3D Bioprinting الهلاميات المائية الضوئية لدراسة تنشيط الخلايا الليفية
Summary
توضح هذه المقالة كيفية الطباعة الحيوية للهلاميات المائية القابلة للطباعة الضوئية 3D لدراسة تصلب المصفوفة خارج الخلية وتنشيط الخلايا الليفية.
Abstract
يمكن أن تتحول الهلاميات المائية القابلة للتعديل الضوئي مكانيا وزمانيا استجابة للتعرض للضوء. إن دمج هذه الأنواع من المواد الحيوية في منصات زراعة الخلايا وإحداث تغييرات ديناميكية ، مثل زيادة صلابة البيئة الدقيقة ، يمكن الباحثين من نمذجة التغييرات في المصفوفة خارج الخلية (ECM) التي تحدث أثناء تطور المرض الليفي. هنا ، يتم تقديم طريقة للطباعة الحيوية 3D مادة حيوية هيدروجيل قابلة للتعديل الضوئي قادرة على تفاعلين بلمرة متتاليين داخل حمام دعم الجيلاتين. تم تكييف تقنية التضمين الحر القابل للانعكاس للهلاميات المائية المعلقة (FRESH) عن طريق ضبط الرقم الهيدروجيني لحمام الدعم لتسهيل تفاعل إضافة مايكل. أولا ، تم تفاعل الحبر الحيوي الذي يحتوي على بولي (جلايكول الإثيلين) – ألفا ميثاكريلات (PEGαMA) خارج القياس المتكافئ مع رابط متشابك قابل للتحلل الخلوي لتشكيل هلاميات مائية ناعمة. تعرضت هذه الهلاميات المائية اللينة لاحقا للضوء والضوء للحث على البلمرة المتجانسة للمجموعات غير المتفاعلة وتقوية الهيدروجيل. يغطي هذا البروتوكول تخليق الهيدروجيل ، والطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ، والتقوية الضوئية ، وتوصيف نقطة النهاية لتقييم تنشيط الخلايا الليفية داخل هياكل ثلاثية الأبعاد. تمكن الطريقة المعروضة هنا الباحثين من الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لمجموعة متنوعة من المواد التي تخضع لتفاعلات البلمرة المحفزة بالأس الهيدروجيني ويمكن تنفيذها لهندسة نماذج مختلفة من توازن الأنسجة والمرض والإصلاح.
Introduction
الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد هي تقنية تحويلية تمكن الباحثين من إيداع الخلايا والمواد الحيوية بدقة داخل مجلدات ثلاثية الأبعاد وإعادة إنشاء الهيكل الهرمي المعقد للأنسجة البيولوجية. على مدى العقد الماضي ، أدى التقدم في الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد إلى نبض أنسجة القلب البشرية1 ، والنماذج الوظيفية لأنسجة الكلى2 ، ونماذج تبادل الغازات داخل الرئة3 ، ونماذج الأورام لأبحاث السرطان4. إن اختراع تقنيات الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المضمنة ، مثل التضمين الحر القابل للانعكاس للطباعة الحيوية للهيدروجيل المعلق (FRESH) ، جعل من الممكن إعادة إنتاج هياكل الأنسجة الرخوة المعقدة مثل الأوعية الدموية الرئوية5 وحتى قلب الإنسان6 في 3D. تسهل الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد FRESH الطباعة طبقة تلو الأخرى للأحبار الحيوية الناعمة ومنخفضة اللزوجة من خلال البثق في حمام دعم ترقق القص. يتكون حمام الدعم من مادة مثل جزيئات الجيلاتين الدقيقة المعبأة بشكل وثيق والتي تعمل كبلاستيك بينغهام وتحافظ على الشكل والهيكل المقصودين للحبر الحيوي بعد الطباعة. بمجرد أن تصلب البنية المطبوعة ، يمكن بعد ذلك إذابة حمام الدعم عن طريق زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية7.
لخصت مقالة مراجعة حديثة المواد التي تم طباعتها بيولوجيا 3D في منشورات مختلفة باستخدام تقنية FRESH. تتراوح هذه المواد المشتقة بشكل طبيعي من الكولاجين من النوع الأول إلى حمض الهيالورونيك الميثكريلاتي وتمثل العديد من آليات الهلام المختلفة7. معظم الدراسات البحثية التي أجريت باستخدام هذه التقنية 3D bioprinting تستخدم المواد الحيوية الثابتة التي لا تتغير استجابة للمنبهات الخارجية. تم استخدام المواد الحيوية الهيدروجيل الديناميكية القابلة للتعديل الضوئي من قبل مختبرنا وآخرين8،9،10،11،12 لنمذجة مجموعة متنوعة من الأمراض الليفية. على عكس المواد الحيوية الثابتة ، تسمح الأحبار الحيوية القابلة للتعديل الضوئي بإنشاء نموذج مخفف مع قيمة معامل مرونة أقل وتقويته لاحقا لاستكشاف الاستجابات الخلوية للزيادات في تصلب البيئة الدقيقة.
تتميز الأمراض الليفية بزيادة في إنتاج المصفوفة خارج الخلية التي يمكن أن تسبب تندب وتصلب13. يمكن أن يؤدي تصلب الأنسجة إلى مزيد من الإصابات وتدمير الأنسجة المتأثرة ، مما يتسبب في تلف دائم للأعضاء وحتى الموت. الاضطرابات الليفية مسؤولة عن ثلث الوفيات في جميع أنحاء العالم. تنتج الخلايا الليفية مصفوفة زائدة وشاذة خارج الخلية في حالة المرضهذه 14,15. تؤدي زيادة تكاثر الخلايا الليفية وترسب المصفوفة خارج الخلية إلى زيادة تصلب الأنسجة وتنشيط حلقة التغذية المرتدة الإيجابية البروليفية16،17،18،19. دراسة تنشيط الخلايا الليفية أمر حيوي لفهم الأمراض الليفية. نقدم هنا ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي البشري (PAH) كمثال على اضطراب ليفي واحد حيث من المهم تقليد هندسة 3D للأوعية الدموية باستخدام الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد وإدخال قدرات التقوية الديناميكية للهلاميات المائية القابلة للضوء. PAH هي حالة يتجاوز فيها الضغط في الشرايين الرئوية الرئيسية المستويات الطبيعية ويطبق ضغطا على القلب ، مما يزيد من تنشيط الخلايا الليفية العرضية للشريان الرئوي البشري (HPAAF) ويتصلب أنسجة الأوعية الدموية16،17،18،19. تسمح تركيبة الحبر الحيوي بولي (جلايكول الإثيلين) ألفا ميثاكريلات (PEGαMA) القابلة للتعديل الضوئي بالتصلب الزمني في التركيبات وتساعد على نمذجة كل من الأنسجة السليمة وتطور المرض5،8،9،10. يتيح استغلال هذه الميزة الفريدة القياس الكمي لتنشيط HPAAF وانتشاره استجابة لتقوية البيئة الدقيقة في 3D وقد يوفر نظرة ثاقبة قيمة للآليات الخلوية المشاركة في هذا المرض. سيسمح البروتوكول الموصوف هنا للباحثين بإنشاء نماذج 3D تلخص التغيرات في البيئة المكروية خارج الخلية أثناء تطور المرض أو إصلاح الأنسجة ودراسة تنشيط الخلايا الليفية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن لتفاعلات البلمرة ثنائية المرحلة استجابة للتعرض للضوء المتحكم فيه أن تصلب المواد الحيوية بالتحكم المكاني والزماني. سخرت العديد من الدراسات هذه التقنية لتقييم تفاعلات مصفوفة الخلية في منصات مختلفة5،8،9،10،11،21<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور آدم فاينبرغ (جامعة كارنيجي ميلون) وأولئك الذين استضافوا ورشة عمل 3D Bioprinting مفتوحة المصدر. جعل هؤلاء الأفراد من الممكن تعلم تقنيات الطباعة الحيوية الطازجة وبناء طابعة حيوية 3D المستخدمة في هذه الدراسات. بالإضافة إلى ذلك ، يود المؤلفون الاعتراف Biorender.com ، الذي تم استخدامه لإنتاج أشكال في هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل مجموعات متعددة أو مصادر تمويل بما في ذلك مؤسسة مجتمع روز (DDH و CMM) ، وجائزة كولورادو لأبحاث أمراض الأوعية الدموية الرئوية (DDH و CMM) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم بموجب جائزة 1941401 (CMM) ، وإدارة الجيش بموجب الجائزة W81XWH-20-1-0037 (CMM) ، والمعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب جائزة R21 CA252172 (CMM) ، مركز عائلة لودمان لأبحاث صحة المرأة في الحرم الجامعي الطبي بجامعة كولورادو أنشوتز (DDH و CMM) ، والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب جوائز R01 HL080396 (CMM) و R01 HL153096 (CMM) و F31 HL151122 (DDH) و T32 HL072738 (DDH و AT).
Materials
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
Referências
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
- Lin, N. Y. C., et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).
- Grigoryan, B., et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 364 (6439), 458-464 (2019).
- Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. 3D bioprinting of tumor models for cancer research. ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).
- Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. 3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension. Biofabrication. 15 (1), (2022).
- Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).
- Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication. APL Bioengineering. 5 (1), 010904 (2021).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).
- Saleh, K. S., et al. Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis. Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nature Communications. 3, 792 (2012).
- Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments. Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator. Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Habiel, D. M., Hogaboam, C. Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 5, 2 (2014).
- Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension. The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).
- Li, M., et al. Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension. The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Brown, T. E., et al. Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions. Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).
- Ondeck, M. G., et al. Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).
- Caliari, S. R., et al. Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation. Scientific Reports. 6, 21387 (2016).
- Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).
- Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H. Mechanosensing and fibrosis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 74-84 (2018).
- Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).
- Caracena, T., et al. Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models. Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).
- Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).
- Kruse, C. R., et al. The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study. Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).
- Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. Advanced Healthcare Materials. , e1500758 (2023).
- Matthiesen, I., et al. Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels. Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871 (2023).
- Xu, L., et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing. Materials Today Bio. 18, 100550 (2023).
- Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. 3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation. Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047 (2022).
