3D-биопечать фотонастраиваемых гидрогелей для изучения активации фибробластов
Summary
В данной статье описывается, как выполнить 3D-биопечать фотонастраиваемых гидрогелей для изучения жесткости внеклеточного матрикса и активации фибробластов.
Abstract
Фотонастраиваемые гидрогели могут трансформироваться пространственно и во времени в ответ на воздействие света. Включение этих типов биоматериалов в платформы клеточных культур и динамический запуск изменений, таких как увеличение жесткости микросреды, позволяет исследователям моделировать изменения во внеклеточном матриксе (ВКМ), которые происходят во время прогрессирования фиброзного заболевания. Представлен метод 3D-биопечати фотонастраиваемого гидрогелевого биоматериала, способного к двум последовательным реакциям полимеризации в ванне с желатиновой подложкой. Техника биопечати Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) была адаптирована путем регулировки pH опорной ванны для облегчения реакции присоединения по Майклу. Во-первых, биочернила, содержащие полиэтиленгликоль-альфа-метакрилат (ПЭГαМА), реагировали вне стехиометрии с клеточным разлагаемым сшивающим агентом с образованием мягких гидрогелей. Эти мягкие гидрогели позже подвергались воздействию фотоинициатора и света, чтобы вызвать гомополимеризацию непрореагировавших групп и сделать гидрогель более жестким. Этот протокол охватывает синтез гидрогеля, 3D-биопечать, фоторестирирование и характеризацию конечных точек для оценки активации фибробластов в 3D-структурах. Представленный здесь метод позволяет исследователям напечатать на 3D-принтере различные материалы, которые подвергаются реакциям полимеризации, катализируемым pH, и может быть реализован для создания различных моделей тканевого гомеостаза, заболеваний и репарации.
Introduction
3D-биопечать — это революционная технология, которая позволяет исследователям точно депонировать клетки и биоматериалы в 3D-объемах и воссоздавать сложную иерархическую структуру биологических тканей. За последнее десятилетие достижения в области 3D-биопечати позволили создать биющиеся сердечные тканичеловека1, функциональные модели тканей почек2, модели газообмена в легких3 и модели опухолей для исследования рака4. Изобретение встроенных методов 3D-биопечати, таких как реверсивное встраивание взвешенных гидрогелевых биопринтов Freeform (FRESH), позволило воспроизвести в 3D сложные структуры мягких тканей, такие как легочные кровеносные сосуды5 и даже человеческое сердце6 . 3D-биопечать FRESH облегчает послойную печать мягких и маловязких биочернил путем экструзии в поддерживающей ванне для разбавления сдвига. Опорная ванна состоит из такого материала, как плотно упакованные микрочастицы желатина, которые действуют как пластик Бингама и сохраняют заданную форму и структуру биочернил после печати. После того, как напечатанная конструкция затвердеет, опорную ванну можно растворить, повысив температуру до 37 °C7.
В недавней обзорной статье были обобщены материалы, которые были напечатаны на 3D-принтере в различных изданиях с использованием техники FRESH. Эти материалы природного происхождения варьируются от коллагена I типа до метакрилированной гиалуроновой кислоты и представляют собой несколько различных механизмов гелеобразования7. В большинстве исследований, проведенных с использованием этой техники 3D-биопечати, используются статические биоматериалы, которые не изменяются в ответ на внешние раздражители. Динамические фотонастраиваемые гидрогелевые биоматериалы были использованы нашей лабораторией и другими лабораториями 8,9,10,11,12 для моделирования различных фиброзных заболеваний. В отличие от статических биоматериалов, фотонастраиваемые биочернила позволяют создать размягченную модель с более низким значением модуля упругости, а затем сделать ее более жесткой для изучения клеточных реакций на увеличение жесткости в микросреде.
Фиброзные заболевания характеризуются увеличением выработки внеклеточного матрикса, что может вызвать рубцевание и скованность13. Огрубение тканей может инициировать дальнейшее повреждение и разрушение пораженных тканей, вызывая необратимое повреждение органов и даже смерть; Фиброзные заболевания являются причиной одной трети смертности во всем мире. Фибробласты продуцируют избыточный и аберрантный внеклеточный матрикс в этом болезненном состоянии14,15. Повышенная пролиферация фибробластов и отложение внеклеточного матрикса еще больше укрепляют ткань и активируют профибротическую петлю положительной обратной связи16,17,18,19. Изучение активации фибробластов имеет жизненно важное значение для понимания фиброзных заболеваний. Здесь мы представляем легочную артериальную гипертензию (ЛАГ) человека в качестве примера одного фиброзного заболевания, при котором важно имитировать 3D-геометрию кровеносного сосуда с помощью 3D-биопечати и внедрять динамические возможности жесткости фотонастраиваемых гидрогелей. ЛАГ – это состояние, при котором давление в основных легочных артериях превышает нормальный уровень и оказывает давление на сердце, увеличивая активацию адвентициальных фибробластов легочной артерии человека (HPAAF) и укрепляя ткани кровеносных сосудов16,17,18,19. Фотонастраиваемая формула биочернил на основе полиэтиленгликоля-альфа-метакрилата (ПЭГαМА) обеспечивает временное затвердевание конструкций и помогает моделировать как здоровые ткани, так и прогрессирование заболевания 5,8,9,10. Использование этой уникальной функции позволяет количественно оценить активацию и пролиферацию HPAAF в ответ на усиление микросреды в 3D и может дать ценную информацию о клеточных механизмах, участвующих в этом заболевании. Описанный здесь протокол позволит исследователям создавать 3D-модели, которые повторяют изменения во внеклеточном микроокружении во время прогрессирования заболевания или восстановления тканей и изучают активацию фибробластов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Двухступенчатые реакции полимеризации в ответ на контролируемое воздействие света могут придать жесткость биоматериалам с пространственным и временным контролем. В нескольких исследованиях этот метод использовался для оценки взаимодействия клетки с матриксом на различных платфор?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность доктору Адаму Файнбергу (Университет Карнеги-Меллона) и тем, кто провел семинар по 3D-биопечати с открытым исходным кодом. Эти люди позволили изучить методы биопечати FRESH и построить 3D-биопринтер, используемый для этих исследований. Кроме того, авторы хотели бы выразить признательность Biorender.com, которая была использована для создания рисунков в этой рукописи. Эта работа была поддержана несколькими группами или источниками финансирования, включая Фонд сообщества Роуз (DDH и CMM), Колорадскую премию за исследования легочных сосудистых заболеваний (DDH и CMM), Национальный научный фонд в рамках Премии 1941401 (CMM), Министерство армии США в рамках Гранта W81XWH-20-1-0037 (CMM), Национальный институт рака NIH в рамках Гранта R21 CA252172 (CMM), Центр исследований женского здоровья семьи Людеман в медицинском кампусе Аншутц Университета Колорадо (DDH и CMM), Национальный институт сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения в рамках грантов R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) и T32 HL072738 (DDH и AT).
Materials
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
Referências
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
- Lin, N. Y. C., et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).
- Grigoryan, B., et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 364 (6439), 458-464 (2019).
- Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. 3D bioprinting of tumor models for cancer research. ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).
- Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. 3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension. Biofabrication. 15 (1), (2022).
- Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).
- Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication. APL Bioengineering. 5 (1), 010904 (2021).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).
- Saleh, K. S., et al. Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis. Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nature Communications. 3, 792 (2012).
- Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments. Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator. Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Habiel, D. M., Hogaboam, C. Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 5, 2 (2014).
- Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension. The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).
- Li, M., et al. Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension. The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Brown, T. E., et al. Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions. Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).
- Ondeck, M. G., et al. Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).
- Caliari, S. R., et al. Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation. Scientific Reports. 6, 21387 (2016).
- Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).
- Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H. Mechanosensing and fibrosis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 74-84 (2018).
- Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).
- Caracena, T., et al. Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models. Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).
- Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).
- Kruse, C. R., et al. The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study. Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).
- Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. Advanced Healthcare Materials. , e1500758 (2023).
- Matthiesen, I., et al. Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels. Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871 (2023).
- Xu, L., et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing. Materials Today Bio. 18, 100550 (2023).
- Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. 3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation. Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047 (2022).
