Bu makale, hücre dışı matris sertleşmesini ve fibroblast aktivasyonunu incelemek için fototize edilebilir hidrojellerin 3D biyo-baskısının nasıl yapılacağını açıklamaktadır.
Fototize olabilen hidrojeller, ışığa maruz kalmaya yanıt olarak uzamsal ve zamansal olarak dönüşebilir. Bu tür biyomalzemelerin hücre kültürü platformlarına dahil edilmesi ve mikroçevresel sertliğin arttırılması gibi değişikliklerin dinamik olarak tetiklenmesi, araştırmacıların fibrotik hastalığın ilerlemesi sırasında meydana gelen hücre dışı matristeki (ECM) değişiklikleri modellemelerini sağlar. Burada, bir jelatin destek banyosu içinde iki ardışık polimerizasyon reaksiyonu gerçekleştirebilen, fototize edilebilir bir hidrojel biyomalzemenin 3D biyo-baskısı için bir yöntem sunulmaktadır. Askıda Hidrojellerin Serbest Biçimli Tersinir Gömülmesi (FRESH) biyo-baskı tekniği, bir Michael ekleme reaksiyonunu kolaylaştırmak için destek banyosunun pH’ı ayarlanarak uyarlandı. İlk olarak, poli(etilen glikol)-alfa metakrilat (PEGαMA) içeren biyomürekkep, yumuşak hidrojeller oluşturmak için hücrede parçalanabilen bir çapraz bağlayıcı ile stokiyometri dışı reaksiyona sokuldu. Bu yumuşak hidrojeller daha sonra reaksiyona girmemiş grupların homopolimerizasyonunu indüklemek ve hidrojeli sertleştirmek için fotoinitatör ve ışığa maruz bırakıldı. Bu protokol, 3D yapılar içinde fibroblast aktivasyonunu değerlendirmek için hidrojel sentezi, 3D biyo-baskı, fotosertleştirme ve son nokta karakterizasyonlarını kapsar. Burada sunulan yöntem, araştırmacıların pH katalizli polimerizasyon reaksiyonlarına giren çeşitli malzemeleri 3D biyo-baskı yapmalarını sağlar ve çeşitli doku homeostazı, hastalık ve onarım modellerini tasarlamak için uygulanabilir.
3D biyobaskı, araştırmacıların hücreleri ve biyomalzemeleri 3D hacimler içinde hassas bir şekilde biriktirmelerini ve biyolojik dokuların karmaşık hiyerarşik yapısını yeniden oluşturmalarını sağlayan dönüştürücü bir teknolojidir. Son on yılda, 3D biyo-baskıdaki gelişmeler, atan insan kalp dokuları 1, böbrek dokularınınfonksiyonel modelleri2, akciğer içindeki gaz değişimi modelleri3 ve kanser araştırmaları için tümör modelleri4 yarattı. Askıda Hidrojelin Serbest Biçimli Tersinir Gömülmesi (FRESH) biyo-baskı gibi gömülü 3D biyo-baskı tekniklerinin icadı, pulmoner kan damarları5 ve hatta insan kalbi6 gibi karmaşık yumuşak doku yapılarının 3D olarak yeniden üretilmesini mümkün kılmıştır. FRESH 3D biyobaskı, yumuşak ve düşük viskoziteli biyomürekkeplerin bir kesme inceltme destek banyosuna ekstrüzyon yoluyla katman katman basılmasını kolaylaştırır. Destek banyosu, bir Bingham plastiği görevi gören ve baskıdan sonra biyomürekkebin amaçlanan şeklini ve yapısını koruyan, sıkıca paketlenmiş jelatin mikropartiküller gibi bir malzemeden oluşur. Basılı yapı katılaştıktan sonra, destek banyosu sıcaklık 37 °C’ye yükseltilerek çözülebilir7.
Yakın tarihli bir inceleme makalesi, FRESH tekniği kullanılarak çeşitli yayınlarda 3D biyo-basılmış materyalleri özetledi. Bu doğal olarak elde edilen malzemeler, kollajen tip I’den metakrillenmiş hyaluronik aside kadar çeşitlilik gösterir ve birkaç farklı jelleşme mekanizmasını temsil eder7. Bu 3D biyo-baskı tekniği kullanılarak gerçekleştirilen çoğu araştırma çalışması, dış uyaranlara yanıt olarak değişmeyen statik biyomalzemeler kullanır. Dinamik fototable hidrojel biyomalzemeler, laboratuvarımız ve diğerleri 8,9,10,11,12 tarafından çeşitli fibrotik hastalıkları modellemek için kullanılmıştır. Statik biyomalzemelerin aksine, fototize edilebilen biyomürekkepler, daha düşük elastik modül değerine sahip yumuşatılmış bir modelin oluşturulmasına ve daha sonra mikroçevresel sertleşmedeki artışlara hücresel tepkileri keşfetmek için sertleştirilmesine izin verir.
