mikrowellengestütztem Nasssäureaufschluss und die Multielementbestimmung mit induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie.

Abstract

Die Probenvorbereitung ist für die Elementbestimmung von entscheidender Bedeutung, und es stehen verschiedene Techniken zur Verfügung, von denen eine eine Homogenisierung mit anschließendem Säureaufschluss beinhaltet. Besondere Sorgfalt ist bei der Probenhandhabung in der Vorbereitungsphase erforderlich, um potenzielle Kontaminationen und Analytverluste zu eliminieren oder zu minimieren. Die Homogenisierung ist ein Prozess, der gleichzeitig die Partikelgröße reduziert und die Probenbestandteile gleichmäßig verteilt. Nach der Homogenisierung wird die Probe einem Säureaufschluss unterzogen, bei dem sie mit Säuren und Hilfschemikalien bei erhöhten Temperaturen aufgeschlossen wird, wodurch feste Proben in einen flüssigen Zustand überführt werden. Dabei reagieren Metalle in der Originalprobe mit Säuren zu wasserlöslichen Salzen. Proben, die durch Säureaufschluss hergestellt wurden, eignen sich für die Elementaranalyse mit Techniken wie Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma, optischer Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma, Atomabsorptionsspektroskopie, elektrochemischen Methoden und anderen Analysetechniken. Diese Arbeit beschreibt die Vorbereitung von Lebensmittelproben für die Multielementbestimmung mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma. Das schrittweise Verfahren umfasst den Homogenisierungsprozess mit einem Labormischer mit Keramikschaufeln, gefolgt von einem Säureaufschluss in geschlossenen Gefäßen mit mikrowellenunterstütztem Nasssäureaufschluss. Als Hilfsreagenz dient eine Mischung aus 5,0 ml 68 Gew.-% HNO3 und 1,0 ml 30 Gew.-% H2O2. In diesem Leitfaden werden die Prozesse in beiden Phasen erläutert.

Introduction

Die Elementaranalyse ist ein analytisches Verfahren zur Bestimmung der elementaren Zusammensetzung verschiedener Proben. Es kann verwendet werden, um die Aufnahme von Metallen in den menschlichen Körper (insbesondere Schwermetalle1) zu kontrollieren, da ihre hohen Konzentrationen unerwünschte Gesundheitsprobleme verursachen können. Schwermetalle sind auch eine der wichtigsten Umweltschadstoffe, daher ist eine Kontrolle ihres Vorhandenseins in der Umwelt notwendig2. Darüber hinaus kann die Elementaranalyse zur Bestimmung der geografischen Herkunft von Lebensmitteln3 und zur Kontrolle der Qualität von Nahrungs- und Wasserressourcen4 eingesetzt werden. Darüber hinaus wird es zur Bestimmung von Mikro- und Makronährstoffen in Böden5 und zur Gewinnung von Erkenntnissen über geologische Prozesse im Laufe der Geschichte durch die Untersuchung der chemischen Zusammensetzung von Mineralien und Sedimenten6 eingesetzt. Es wurden auch Studien durchgeführt, um das Vorhandensein seltener Metalle in Elektro- und Elektronikschrott für die weitere Metallregenerationzu bestimmen 7, den Erfolg medikamentöser Behandlungenzu bewerten 8 und die elementare Zusammensetzung von Metallimplantaten zu überprüfen9.

Die Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) und die optische Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES) sind häufig verwendete Techniken für die Elementaranalyse verschiedener Proben10. Sie ermöglichen die gleichzeitige Bestimmung mehrerer Elemente mit Nachweisgrenzen (LOD) und Bestimmungsgrenzen (LOQ) von bis zu ng/L. Im Allgemeinen hat ICP-MS niedrigere LOD-Werte11 und einen breiteren linearen Konzentrationsbereich im Vergleich zu ICP-OES12. Andere Techniken zur Bestimmung der Elementzusammensetzung sind die mikrowelleninduzierte optische Plasmaemissionsspektrometrie13 und mehrere Varianten der Atomabsorptionsspektroskopie (AAS), einschließlich der Flammenatomabsorptionsspektroskopie, der elektrothermischen Atomabsorptionsspektroskopie2, der Kaltdampf-Atomabsorptionsspektroskopie und der Atomabsorptionsspektroskopie der Hydriderzeugung14. Darüber hinaus ist die Elementbestimmung mit niedriger LOD und LOQ mit verschiedenen elektroanalytischen Methoden möglich, insbesondere mit der anodischen Stripping-Voltammetrie15,16. Natürlich gibt es andere Methoden, um die elementare Zusammensetzung von Proben zu bestimmen, aber sie werden nicht so häufig eingesetzt wie die oben genannten Methoden.

Die direkte Elementbestimmung von festen Proben ist mit laserinduzierter Breakdown-Spektroskopie und Röntgenfluoreszenzmöglich 17. Für die Elementbestimmung mit ICP-MS, ICP-OES und AAS ist es jedoch notwendig, feste Proben in einen flüssigen Zustand zu überführen. Zu diesem Zweck wird der Säureaufschluss mit Säuren und Hilfsreagenzien (in den meisten Fällen H2O2) durchgeführt. Der Säureaufschluss wird bei erhöhter Temperatur und erhöhtem Druck durchgeführt, wobei der organische Teil der Probe in gasförmige Produkte umgewandelt und die Metallelemente in wasserlösliche Salze umgewandelt werden, wodurch sie in der Lösung18 gelöst werden.

Es gibt zwei Haupttypen des Säureaufschlusses, den Aufschluss mit offenen Gefäßen und den Aufschluss mit geschlossenen Gefäßen. Der Aufschluss mit offenem Gefäß ist kostengünstig14 , hat aber Einschränkungen, wie z. B. die maximale Aufschlusstemperatur, die mit der Siedetemperatur von Säuren bei atmosphärischem Druck zusammenfällt. Die Probe kann auf Heizplatten, Heizblöcken, Wasserbädern, Sandbädern2 und Mikrowellen19 erhitzt werden. Durch Erhitzen der Probe auf diese Weise geht ein Großteil der erzeugten Wärme an die Umgebung20 verloren, wodurch sich die Aufschlusszeit14 verlängert. Weitere Nachteile des Aufschlusses in offenen Gefäßen sind ein höherer Chemikalienverbrauch, die größere Möglichkeit einer Kontamination aus der Umgebung und ein möglicher Verlust von Analyten aufgrund der Bildung flüchtiger Komponenten und deren Verdunstung aus dem Reaktionsgemisch21.

Geschlossene Gefäßsysteme sind für den Aufschluss organischer und anorganischer Proben bequemer als Systeme mit offenen Gefäßen. Systeme mit geschlossenen Gefäßen nutzen eine Vielzahl von Energiequellen zum Erhitzen der Proben, wie z. B. Konduktionsheizung und Mikrowellen22. Aufschlussverfahren, bei denen Mikrowellen verwendet werden, umfassen mikrowelleninduzierte Verbrennung23, Einzelreaktionskammersysteme24 und den häufig verwendeten mikrowellenunterstützten Nasssäureaufschluss (MAWD)25,26. MAWD ermöglicht den Aufschluss bei höheren Betriebstemperaturen zwischen 220 °C und 260 °C und maximalen Drücken von bis zu 200 bar, abhängig von den Arbeitsbedingungen des Geräts27.

Die Effizienz und die Rate der MAWD hängen von mehreren Faktoren ab, darunter die chemische Zusammensetzung der Proben, die maximale Temperatur, der Temperaturgradient, der Druck im Reaktionsgefäß, die Menge der zugesetzten Säuren und die Konzentration der verwendeten Säuren28. Bei MAWD kann aufgrund der erhöhten Reaktionsbedingungen im Vergleich zu länger anhaltenden Aufschlüssen in offenen Gefäßsystemen ein vollständiger Säureaufschluss in wenigen Minuten erreicht werden. In MAWD sind geringere Mengen und Konzentrationen von Säuren erforderlich, was den aktuellen Richtlinien für grüne Chemieentspricht 29. Bei MAWD wird im Vergleich zum Aufschluss mit offenen Gefäßen eine geringere Probenmenge benötigt, um einen Säureaufschluss durchzuführen, normalerweise reichen bis zu 500 mg Probe aus 30,31,32. Größere Probenmengen können verdaut werden, erfordern jedoch eine größere Menge an Chemikalien.

Da das Gerät für MAWD die Reaktionsbedingungen automatisch steuert und die Person während des Erhitzens nicht in direkten Kontakt mit den Chemikalien kommt, ist MAWD sicherer zu bedienen als Aufschlüsse mit offenen Gefäßen. Die Person sollte jedoch immer vorsichtig vorgehen, wenn sie Chemikalien in die Reaktionsgefäße gibt, um zu verhindern, dass sie mit dem Körper in Kontakt kommen und Schaden anrichten. Reaktionsgefäße müssen auch langsam geöffnet werden, da sich der Druck in ihnen während der Säureverdauung aufbaut.

Obwohl der Säureaufschluss eine nützliche Technik zur Vorbereitung von Proben für die Elementbestimmung ist, sollte sich die Person, die ihn durchführt, seiner möglichen Grenzen bewusst sein. Der Säureaufschluss ist möglicherweise nicht für alle Proben geeignet, insbesondere für solche mit komplexen Matrices und solche, die hochreaktiv sind oder explosiv reagieren könnten. Daher sollte die Probenzusammensetzung immer bewertet werden, um die geeigneten Chemikalien und Reaktionsbedingungen für einen vollständigen Aufschluss auszuwählen, der alle gewünschten Elemente in der Lösung auflöst. Weitere Bedenken, die der Anwender berücksichtigen und angehen muss, sind Verunreinigungen und der Verlust von Analyten bei jedem Schritt der Probenvorbereitung. Der Säureaufschluss muss immer nach bestimmten Regeln oder unter Verwendung von Protokollen durchgeführt werden.

Das unten beschriebene Protokoll enthält Anweisungen für die Homogenisierung von Lebensmittelproben in einem Labormischer, ein Verfahren zum Reinigen der Komponenten des Mischers, zum ordnungsgemäßen Wiegen der Probe, zum Hinzufügen von Chemikalien, zum Durchführen eines Säureaufschlusses durch MAWD, zum Reinigen der Reaktionsgefäße nach Abschluss des Aufschlusses, zum Vorbereiten der Proben für die Elementbestimmung und zur Durchführung einer quantitativen Multielementbestimmung mit ICP-MS. Wenn man die folgenden Anweisungen befolgt, sollte man in der Lage sein, eine Probe vorzubereiten, die für die Elementbestimmung geeignet ist, und die Messungen von aufgeschlossenen Proben durchzuführen.

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Protocol

1. Homogenisierung der Probe

  1. Schneiden Sie die Lebensmittelproben (Brokkoli, Pilze, Würstchen und Nudeln) mit einem sauberen Keramikmesser manuell in kleinere Stücke, um den Trocknungsprozess zu beschleunigen. Bereiten Sie genügend Proben für mindestens 6 Wiederholungen des Säureaufschlusses vor (stellen Sie sicher, dass die Mindestmasse der getrockneten Proben 1500 mg beträgt).
    Anmerkungen: Durch Vergrößern der Oberfläche der Probe wird ein größerer Teil der Probe der erwärmten Umgebungsluft ausgesetzt, wodurch die Verdunstungsrate des Wassers erhöht wird.
  2. Die Probe wird in ein 250-ml-Glasbecherglas gegeben und bei 105 °C mit einem Trockner auf ein konstantes Gewicht getrocknet.
  3. Nehmen Sie das Glasbecherglas mit der Probe aus dem Trockner und setzen Sie es in den Exsikkator ein.
  4. Lassen Sie die Probe auf Raumtemperatur abkühlen.
    HINWEIS: Die Proben müssen bei einer konstanten Temperatur gewogen werden, um sicherzustellen, dass das Gewicht die Masse genau widerspiegelt. Temperaturschwankungen können das Volumen und die Dichte der gemessenen Proben beeinflussen.
  5. Öffnen Sie den Exsikkator und geben Sie den Glasbecher mit der Probe auf die Analysenwaage. Messen Sie das Gewicht des Glasbechers mit der Probe.
  6. Nachdem das Wiegen abgeschlossen ist, geben Sie die Probe wieder in den Trockner.
    HINWEIS: Wenn die Probe während des Trocknens stark geschrumpft ist, kann man sie mit einem Kunststoffspatel in ein kleineres Glasbecherglas umfüllen, um das Wiegen bequemer zu gestalten.
  7. Wiederholen Sie den Vorgang wie in den Schritten 1.3-1.6 beschrieben, bis ein konstantes Gewicht der Probe erreicht ist.
  8. Die getrocknete heterogene Probe wird in den Mischbecher gegeben (siehe Materialtabelle) und darauf geachtet, dass sie das maximale Volumen des Mischbechers nicht überschreitet.
  9. Setzen Sie den Mischbecher in den Mischer ein, und schließen Sie die Schutztür (Abbildung 1).
  10. Drücken Sie die Starttaste , um die Klingen zum Mahlen und Mischen der Probe zu aktivieren.
  11. Führen Sie das Mahlen durch, bis sich die Probe in ein feines Pulver oder eine homogene Paste verwandelt. Um ein solches Produkt zu erhalten, wiederholen Sie den Schleifvorgang mehrmals.
  12. Wenn die Probe homogenisiert ist, schalten Sie den Mischer aus, öffnen Sie die Schutztür und entfernen Sie den Mischbecher.
  13. Nehmen Sie die homogenisierte Probe aus dem Mischbecher und geben Sie sie mit einem sauberen Kunststoffspatel in ein sauberes 50-ml-Glasbecherglas (Abbildung 2).
    HINWEIS: Wenn die Probe zu hart ist und möglicherweise die Komponenten des Mischers, wie z. B. die Klingen und den Mischbecher, beschädigen könnte, kann sie auf andere Weise homogenisiert werden, z. B. durch Zerkleinern in Mörsern. Mischer sind in der Regel nicht für die Homogenisierung von harten Materialien, gefrorenen Proben oder leicht entflammbaren Proben geeignet, die die Komponenten des Mischers beschädigen könnten. Von der Verwendung organischer Lösungsmittel im Mischer wird abgeraten.
    ACHTUNG: Verwenden Sie Sicherheitsausrüstung und stellen Sie sicher, dass die Tür des Mischers ausreichend geschlossen ist, da sich die Schaufeln des Mischers mit hoher Geschwindigkeit drehen.

2. Reinigung des Mischers

  1. Reinstwasser (siehe Materialtabelle) an die Markierung des leeren Mischbechers geben.
  2. Setzen Sie den Mischbecher in den Mischer ein und führen Sie den Standardmischvorgang durch.
  3. Nehmen Sie den Becher aus dem Mischer und gießen Sie das Abwasser aus. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf mehrmals mit Reinstwasser, bis das Wasser auch nach dem Mischen sauber bleibt.
  4. Entfernen Sie die verschmutzten Schaufeln und den Druckmittler aus dem Mischer und reinigen Sie sie gründlich mit Reinstwasser.
    HINWEIS: Verwenden Sie neutrale Reinigungsmittel, um die Reinigungseffizienz zu verbessern, insbesondere bei Proben mit hohem Fettgehalt, da Fett leicht an der Oberfläche des Laborinventars haftet.
    ACHTUNG: Tragen Sie beim Entfernen und Reinigen der Klingen geeignete Schutzausrüstung wie Handschuhe, um das Risiko möglicher Verletzungen durch ihre scharfen Kanten zu verringern.
  5. Trocknen Sie die gereinigten Komponenten im Trockner bei 105 °C und setzen Sie sie wieder in den Mischer ein.
    Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Komponenten des Mischers vollständig trocken sind, bevor Sie sie wieder in den Mischer einbauen, um eine Verschleppung des Wassers in die folgende Probe zu verhindern.

3. Wiegen der Probe

  1. Entfernen Sie den Deckel aus dem 100-ml-Trifluormethoxyxyl-Polytetrafluorethylen-TFM-PTFE-Reaktionsgefäß33.
  2. Stellen Sie das offene Reaktionsgefäß auf die Analysenwaage und stellen Sie sicher, dass die Waage vor jeder Messung nivelliert und auf Null gestellt ist (Abbildung 3).
    HINWEIS: Das Wiegen muss bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Vermeiden Sie Bereiche, in denen starke Temperaturschwankungen und Luftströmungen das gemessene Gewicht beeinträchtigen könnten. Stellen Sie sicher, dass der Wägebereich sauber und frei von Verunreinigungen ist.
  3. Die homogenisierte Probe wird mit einem Kunststoffspatel in das Reaktionsgefäß überführt und 250 mg der Probe gewogen. Wiegen Sie die Probe nicht unter der Mindestgewichtsgrenze der Analysenwaage.
  4. Sobald das Wiegen abgeschlossen ist, setzen Sie den Deckel auf das Reaktionsgefäß, um die Probe vor Verunreinigung zu schützen.
    HINWEIS: Das Überschreiten der Gewichtsgrenze des Aufschlussverfahrens kann zu einer unvollständigen Verdauung führen. Gehen Sie vorsichtig mit der Probe und den Reaktionsgefäßen um, um eine externe Kontamination zu vermeiden.

4. Säurezugabe

  1. Gießen Sie ca. 40,0 ml 68 Gew.-% HNO3 und 5,0 ml 30 Gew.-% H2O2 in separate 50-ml-Glasbecher.
    HINWEIS: Chemikalien müssen von hoher Reinheit mit Spurenmetallverunreinigungen von weniger als 1,0 μg/L (ppb) sein, idealerweise im ng/L (ppt)-Bereich. Spurenmetallverunreinigungen beeinträchtigen die Genauigkeit und Wiederholbarkeit der Elementbestimmung.
  2. Legen Sie die Reaktionsgefäße in einen Abzug, öffnen Sie die Deckel und fügen Sie die unten genannten Volumina von 68 Gew.-% HNO3 und 30 Gew.-% H2O2 mit automatischen 1-ml- oder 5-ml-Pipetten gemäß den folgenden Spezifikationen hinzu:
    1. Brokkoli, Pilze, Würstchen und Nudeln; für 250 mg Probe 5,0 ml 68 Gew.-% HNO3 und 1,0 ml 30 Gew.-% H2O2 hinzufügen. Bereiten Sie drei Replikate für jede Probe vor.
    2. Um die Genauigkeit der Methode (in Bezug auf die Wiederfindung, Rec) zu bestimmen, verwenden Sie das in Schritt 4.2.1 beschriebene Verfahren und geben Sie 37,5 μl 100 mg/l ICP-Multielement-Standardlösung (siehe Materialtabelle) mit einer automatischen 200-μl-Pipette in die Reaktionsgefäße. Bereiten Sie für jede Probe drei Wiederholungen vor.
      HINWEIS: Das Volumen von 37,5 μl wurde gewählt, da es einer Erhöhung von 15,0 μg/l für die dotierten Lösungen von Proben im Vergleich zur Konzentration in den nicht dotierten Lösungen von Proben entspricht. Darüber hinaus entspricht der Konzentrationsanstieg für die Spike-Lösung von Proben der Endkonzentration, die für jeden gemessenen Analyten noch im linearen Konzentrationsbereich liegt.
    3. Eine Leerprobe wird mit dem gleichen Volumen von 68 Gew.-% HNO3 und 30 Gew.-% H2O2 hergestellt, das in Schritt 4.2.1 für den Aufschluss von Lebensmittelproben verwendet wird. Geben Sie bei einem Probenblindwert die Probe nicht in die Reaktionsgefäße.
      ACHTUNG: HNO3 , das zur Verdauung verwendet wird, ist ätzend und erzeugt Dämpfe. Aus diesem Grund muss die Säurezugabe in einem Abzug erfolgen. Es muss eine Standard-Laborschutzausrüstung verwendet werden (Handschuhe, Schutzbrille und Laborkittel). Bei Kontakt mit Säure sollte der betroffene Bereich sofort unter dem kalten Wasserstrahl abgespült und ärztliche Hilfe in Anspruch genommen werden.
  3. Den Deckel auf die Reaktionsgefäße setzen und die Proben mit den zugegebenen 68 Gew.-% HNO3 und 30 Gew.-% H2O2 2 Minuten reagieren lassen.
  4. Schrauben Sie die Gewindeabdeckung auf das Gefäß und ziehen Sie die Deckel fest.
  5. Schütteln Sie das Reaktionsgefäß mit leichten Handbewegungen, um die Proben vollständig in Chemikalien einzuarbeiten.
    HINWEIS: Lassen Sie die Proben nicht an den Wänden oder Deckeln der Reaktionsgefäße, da die Möglichkeit besteht, dass sie nicht vollständig verdaut werden.

5. Mikrowellengestützter Nasssäureaufschluss

  1. Schalten Sie das Mikrowellensystem (siehe Materialtabelle) für den Säureaufschluss ein, indem Sie die Starttaste drücken (Abbildung 4).
  2. Öffnen Sie die Mikrowellentür und entfernen Sie den Rost.
  3. Verteilen Sie die geschlossenen Reaktionsgefäße symmetrisch im Gestell, um eine gleichmäßige Bestrahlung der Proben durch Mikrowellen zu gewährleisten.
  4. Setzen Sie das Gestell in die Mikrowellenkammer ein und montieren Sie es auf einer Halterung (Abbildung 5).
  5. Schließen Sie die Tür des Mikrowellenherds.
  6. Stellen Sie mit einem stiftförmigen Werkzeug ein geeignetes Verdauungsprogramm auf dem Touchscreen des Mikrowellenherds ein. Wählen Sie einen geeigneten Temperaturgradienten, die Endtemperatur und die Anzahl der zu verdauenden Proben. Das empfohlene Verdauungsprogramm für verschiedene Lebensmittelproben ist unten aufgeführt:
    1. Brokkoli, Champignons, Würstchen und Nudeln: 10 min Erhöhung auf 160 °C, 10 min Erhöhung auf 200 °C, 15 min bei 200 °C, maximale Leistung 900 W.
  7. Starten Sie das Aufschlussprogramm und überwachen Sie die Änderung der Reaktionsbedingungen auf dem Bildschirm. Stoppen Sie den Verdauungsprozess, wenn die Temperatur nicht gemäß dem vorgeschriebenen Programm ansteigt.
    Anmerkungen: Während der Verdauung können plötzliche Temperaturspitzen auf dem Bildschirm des Mikrowellenherds zu sehen sein. Sie entstehen, wenn die Proben exotherm mit den Chemikalien reagieren. Das Mikrowellensystem reguliert die Temperatur automatisch, indem es die Ausgangsleistung anpasst.
  8. Warten Sie, bis der mikrowellenunterstützte Aufschluss abgeschlossen ist und die Temperatur der Probe sinkt.
  9. Öffnen Sie die Mikrowellentür und entfernen Sie den Rost aus der Mikrowellenkammer. Schließen Sie die Tür und schalten Sie das Gerät aus.
  10. Nehmen Sie die Reaktionsgefäße aus dem Gestell und warten Sie, bis sie auf Raumtemperatur abgekühlt sind.
  11. Öffnen Sie die Deckelabdeckungen langsam manuell, um die beim Säureaufschluss entstehenden Gase freizusetzen. Drehen Sie die Reaktionsgefäße in Richtung Abzug (Abbildung 6).
  12. Entfernen Sie den Deckel vollständig und spülen Sie den Deckel und die Wände des Reaktionsgefäßes mit etwas Reinstwasser ab.
  13. Der Inhalt des Reaktionsgefäßes wird quantitativ durch einen Glastrichter in einen sauberen 25-ml-Glasmesskolben überführt, indem der Deckel und das Reaktionsgefäß wiederholt mit Reinstwasser gespült werden.
  14. Die Probe wird mit Reinstwasser bis zur Markierung des Messkolbens verdünnt. Der Messkolben wird mit einem Stopfen verschlossen und der Inhalt des Messkolbens wird gemischt.
    HINWEIS: Eine weitere Verdünnung der aufgeschlossenen Proben mit Reinstwasser sollte durchgeführt werden, da sie weniger als 5 % (V/V) Restsäure34 und weniger als 2 g/l gelöste Elemente enthalten sollten, die auch als gelöste Feststoffe35 bezeichnet werden.
  15. Nehmen Sie eine 20-ml-Kunststoffspritze und verbinden Sie sie mit einem Polyamid-Spritzenvorsatzfilter (25 mm Durchmesser, 0,20 μm Porengröße). Füllen Sie die Kunststoffspritze mit der verdünnten Probe und filtern Sie ihren Inhalt durch Ausüben von Druck in ein 50-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen. Verwenden Sie für jede Probe eine neue Kunststoffspritze und einen neuen Spritzenfilter, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
    HINWEIS: Die Proben müssen gefiltert werden, um unlösliche Materialien oder feste Partikel zu entfernen, die nach der MAWD unverdaut bleiben können. Diese Partikel können die Elementbestimmungsmessungen stören, indem sie die Gerätekomponenten verstopfen. Achten Sie beim Filtern der Proben darauf, die ersten Tropfen zu verwerfen. Verwenden Sie hydrophile Filter (aus Polyamid) für wässrige Lösungen. Hydrophobe Filter (PTFE) sind nicht für die Filtration von wässrigen Lösungen geeignet, da sie einen höheren angelegten Druck erfordern, der zu einem Membranbruch führen kann36.
  16. Verschließen Sie das 50-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen mit einem Schraubverschluss und stellen Sie die Probe bis zu den Messungen in den Kühlschrank.
    HINWEIS: Aufgeschlossene Proben werden im Kühlschrank bei niedrigeren Temperaturen gelagert, um sie zu konservieren und ihre Lagerzeit zu verlängern.

6. Reinigung des Reaktionsgefäßes

  1. Nachdem die aufgeschlossenen Proben in 50-ml-Messkolben überführt wurden, werden 5,0 ml 68 Gew.-% HNO3 und 5,0 ml Reinstwasser mit automatischen 5-ml-Pipetten in die Reaktionsgefäße gegeben.
  2. Verschließen Sie die Reaktionsgefäße mit den Abdeckdeckeln und setzen Sie sie in das Gestell ein. Den Rost in die Mikrowellenkammer geben.
  3. Wenden Sie das folgende Mikrowellenprogramm an: 15 min Erhöhung auf 160 °C, 10 min Erhöhung auf 180 °C, maximale Leistung 900 W.
  4. Überwachen Sie die Reaktionsbedingungen während des Erhitzens. Lassen Sie die Reaktionsgefäße nach Abschluss des Erhitzens abkühlen.
  5. Öffnen Sie den Mikrowellenherd, nehmen Sie die Reaktionsgefäße aus dem Rost und öffnen Sie sie langsam im Abzug.
  6. Entsorgen Sie den Inhalt der Reaktionsgefäße in Kunststoffabfallbehälter.
  7. Spülen Sie die Reaktionsgefäße mit Reinstwasser, um überschüssiges Material oder Chemikalien zu entfernen.
  8. Trocknen Sie die Reaktionsgefäße vor dem nächsten Gebrauch bei 105 °C im Trockner.
    HINWEIS: Das gleiche Mikrowellenverfahren (Zeit, Leistung, Temperaturgradient und Volumen der Chemikalien), das für den Säureaufschluss von Proben verwendet wird, kann auch für die Reinigung der Reaktionsgefäße verwendet werden. Alternativ können die Reaktionsgefäße auch ohne Mikrowellensystem gereinigt werden, indem sie mehrere Stunden in konzentriertes HNO3 oder HCl getaucht und mit Reinstwasser gespült werden.

7. Multielementbestimmung mit ICP-MS

  1. Nehmen Sie die 50-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen mit den aufgeschlossenen Proben aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen.
  2. Die Proben werden um den Faktor 10 verdünnt, um die Säurekonzentration in der aufgeschlossenen Probe zu verringern und die Konzentration des Bestandteils der Probenmatrix zu verringern. Mit einer automatischen Pipette werden 2,50 ml der Probe in einen 25-ml-Glas-Messkolben überführt und anschließend bis zur Marke mit Reinstwasser gefüllt.
  3. Übertragen Sie die verdünnten Proben in die 15-ml-Kunststoffröhrchen und legen Sie sie an die entsprechenden Positionen im Autosampler.
  4. Bereiten Sie das ICP-MS-Gerät (siehe Materialtabelle) für die Messungen vor:
    1. Schalten Sie die Lüftung und den Kühler ein, der das ICP-MS mit Kühlwasser versorgt und seine Komponenten kühlt.
    2. Stellen Sie mit der kompatiblen Software sicher, dass die Spüllösung (1 Gew.-% HNO3) kontinuierlich und pulsierend vom Autosampler zum ICP-MS fließt.
    3. Offene Ar- (99,999 % Reinheit) und He (99,999 % Reinheit) Gasflaschen, um das ICP-MS mit beiden Gasen zu versorgen. Überprüfen Sie den Gasfluss in der Software und passen Sie ihn gegebenenfalls an.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Kollisionszelle mit He-Gas, wenn spektrale Interferenzen aufgrund der Bildung mehratomiger Ionen zu erwarten sind (z. B. 40Ar16O+ interferiert mit 56Fe+)37.
    4. Starten Sie das Plasma und kalibrieren Sie das Instrument mit der Stimmlösung (siehe Materialtabelle).
    5. Sobald das Gerät kalibriert ist (Brennerposition, Verstärkungsspannung, Linsenspannung, Masse/Auflösung, Impuls-/Analogkalibrierung (P/A), Datenbankkalibrierung (DB) und Validierung), wählen Sie die gewünschte Messmethode aus und führen Sie die Messungen durch.
  5. Wenn Sie mit unbekannten Proben arbeiten, führen Sie eine semiquantitative Bestimmung durch, um Informationen darüber zu erhalten, welche Elemente in der Probe vorhanden sind und welche ungefähre Konzentration sie haben.
    HINWEIS: Es ist ratsam, die Proben für die semiquantitative Bestimmung zusätzlich zu verdünnen, da die Detektoren eine Grenze für die Konzentration der Elemente haben, die sie gleichzeitig nachweisen können. Niedrigere Probenkonzentrationen können die Lebensdauer der Gerätekomponenten verlängern.
  6. Nachdem Sie die Daten zu den ungefähren Konzentrationen der Elemente in den Proben erhalten haben, erstellen Sie in der Software eine Methode zur quantitativen Elementbestimmung. Wählen Sie die Betriebsbedingungen des ICP-MS (Tabelle 1) und wählen Sie die gewünschten Elemente (im vorliegenden Fall Cu, Fe, Mn und Zn) aus. Bestimmen Sie die Anzahl und Konzentrationen der Lösungen des Standards, die zur Erstellung einer Kalibrierkurve (manchmal auch als Analysenkurve oder Arbeitskurve bezeichnet) erforderlich sind (Tabelle 1).
    HINWEIS: Bereiten Sie mindestens sechs verschiedene Konzentrationen als Kalibrierpunkte für die Kalibrierkurve vor.
  7. Bereiten Sie Standardlösungen für die Kalibrierkurve vor. Pipettieren Sie mit automatischen Pipetten das erforderliche Volumen von 100 mg/l Multielement-Standardlösungen in 25-ml-Glasmesskolben, um Lösungen von Standards mit den folgenden Konzentrationen herzustellen: 1,0 μg/L, 2,5 μg/L, 5,0 μg/L, 10,0 μg/L, 20,0 μg/L, 30,0 μg/L, 40,0 μg/L und 50,0 μg/L. Füllen Sie die Kolben bis zur Markierung mit 1 Gew.-% HNO3. Bereiten Sie zusätzlich einen Kalibrierungsrohling mit der 1 Gew.-% HNO3-Lösung vor.
  8. Übertragen Sie die vorbereiteten Lösungen von Standard- und Probenlösungen in die 15-ml-Kunststoffröhrchen, geben Sie sie in den Autosampler und starten Sie das Gerät gemäß dem in Schritt 7.4 beschriebenen Verfahren.
  9. Führen Sie die quantitative Messung der ausgewählten Elemente mit der Kalibrierungskurvenmethode durch.
  10. Schalten Sie nach Abschluss der Messungen das Plasma aus, schließen Sie die Ar- und He-Gasversorgung, schalten Sie den ICP-MS-Kühler aus und schalten Sie das Lüftungssystem aus.

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Representative Results

Homogenisierung
Alle Proben wurden mit dem Labortrockner zu einer konstanten Masse getrocknet, um jegliche Feuchtigkeit zu entfernen. Durch das Umfüllen der Probe in einen Exsikkator konnte sie auf Raumtemperatur abkühlen, ohne Feuchtigkeit aus der Umgebung zu binden. Die Lebensmittelproben wurden dann mit dem Labormischer homogenisiert, um ein feines Pulver zu erhalten. Die resultierenden homogenisierten Partikel waren gleichmäßig in der Größe und gleichmäßig verteilt, um sicherzustellen, dass die für den Säureaufschluss verwendeten Teilproben (Proben aus einer größeren Probe) repräsentativ waren. Die Proben konnten mit Hilfe eines Kunststoffspatels leicht aus dem Mischbecher entnommen werden, mit Ausnahme der Trockenfleischprobe, die aufgrund ihres höheren Fettgehalts schwieriger zu entnehmen war. Ein höherer Fettgehalt führte dazu, dass die Probe teilweise an den Glaswänden des Mischbechers haftete. Der Vergleich von frischen, getrockneten und homogenisierten Proben ist in Abbildung 2 dargestellt.

Die Komponenten des Instruments mussten mehrfach mit Reinstwasser gereinigt werden, um alle im Mischer verbliebenen Speisereste zu entfernen.

Es muss unbedingt sichergestellt werden, dass die gewogene Masse der Probe den in den Reaktionsgefäßen zulässigen Höchstwert nicht überschreitet. Das Wiegen wurde mit einer Analysenwaage bei konstanter Temperatur durchgeführt, und es wurde ein Kunststoffspatel verwendet, um eine Kontamination mit Metallen zu vermeiden, die durch Metallspatel entstehen kann.

Saure Verdauung
Alle im Protokoll verwendeten Proben waren Lebensmittelproben, die unterschiedliche Mengen an Kohlenhydraten, Proteinen und Fetten enthielten. HNO3 ist in Kombination mit H2O2 für den Aufschluss dieser Moleküle geeignet, und andere Chemikalien sind nicht erforderlich. Die Chemikalien wurden in einem Abzug behandelt, da HNO3 Dämpfe bildet. Nach der Zugabe der Chemikalien in die TFM-PTFE-Reaktionsgefäße wurden oben auf den Reaktionsgefäßen Abdeckdeckel angebracht und gut verschlossen, um eine mögliche Kontamination und einen Verlust des Analyten zu vermeiden. Die Reaktionsgefäße waren symmetrisch im Gestell verteilt, um eine gleichmäßige Mikrowellenbestrahlung im Mikrowellensystem zu gewährleisten.

Während des Säureaufschlusses wurde die Tür des Mikrowellensystems geschlossen, und die Tür konnte bis zum Ende des Protokolls nicht geöffnet werden. Der gesamte Prozess des Säureaufschlusses kann auf dem Bildschirm des Geräts überwacht werden und zeigt die Temperaturänderung mit der Zeit an (Abbildung 7).

Nachdem der Säureaufschluss abgeschlossen war und die Lösungen der aufgeschlossenen Proben auf Raumtemperatur abgekühlt waren, wurden die Reaktionsgefäße im Abzug geöffnet. Sie wurden so langsam wie möglich geöffnet. Wird der Druck zu schnell abgelassen, können selbst kleine Tröpfchen des Reaktionsgemisches austreten, was zu einem Verlust des Analyten führt. Beim Öffnen der Reaktionsgefäße wurde ein gelbes oder gelb-oranges Gas freigesetzt (Abbildung 8). Die Färbung der Dämpfe kann auf NO2 zurückgeführt werden, das bei höheren Temperaturen orangefarbene Dämpfe bildet. Der Druckanstieg in den Reaktionsgefäßen war auf die Oxidation von Lebensmittelproben mit HNO3 zurückzuführen, wodurch Gase wie CO2, H2O, NO usw. gebildet wurden. Nach dem Entgasen der Reaktionsgefäße verblieb eine hellgelbe oder farblose Lösung der aufgeschlossenen Probe im Reaktionsgefäß, was darauf hindeutet, dass der Gesamtsäureaufschluss durch MAWD erreicht worden war. Dies wurde durch das Fehlen sichtbarer Partikel in der Lösung weiter bestätigt.

Der letzte Schritt der Probenvorbereitung bestand darin, die aufgeschlossenen Proben mit Reinstwasser zu verdünnen, um den Restsäuregehalt (RA) zu reduzieren. Hohe RA-Werte stören die Messungen, indem sie das Hintergrundsignal erhöhen. Die Verdünnung verringert auch die Konzentration von Metallionen in der flüssigen Probe26. Beim Überführen der Lösung von aufgeschlossenen Proben in Messkolben wurden die Komponenten des Reaktionsgefäßes gründlich mit Reinstwasser gespült, um den Analyten vollständig zu übertragen. Ein Problem, das auftritt, ist, dass kleine Tropfen Reinstwasser, die den interessierenden Analyten enthalten können, an den Wänden der Reaktionsgefäße haften. Nach Verdünnung mit Reinstwasser auf die 25-ml-Marke wurden alle Proben farblos. Die endgültigen Lösungen der aufgeschlossenen Proben enthielten wasserlösliche Salze, da die in der Probe vorhandenen Metallelemente mit HNO3 zu hochlöslichen Nitraten reagierten. Elementaranalysetechniken können die Metallionen bestimmen, die wasserlösliche Salze bilden. Beim Filtern der verdünnten Lösungen ist es wichtig, die ersten Tropfen zu verwerfen, um sicherzustellen, dass alle Partikel oder Verunreinigungen entfernt werden. Nach der Filtration wurden die Lösungen dicht verschlossen, um ein Auslaufen zu verhindern, und dann im Kühlschrank gelagert.

Die Haupteinschränkung des Verfahrens des Säureaufschlusses ist der Probendurchsatz. Das MAWD-System kann nur eine begrenzte Anzahl von Proben gleichzeitig verdauen. Darüber hinaus kann jeder Aufschluss und jeder anschließende Probenvorbereitungsschritt mehrere Stunden dauern. Darüber hinaus ist die Reinigung der Reaktionsgefäße ebenfalls zeitaufwändig, aber es ist entscheidend, das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen den Proben zu minimieren.

Multielementbestimmung mit ICP-MS
Für jedes Element wurde eine Kalibrierungskurve erstellt. Sie wurden erhalten, indem die Intensität als Funktion der Analytkonzentrationen aufgetragen wurde (Abbildung 9). Die linearen Konzentrationsbereiche für alle gemessenen Elemente lagen im Bereich von 1,0 μg/L bis 50,0 μg/L.

Die LOD und LOQ für jedes Element wurden mit Gleichung 1 bzw. Gleichung 2 berechnet. In beiden Gleichungen stellt sblank die Standardabweichung der verschiedenen Messungen des Kalibrierungs-Blanks (10 Wiederholungen)38,39 dar, während b1 die Steigung der Kalibrierungskurve darstellt.

Equation 1(1)

Equation 2(2)

Die erhaltenen LODs betrugen 0,5 ng/L, 2,8 ng/L, 2,8 ng/L bzw. 3,2 ng/L für Mn, Cu, Fe und Zn. Die erhaltenen LOQs betrugen 1,6 ng/L, 9,2 ng/L, 9,5 ng/L bzw. 10,8 ng/L für Mn, Cu, Fe und Zn.

Von jeder Probe wurden sechs Replikataufschlüsse durchgeführt. Drei Wiederholungsaufschlüsse jeder Probe wurden durchgeführt, ohne die Probe mit Standardlösungen zu spießen, und drei Wiederholungsaufschlüsse wurden unter Zugabe einer Lösung einer bekannten Menge Analytstandard durchgeführt, um die Genauigkeit (Spike-Wiederfindungstest40) und Präzision der gesamten Methodik zu testen. Zur Genauigkeitsbestimmung vor dem Aufschlussverfahren wurden 37,5 μl 100 mg/l ICP-Multielement-Standardlösung in die Reaktionsgefäße mit der Probe pipettiert, was zu einem Konzentrationsanstieg von 15,0 μg/l in dotierten Proben, die um den Faktor 10 verdünnt wurden, führte. Dies entsprach auch einem Anstieg von 15,0 μg pro Gramm Probe für jedes gemessene Metallion. Die Genauigkeit und Präzision wurden mit Hilfe von Rec bzw. relativer Standardabweichung (RSD) bestimmt.

Die Genauigkeit einer Analysemethode kann durch den Spike-Recovery-Test beurteilt werden. Zu diesem Zweck wird der Probe eine Lösung einer bekannten Menge an Analytstandard zugesetzt, die dann unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie Proben, die nicht dotiert sind41, aufgeschlossen wird. Der Rec wird unter Verwendung von Gleichung 3 berechnet, wobei γi die gemessene Konzentration der dotierten Proben nach dem Aufschluss ist, während γt die bestimmte Konzentration der nicht dotierten Probe unter Berücksichtigung des Anstiegs der zugegebenen Lösung des Analytstandards darstellt. Die γi und γt sind Durchschnittswerte der drei Replikate. Die Analysemethode gilt als genau, wenn der Rec im Bereich von 80,00 % bis 120,00 %42 liegt.

Equation 3(3)

Die Präzision einer Analysemethode wird mit RSD bewertet. Sie beschreibt den Grad der Übereinstimmung zwischen unabhängigen Ergebnissen, die durch mehrere Wiederholungsmessungen erhalten wurden. RSD wird mit Gleichung 4 berechnet, wobei sm die Standardabweichung der Wiederholungsmessungen für die Konzentrationsbestimmung darstellt, während Equation 4 es den Durchschnittswert der ermittelten Konzentrationen darstellt. Die Analysemethode gilt als präzise, wenn der RSD-Wert unter 20,00 %43 liegt.

Equation 5(4)

Alle Proben wurden vor den ICP-MS-Messungen (für den ersten Messsatz) um den Faktor 10 mit Reinstwasser verdünnt. Die Verdünnung verringerte die Konzentration der in den Analysator eingeführten Matrixkomponenten. Darüber hinaus nimmt durch Verdünnen der Probe die RA ab. Eine hohe RA kann die Plasmaionisationseffizienz beeinträchtigen oder zu Matrixinterferenzproblemen führen. Wenn die Konzentration der Analyten nach dem ersten Messsatz niedriger als die LOQ ist, sollte der Verdünnungsfaktor kleiner als 10 sein. Die Quantifizierung der Metallionen erfolgte anhand einer Kalibrierkurve. Die Werte der berechneten Ergebnisse sollten die gleiche Genauigkeit (die gleiche Anzahl signifikanter Stellen) aufweisen wie die Lösung des für die Kalibrierung verwendeten Standards. Der Gehalt an Metallionen in der Probe wurde in μg pro Gramm Gewicht (μg/g) ausgedrückt. Dies wurde erreicht, indem die gemessene Massenkonzentration der analysierten Probe mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert wurde, um die Konzentration in der ursprünglichen aufgeschlossenen Probe zu erhalten. Diese Massenkonzentration wurde dann mit dem Volumen der aufgeschlossenen Probe (25 ml) multipliziert und dann durch die anfänglich gewogene Masse der homogenisierten Probe dividiert (die anfängliche gewichtete Masse ist die Masse der Probe, die in das Reaktionsgefäß für den MAWD gewogen wurde). Alle Werte werden als Durchschnitt von drei Replikaten gemeldet.

Der berichtete Inhalt der folgenden Elemente wird als Equation 4 ± sm angegeben. Der Gehalt an Cu, Mn und Zn in der Brokkoliprobe betrug 5,9 ± 0,5 μg/g, 32,5 ± 2,7 μg/g bzw. 42,8 ± 0,2 μg/g. Die ermittelte Massenkonzentration von Fe in Brokkoliproben überschritt die Obergrenze des linearen Konzentrationsbereichs der Kalibrierkurve (d. h. 50,0 μg/L). Daher wurde die Lösung der Probe mit Reinstwasser um den Faktor 2 verdünnt und die ICP-MS-Messung dieser Lösung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass der Brokkoli 63,0 ± 1,9 μg/g Fe enthielt.

Für den Pilz betrug der Gehalt an Zn, Fe, Cu und Mn 35,6 ± 1,4 μg/g, 30,4 ± 1,3 μg/g, 18,5 ± 1,0 μg/g bzw. 5,4 ± 0,3 μg/g. Die Würste enthielten 42,2 ± 0,9 μg/g Fe, 25,1 ± 2,6 μg/g Zn und 1,0 ± 0,1 μg/g Cu. Die Multielementbestimmung mit ICP-MS der aufgeschlossenen Lösung, die 10-fach verdünnt wurde, zeigte, dass die Konzentration von Mn unter der unteren Grenze des linearen Konzentrationsbereichs (d. h. 1,0 μg/L) lag. So wurde die ursprüngliche Lösung der Wurstprobe nur um den Faktor 5 verdünnt und die Multielementbestimmung mit ICP-MS wiederholt. Der Gehalt an Mn in Wurstproben wurde mit 0,9 ± 0,3 μg/g bestimmt. Nudeln enthielten 5,4 ± 2,8 μg/g Zn, 10,3 ± 1,2 μg/g Fe, 1,6 ± 0,3 μg/g Cu und 7,5 ± 0,2 μg/g Mn.

Der Rec für alle in allen vier Proben gemessenen Analyten lag im Bereich von 80,00 % bis 120,00 %, was auf die Genauigkeit der Analysemethode hinweist. Die Berechnungen zeigten, dass die Analysemethode präzise war, da die RSD-Werte unter 20,00 % lagen, abgesehen von RSD für Zn in Nudelproben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Figure 1
Abbildung 1: Labormischer zur Homogenisierung von Lebensmittelproben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Vergleich von frischen, getrockneten und homogenisierten Proben. (A-D) Frische Proben von Brokkoli, Pilzen, Wurst und Nudeln. (E-H) getrocknete Proben von Brokkoli, Pilzen, Wurst und Nudeln. (I-L) homogenisierte Proben von Brokkoli, Pilzen, Wurst und Nudeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Wiegen der Probe auf einer Analysenwaage. Dies geschieht von oben durch Öffnen der oberen Klappe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Mikrowellensystem. Das Mikrowellensystem für den Säureaufschluss mit seitlichem Touchscreen zur Auswahl der Reaktionsbedingungen und zur Überwachung des Prozesses des Säureaufschlusses. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Komponenten, die für den mikrowellenunterstützten Säureaufschluss verwendet werden. (A) Gestell mit 14 Reaktionsgefäßen für den Säureaufschluss in der Mikrowellenkammer. (B) TFM-PTFE-Reaktionsgefäße bestehen aus 3 Teilen. Sobald die Gefäße mit Deckeln verschlossen sind, können weder die Probe noch Gase aus den Reaktionsgefäßen austreten oder in diese gelangen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Das Innere der Reaktionsgefäße beim Öffnen im Abzug. (A) Die gelb-orange Färbung der Dämpfe ist auf NO2 zurückzuführen, das beim Säureaufschluss entsteht. (B) Die gelbe Färbung der Lösung der aufgeschlossenen Probe, nachdem die meisten Gase aus dem Reaktionsgefäß entwichen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Temperaturänderung mit der Zeit. Ein Diagramm, das die Temperaturänderung als Funktion der Zeit während der sauren Verdauung mit MAWD zeigt. T2 steht für die Temperatur des Reaktionsgemisches in den Reaktionsgefäßen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Öffnen der Reaktionsgefäße unter dem Abzug, wo gelb-orange Gase freigesetzt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Beispiel einer Kalibrierkurve für Mn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10: ICP-MS-Gerät zur Bestimmung mehrerer Elemente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Betriebsbedingungen des ICP-MS-Geräts. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Rec- und RSD-Werte von Brokkoli, Pilzen, Wurst und Nudeln. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Homogenisierung
Um reproduzierbare Ergebnisse bei der Elementbestimmung zu gewährleisten, ist es aufgrund ihrer komplexen und inhomogenen Struktur und Zusammensetzung notwendig, Proben vor dem Säureaufschluss zu homogenisieren. Die Homogenisierung zielt darauf ab, konstitutionelle und verteilungspolitische Heterogenität zu beseitigen. Durch das Mischen der Probe wird die Verteilungsheterogenität minimiert, indem die Komponenten gleichmäßig in der Probe verteilt werden. In ähnlicher Weise wird durch Herabsetzen der Partikelgröße auf eine einheitliche Größe die konstitutionelle Heterogenität reduziert44. Die aus dem Homogenat gewonnenen Teilproben müssen das gleiche Verhältnis von Bestandteilen wie die ursprüngliche Probe enthalten, um repräsentativ zu sein45.

Die Homogenisierung wird erreicht, indem eine Kraft ausgeübt wird, um die Probe in kleinere Partikel46 zu zerlegen. Die Proben können durch Schneiden, Hacken, Scheren, Zerkleinern, Mahlen oder Mischen homogenisiert werden. Das geeignete Verfahren muss jedoch den Härtegrad, die Sprödigkeit, die Abrasivität, die Elastizität, die Form und die Fähigkeit der Probe berücksichtigen, an den Komponenten des Homogenisators zu haften Methode47.

Die Probe kann manuell mit einem Stößel und Mörser zerkleinert oder in einer Vielzahl von Mühlen (Messermühle, Schneidmühle, Kugelmühle, Mischmühle usw.) und anderen Formen von Homogenisatoren48 gemahlen werden. Kleine Labormischer mit Keramik- oder Metallschaufeln werden häufig für die Homogenisierung verwendet, da sie die Partikelgröße durch Zerfall und gleichzeitiges Mischen der Probe schnell reduzieren. Das Mahlen von Proben in kleinere homogene Partikel vergrößert die spezifische Oberfläche, was den Säureaufschluss durch MAWD beschleunigt.

Es muss jedoch darauf geachtet werden, dass Verunreinigungen durch Abrieb beim Schleifen vermieden werden. Die Proben sollten nicht mit Klingen homogenisiert werden, die die gleichen Metalle enthalten wie die Elemente, die nach dem Säureaufschluss bestimmt werden sollen. Folglich werden Keramikklingen im Vergleich zu Metallklingen häufiger verwendet. Die Homogenisierung ist oft ein wichtiger Faktor für Kreuzkontaminationen, in der Regel durch unsachgemäß gereinigtes Inventar und Gerätekomponenten, was zu systematischen Fehlern führt. Nach Gebrauch sollte jede Komponente des Mischers gründlich gereinigt und mit Reinstwasser gewaschen werden.

Die kryogene Vermahlung wird bei der Homogenisierung von Proben verwendet, die schwieriger zu zerkleinern sind. Die Probe wird mit flüssigem Stickstoff (-196 °C) eingefroren, wodurch sie spröde und leichter zu homogenisierenist 49,50.

Saure Verdauung
Eine der am häufigsten verwendeten oxidierenden Säuren bei Säureaufschlussverfahren ist HNO3. Es wird normalerweise in Kombination mit einer geringen Menge H2O2 verwendet, die die Oxidationskraft der Säure erhöht und so die Verdauungseffizienz verbessert20. Eine Mischung dieser beiden Chemikalien wird häufig für den Aufschluss organischer Proben, einschließlich Lebensmittelproben, verwendet51. Der Aufschluss organischer Proben in MAWD erfolgt bei erhöhtem Druck und Temperaturen, die den Siedepunkt (121 °C)des HNO-3-Azeotrops bei Atmosphärendrucküberschreiten 27. Bei MAWD steigt der Siedepunkt von HNO3 auf 176 °C, wenn der Druck auf 5 atm27 erhöht wird. Die Temperatur, bei der der Säureaufschluss in MAWD durchgeführt wird, kann in offenen Systemen nicht erreicht werden, da der HNO3 verdampfen würde, was die Effizienz des Säureaufschlusses verringern würde.

Während des Aufschlusses in geschlossenen Gefäßen durch MAWD reagiert HNO3 unter rauen Reaktionsbedingungen mit der organischen Probe und bildet gasförmige Produkte wie CO2, H2O und NO (Gleichung 5)52,53. Der Vorteil der Verwendung geschlossener Reaktionsgefäße ist das geringere Volumen und die geringere Konzentration der für die Verdauung erforderlichen Säure, da HNO3 ständig regeneriert wird. Dieser Regenerationsprozess findet so lange statt, wie O2 im Reaktionsgefäß vorhanden ist. Die primäre Quelle von O2 ist H2O2, das thermisch instabil ist und in H2O und O2 zerfällt (Gleichung 6). Im Reaktionsgefäß reagiert NO mit O2 zu NO2 (Gleichung 7). Das gebildete NO2 löst sich dann in H2O auf, was zur Bildung von HNO3 und HNO2 führt (Gleichung 8). Das produzierte HNO2 zerfällt anschließend in H2O, NO2 und NO (Gleichung 9), wodurch der Regenerationsmechanismus53,54 vervollständigt wird. Die neu gebildeten NO und NO2 reagieren dann durch die oben genannten Prozesse.

Equation 6(5)

Wobei n für die Anzahl der Kohlenstoffatome steht.

Equation 7(6)

Equation 8(7)

Equation 9(8)

Equation 10(9)

Wenn organische Proben mit HNO3 reagieren, bilden die in ihrer chemischen Struktur vorhandenen Metalle wasserlösliche Nitrate55. Da MAWD darauf abzielt, Feststoffe in Flüssigkeiten umzuwandeln, ist die Bildung von wasserlöslichen Salzen erwünscht.

Für verschiedene Proben können aufgrund der Komplexität der Probenzusammensetzung unterschiedliche Kombinationen von Säuren eingesetzt werden. Da weniger leicht abbaubare organische und insbesondere anorganische Proben nicht allein mit HNO3 gelöst werden können, werden auch andere Säuren wie HCl, HF, HClO4 und H2SO4 verwendet21,56.

Nicht oxidierendes HCl bei erhöhten Temperaturen wird für den Aufschluss von Salzen wie Karbonaten, Phosphaten, Oxiden, Boraten, Sulfiden und Fluoriden verwendet 28,55. Wenn HCl mit HNO3 in einem molaren Verhältnis von 3:1 kombiniert wird, entsteht Königswasser, das die oxidierenden Fähigkeiten im Vergleich zu HCl und HNO3 allein durch die Bildung von Nitrosylchlorid (NOCl), Cl2 und H2O verbessert (Gleichung 10)57. Königswasser ist in der Lage, Edelmetalle wie Au, Pt, Pd28 aufzulösen.

Equation 11(10)

Für den Aufschluss von Silikaten wird häufig HF verwendet, da es starke Bindungen zwischen Si und O aufbricht. Wenn HF mit Silikatproben (Mineralien, Boden) interagiert, entsteht Hexafluorkieselsäure (H2SiF6) (Gleichung 11)19,58. Trotz der Fähigkeit von HF, Silikate zu verdauen, weist es jedoch mehrere Nachteile auf, darunter die Bildung unlöslicher Fluoridsalze6, die Bildung flüchtiger Produkte mit Schwermetallen19 und flüchtiges SiF427. Darüber hinaus kann HF nicht mit Glaswaren und Quarzreaktionsgefäßen verwendet werden, da es diese auflöst18.

Equation 12(11)

Reaktionsgefäße für den Säureaufschluss
Die in MAWD verwendeten Reaktionsgefäße sind so konzipiert, dass sie hohen Temperaturen und erhöhten Drücken während des Säureaufschlusses standhalten. Diese Reaktionsgefäße weisen auch eine gute Mikrowellenpermeabilität auf, so dass Mikrowellen passieren können, ohne absorbiert zu werden20. Mikrowellen, die durch die Reaktionsgefäße strömen, erreichen Wassermoleküle, die sie effektiv absorbieren, da sie polar sind, wodurch die Lösung, die die Probe59 enthält, erwärmt wird. Nur die flüssige Phase in den Reaktionsgefäßen absorbiert die Mikrowellenstrahlung, die gasförmige Phase hingegen nicht, was zu einem hohen Temperaturanstieg bei leichtem Druckanstiegführt 18.

Um Kontamination und Analytverlust zu minimieren, sind die Reaktionsgefäße hermetisch verschlossen, so dass kein Material austreten oder in die Gefäße gelangen kann.

Die am häufigsten verwendeten Materialien für Reaktionsgefäße sind synthetisches Polytetrafluorethylen (PTFE), copolymerisiertes PTFE, bekannt als TFM, Perfluoralkoxyalkan (PFA) und Quarz52,60. Diese Materialien sind chemisch inert gegenüber den meisten Chemikalien, die beim Säureaufschluss verwendet werden, mit Ausnahme von Quarzgefäßen, in denen sich HF auflöst. Die Verwendung von nur einem Reaktionsgefäßtyp in jedem Experiment ist von entscheidender Bedeutung, da die Verwendung verschiedener Gefäßtypen bei Mikrowellenerwärmung zu unterschiedlichen Reaktionsbedingungen führen kann. Bei niedrigeren Reaktionstemperaturen werden PTFE-, PFA- und TFM-PTFE-Reaktionsgefäße verwendet, während bei Temperaturen über 300 °C Quarzgefäße empfohlen werden52. Dies liegt daran, dass sich Polymere bei höheren Temperaturen verschlechtern und zersetzen.

Bewertung der Effizienz der Säureverdauung
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die Effizienz der Säureverdauung zu bewerten. Anhand der Farbe der Lösung kann beurteilt werden, ob ein vollständiger oder teilweiser Aufschluss der Probe stattgefunden hat. Normalerweise ist eine farblose oder leicht gelbe Färbung der Lösung ein Indikator für eine erfolgreiche Verdauung, während die dunklere gelbe, orange, grüne oder braune Farbe der Lösung darauf hindeutet, dass der Verdauungsprozess nicht erfolgreich war, was bedeutet, dass eine teilweise Verdauung stattgefunden hat61. In einigen Fällen können nach dem Aufschluss unverdaute organische oder anorganische Partikel im Reaktionsgemisch vorhanden sein, die eine Filtration erfordern, bevor die Probe zur Elementbestimmung in das Gerät eingeführt werden kann. Die Entfernung von unverdauten Partikeln verhindert Systemverstopfungen und Plasmainstabilität bei ICP-OES und ICP-MS31.

Die Effizienz des Säureaufschlusses kann auch experimentell durch Messungen des Restkohlenstoffgehalts (RCC) und der RA bewertet werden. RCC stellt die Menge an organischem Kohlenstoff dar, die in der Lösung verbleibt und während des Aufschlusses nicht in CO2 umgewandelt wurde62. Ein niedrigerer RCC-Wert wird bevorzugt, um nicht-spektrale und spektrale Interferenzen (z. B. 40Ar12C+) bei der Elementbestimmungzu reduzieren 63,64. RCC-Messungen werden mit ICP-OES durchgeführt. Der Kohlenstoffgehalt wird bei einer Emissionswellenlänge von 193,091 nm 65,66,67 bestimmt. Die Effizienz der Säureverdauung hängt mit dem Verbrauch von Chemikalien zusammen. Je mehr Säure verbraucht wird, desto niedriger sind die RCC-Werte25.

Die Säure wird während der Verdauung kontinuierlich verbraucht, da sie mit der Probe reagiert. In den meisten Fällen bleibt eine kleine Menge Säure unumgesetzt. Die Menge an RA kann durch Titration mit NaOH10 oder KOH 25,54 bestimmt werden. Niedrigere RA-Werte werden bevorzugt, da die höhere Säurekonzentration in der endgültigen Aufschlusslösung das Hintergrundsignal in Analysetechniken wie ICP-MS25 und ICP-OES68 erhöhen kann. Höhere RA-Werte können auch auf die Verwendung einer niedrigeren anfänglichen Säurekonzentration für die Verdauung hinweisen69.

Multielementbestimmung mit ICP-MS
ICP-MS besteht aus mehreren Komponenten. Die Peristaltikpumpe pumpt die Probenlösung vom Autosampler in den Vernebler. Die flüssige Probe wird dann vom Vernebler durch Mischen mit Ar-Gas in ein Aerosol umgewandelt. Anschließend filtert die Sprühkammer Aerosoltröpfchen und ermöglicht so das Einbringen feinster Aerosoltröpfchenfraktion in das Plasma70. Ar-Plasma wird durch die Hochfrequenzspule erzeugt und im Brenner gehalten, was zu Temperaturen von ca. 10.000 K70 führt. Das Aerosol wird im Ar-Plasma zerstäubt und ionisiert. Die Ionen gelangen dann weiter durch die Grenzfläche in den Hochvakuumbereich. Ionenoptiken leiten die Ionen durch die Kollisionszelle, wo der Strom des He-Gases mit den einatomigen Ionen der Analyten und mehratomigen Ionen kollidiert. Da mehratomige Ionen größer sind als Analyten gleicher Nennmasse, kollidieren sie häufiger mit He, verlieren mehr kinetische Energie und werden daher effizient entfernt71. Im nächsten Schritt gelangen Ionen zum Massenanalysator (im vorliegenden Fall Quadrupol). Im Massenanalysator werden die Ionen anhand ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses (m/z)72 getrennt. Nach der Trennung durch m/z erreichen die Ionen den Detektor (im vorliegenden Fall einen Elektronenvervielfacher) (Abbildung 10).

Kritische Schritte und Einschränkungen
Es gibt mehrere kritische Schritte und einige Einschränkungen innerhalb des Protokolls. Die Sicherstellung, dass die Proben vollständig trocken sind, bevor der Prozess fortgesetzt wird, und die Vermeidung von Verunreinigungen sind entscheidende Schritte bei der Homogenisierung. Um eine Kontamination zu vermeiden, müssen alle Glaswaren während des gesamten Prozesses73 sauber gehalten werden, da dies die Genauigkeit der Analyse beeinträchtigen kann. Im Falle einer Kontamination muss die Probe verworfen und der Vorbereitungsprozess wiederholt werden, was zeitaufwändig sein kann. Bei Anwendung dieses Protokolls auf andere Proben, die nicht in diesem Protokoll beschrieben sind, wird möglicherweise kein vollständiger Aufschluss erreicht, da einige Proben höhere Temperaturen und andere Chemikalien erfordern können, um alle in der Probe vorhandenen Metalle vollständig aufzulösen. Für den Säureaufschluss werden hochreine Chemikalien benötigt, die teuer sein können. Die Verwendung hochreiner Chemikalien trägt zur Minimierung von Interferenzen bei und gewährleistet eine verbesserte Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Präzision der von ICP-MS durchgeführten Messungen. Der Probenvorbereitungsprozess ist zeitaufwändig und hat einen geringen Probendurchsatz, da die Vorbereitung mehrere Tage dauern kann (Trocknung, Homogenisierung, Säureaufschluss), wodurch die Anzahl der Proben, die an einem Tag vorbereitet werden können, begrenzt wird.

Bei der Durchführung der Multielementbestimmung mit ICP-MS können spektrale Interferenzen (polyatomar und isobar) auftreten. Polyatomare Interferenzen, die normalerweise im Plasma auftreten, kombinieren mindestens zwei Isotope, während isobare Interferenzen Isotope anderer Elemente mit der gleichen m/z wie gemessene Analyten74 darstellen. Es ist wichtig, diese Interferenzen (z. B. bei einer Kollisionszelle) zu eliminieren. Zusätzlich zu den spektralen Interferenzen werden die Ergebnisse auch durch nicht-spektroskopische Interferenzen beeinflusst, die aus der Probeneinführung in das ICP-MS-Instrument, der Verteilung der Aerosoltröpfchengröße, der Plasmastabilität, dem Ionentransport durch die Grenzfläche usw. bestehen.75.

Das hierin beschriebene Protokoll hat das Potenzial für andere Anwendungen als die für die Lebensmittelproben. Mit geringfügigen Modifikationen in den Homogenisierungs- und Säureaufschlussschritten könnte es für die Vorbereitung von anorganischen Proben, Boden76, Elektroschrott28 usw. angepasst werden. Die Anpassungen können die Verwendung verschiedener Chemikalien, die Variation ihres Volumens und die Änderung der Aufschlusstemperatur an verschiedene Probentypen beinhalten. Darüber hinaus könnten im Zuge der Weiterentwicklung von Technologie und Methoden weitere Verbesserungen und Automatisierungen in das Protokoll integriert werden, um seine Effizienz zu steigern und die Gesamtzeit der Probenvorbereitung zu verkürzen.

Zusammenfassend zeigt dieses Protokoll die Homogenisierung von Lebensmittelproben in einem Labormischer, den mikrowellengestützten Nasssäureaufschluss mit einer Mischung aus 68 Gew.-% HNO3 und 30 Gew.-% H2O2 bei erhöhter Temperatur und erhöhtem Druck sowie die Elementbestimmung mit ICP-MS. Das Protokoll kann verwendet werden, um das Personal in der Vorbereitung von Proben für die Elementbestimmung zu schulen, da das Protokoll Schritt-für-Schritt-Anleitungen enthält und die Theorie hinter der Homogenisierung, dem Säureaufschluss und der Elementbestimmung erklärt.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch die slowenische Forschungsagentur (Förderkennzeichen P2-0414, P2-0118, J1-2470, NK-0001 und J1-4416).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ar gas Messer 7440-37-1 Ar 5.0 gas (purity 99.999%).
AS-10 Autosampler system Shimadzu Autosampler connected to the ICP-MS, containing 68 ports for samples.
Automatic pipettes Sartorius 200 µL, 1 mL, and 5 mL automatic pipettes.
Balance XSE104 Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA Analytical balance scale with a maximum weighing mass of 120 g.
Ceramic knife Ceramic knife used for cutting fresh food samples.
Dessicator Glass desiccator with lumps of silica gel.
ETHOS LEAN Milestone, Sorisole, Italy Microwave system for wet acid digestion in closed 100 mL vessels made of TFM-PTFE.
Fume hood Laboratory fume hood with adjustable air flow.
Glass beakers RASOTHERM CarlRoth GmbH + Co.KG 50 mL, 250 mL glass beakers
Glass funnels Small glass funnels fitting into the neck of volumetric flasks.
He gas Messer 7440-59-7 He 5.0 gas (purity 99.999%).
Hydrogen peroxide ThermoFisher Scientific 7722-84-1 Hxdrogen peroxide 100 volumes 30 wt.% solution. Laboratory reagent grade.
ICP multi-element standard solution VIII Supelco 109492 100 mg/L ICP multi-element standard solution containing 24 elements (Al, B, Ba, Be, Bi, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Ga, K, Li, Mg, Mn, Na, Ni, Pb, Se, Sr, Te, Tl, Zn) in 2 % dilute nitric acid.
ICPMS 2030 Shimadzu Inductively coupled plasma mass spectrometry system for multi-element analysis of digested samples.
ICP-MS Tuning Solution A CarlRoth GmbH + Co.KG 250 mL tuning solution containing 6 elements (Be, Bi, Ce, Co, In, Mn) in 1 % nitric acid.
KIMTECH Purple Nitrile gloves Kimberly-Clark GmbH Disposable Purple Nitrile gloves (S, M or L).
Laboratory coat Any available supplier /
Mixer B-400 BÜCHI Labortechnik AG, Flawil, Switzerland Laboratory mixer with ceramic blades.
Nitric acid ThermoFisher Scientific 7697-37-2 Nitric acid, trace analysis grade, 68 wt%, density 1.42, Primar Plus, For Trace Metal Analysis.
Plastic centrifuge tubes Isolab 50 mL plastic centrifuge tubes with screw caps, single use.
Plastic syringes Injekt B. Braun 2 pice, single use 20 mL syringes.
Plastic tubes for autosampler Shimadzu 046-00147-04 Plastic tubes for autosampler, 15 mL capacity, 16 mm diameter, 100 mm length.
Plastic waste containers Plastic containers for the removal of chemicals after the cleaning procedure of reaction vessels.
Protective googles /
Samples (broccoli, sausage, noodles, zucchini, mushrooms) Fresh samples, which were dried to a constant weight and homogenized during the procedure. The samples were purchased from a local shop.
Spatula Plastic spatula.
Sterilizator Instrumentaria ST 01/02 Instrumentaria Dryer with adjustable temperature.
Syringe filters CHROMAFIL Xtra 729212 Syringe filters with polypropylene housing and polyamide hydrophilic membrane. Membrane diameter 25 mm, membrane pore size 0.2 µm.
Ultrapure water ELGA Labwater, Veolia Water Technologies. Ultrapure water with a resistivity of 18.2 MΩcm, obtained with laboratory water purification system.
Volumetric flasks 25 mL glass volumetric flasks.

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Rantaša, M., Majer, D., Finšgar, M. Preparation of Food Samples Using Homogenization and Microwave-Assisted Wet Acid Digestion for Multi-Element Determination with ICP-MS. J. Vis. Exp. (202), e65624, doi:10.3791/65624 (2023).

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