Fibrotik hastalıklar, yara izi ve sertleşmeye neden olabilen hücre dışı matriks üretiminde bir artış ile karakterizedir13. Doku sertleşmesi, etkilenen dokunun daha fazla yaralanmasını ve tahribatını başlatarak kalıcı organ hasarına ve hatta ölüme neden olabilir; Fibrotik bozukluklar dünya çapında mortalitenin üçte birinden sorumludur. Fibroblastlar bu hastalık durumunda aşırı ve anormal hücre dışı matriks üretir14,15. Artan fibroblast proliferasyonu ve hücre dışı matriks birikimi dokuyu daha da sertleştirir ve profibrotik pozitif geri besleme döngüsünü aktive eder16,17,18,19. Fibroblast aktivasyonunu incelemek, fibrotik hastalıkları anlamak için hayati önem taşır. Burada, insan pulmoner arteriyel hipertansiyonunu (PAH), 3D biyobaskı kullanarak kan damarının 3D geometrisini taklit etmenin ve fototable hidrojellerin dinamik sertleştirme yeteneklerini tanıtmanın önemli olduğu bir fibrotik bozukluğa örnek olarak sunuyoruz. PAH, ana pulmoner arterlerdeki basıncın normal seviyeleri aştığı ve kalbe baskı uyguladığı, insan pulmoner arter adventisyel fibroblast (HPAAF) aktivasyonunu arttırdığı ve kan damarı dokularını sertleştirdiği bir durumdur16,17,18,19. Fototize edilebilir bir poli (etilen glikol) -alfa metakrilat (PEGαMA) biyomürekkep formülasyonu, yapılarda zamansal sertleşmeye izin verir ve hem sağlıklı doku hem de hastalık ilerlemesini modellemeye yardımcı olur 5,8,9,10. Bu benzersiz özellikten yararlanmak, 3D’de mikroçevresel sertleşmeye yanıt olarak HPAAF aktivasyonunun ve proliferasyonunun ölçülmesini sağlar ve bu hastalıkta yer alan hücresel mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Burada açıklanan protokol, araştırmacıların hastalığın ilerlemesi veya doku onarımı sırasında hücre dışı mikro ortamdaki değişiklikleri özetleyen ve fibroblast aktivasyonunu inceleyen 3D modeller oluşturmasına olanak sağlayacaktır.
Kontrollü ışığa maruz kalmaya yanıt olarak çift aşamalı polimerizasyon reaksiyonları, biyomalzemeleri uzamsal ve zamansal kontrol ile sertleştirebilir. Çeşitli platformlarda hücre-matris etkileşimlerini değerlendirmek için bu tekniği kullananbirkaç çalışma vardır 5,8,9,10,11,21,22,23<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Dr. Adam Feinberg’e (Carnegie Mellon Üniversitesi) ve 3D Biyobaskı Açık Kaynak Çalıştayı’na ev sahipliği yapanlara teşekkür eder. Bu kişiler, FRESH biyobaskı tekniklerini öğrenmeyi ve bu çalışmalar için kullanılan 3D biyoyazıcıyı oluşturmayı mümkün kıldı. Ek olarak, yazarlar bu yazıda figürler üretmek için kullanılan Biorender.com teşekkür etmek isterler. Bu çalışma, Rose Community Foundation (DDH ve CMM), Colorado Pulmoner Vasküler Hastalık Araştırma Ödülü (DDH ve CMM), Ödül 1941401 kapsamındaki Ulusal Bilim Vakfı (CMM), W81XWH-20-1-0037 (CMM) Ödülü altındaki Ordu Departmanı, R21 CA252172 Ödülü (CMM) kapsamında NIH Ulusal Kanser Enstitüsü, Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü’ndeki (DDH ve CMM) Ludeman Aile Kadın Sağlığı Araştırmaları Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) ve T32 HL072738 (DDH ve AT).
AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
Incubator | VWR | VWR51014991 | |
LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
Rocker | VWR | 10127-876 | |
Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
Rubber Band | Staples | 808659 | |
Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |