Bio-impression 3D d’hydrogels photoaccordables pour étudier l’activation des fibroblastes
Summary
Cet article décrit comment bio-imprimer en 3D des hydrogels photoaccordables pour étudier le raidissement de la matrice extracellulaire et l’activation des fibroblastes.
Abstract
Les hydrogels photoaccordables peuvent se transformer spatialement et temporellement en réponse à l’exposition à la lumière. L’incorporation de ces types de biomatériaux dans des plateformes de culture cellulaire et le déclenchement dynamique de changements, tels que l’augmentation de la rigidité microenvironnementale, permettent aux chercheurs de modéliser les changements dans la matrice extracellulaire (MEC) qui se produisent au cours de la progression de la maladie fibrotique. Dans cet article, une méthode de bio-impression 3D d’un biomatériau hydrogel photoaccordable capable de deux réactions de polymérisation séquentielles dans un bain de support de gélatine est présentée. La technique de bio-impression FRESH (Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels) a été adaptée en ajustant le pH du bain de support pour faciliter une réaction d’addition de Michael. Tout d’abord, la bio-encre contenant du méthacrylate de poly(éthylène glycol)-alpha (PEGαMA) a réagi hors stœchiométrie avec un agent de réticulation dégradable par cellule pour former des hydrogels mous. Ces hydrogels mous ont ensuite été exposés à un photo-initateur et à la lumière pour induire l’homopolymérisation des groupes qui n’ont pas réagi et rigidifier l’hydrogel. Ce protocole couvre la synthèse d’hydrogel, la bio-impression 3D, le phototiffening et la caractérisation des paramètres pour évaluer l’activation des fibroblastes dans les structures 3D. La méthode présentée ici permet aux chercheurs de bio-imprimer en 3D une variété de matériaux qui subissent des réactions de polymérisation catalysées par le pH et pourraient être mis en œuvre pour concevoir divers modèles d’homéostasie, de maladie et de réparation des tissus.
Introduction
La bio-impression 3D est une technologie transformatrice qui permet aux chercheurs de déposer avec précision des cellules et des biomatériaux dans des volumes 3D et de recréer la structure hiérarchique complexe des tissus biologiques. Au cours de la dernière décennie, les progrès de la bio-impression 3D ont permis de créer des tissus cardiaques humains battants1, des modèles fonctionnels des tissus rénaux2, des modèles d’échange gazeux dans les poumons3 et des modèles tumoraux pour la recherche sur le cancer4. L’invention des techniques de bio-impression 3D embarquée, telles que la bio-impression FRESH (Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel), a permis de reproduire des structures complexes de tissus mous telles que les vaisseaux sanguins pulmonaires5 et même le cœur humain6 en 3D. La bio-impression 3D FRESH facilite l’impression couche par couche de bio-encres souples et à faible viscosité par extrusion dans un bain de support de cisaillement. Le bain de support est constitué d’un matériau tel que des microparticules de gélatine compactes qui agissent comme un plastique Bingham et maintiennent la forme et la structure prévues de la bio-encre après l’impression. Une fois que la construction imprimée s’est solidifiée, le bain de support peut être dissous en augmentant la température à 37 °C7.
Un article de synthèse récent a résumé les matériaux qui ont été bio-imprimés en 3D dans diverses publications à l’aide de la technique FRESH. Ces matériaux d’origine naturelle vont du collagène de type I à l’acide hyaluronique méthacrylé et représentent plusieurs mécanismes de gélification différents7. La plupart des études de recherche réalisées à l’aide de cette technique de bio-impression 3D utilisent des biomatériaux statiques qui ne changent pas en réponse à des stimuli externes. Des biomatériaux hydrogels photoaccordables dynamiques ont été utilisés par notre laboratoire et d’autres 8,9,10,11,12 pour modéliser une variété de maladies fibrotiques. Contrairement aux biomatériaux statiques, les bioencres photoaccordables permettent de créer un modèle ramolli avec une valeur de module d’élasticité plus faible, puis de le rigidifier pour explorer les réponses cellulaires à l’augmentation du raidissement microenvironnemental.
Les maladies fibrotiques sont caractérisées par une augmentation de la production de matrice extracellulaire qui peut provoquer des cicatrices et des raidissements13. Le raidissement des tissus peut entraîner d’autres blessures et la destruction des tissus touchés, causant des dommages permanents aux organes et même la mort ; Les troubles fibrotiques sont responsables d’un tiers de la mortalité dans le monde. Les fibroblastes produisent une matrice extracellulaire excessive et aberrante dans cet état pathologique14,15. L’augmentation de la prolifération des fibroblastes et le dépôt de matrice extracellulaire rigidifient davantage le tissu et activent une boucle de rétroaction positive profibrotique16,17,18,19. L’étude de l’activation des fibroblastes est essentielle à la compréhension des maladies fibrotiques. Nous présentons ici l’hypertension artérielle pulmonaire humaine (HTAP) comme un exemple d’un trouble fibrotique dans lequel il est important d’imiter la géométrie 3D du vaisseau sanguin à l’aide de la bio-impression 3D et d’introduire les capacités de raidissement dynamique des hydrogels photoaccordables. L’HTAP est une affection dans laquelle la pression dans les artères pulmonaires principales dépasse les niveaux normaux et exerce une pression sur le cœur, augmentant l’activation des fibroblastes adventiaux de l’artère pulmonaire humaine (HPAAF) et rigidifiant les tissus des vaisseaux sanguins16,17,18,19. Une formulation de bio-encre à base de poly(éthylène glycol)-alpha méthacrylate (PEGαMA) photoréglable permet un raidissement temporel des constructions et aide à modéliser à la fois les tissus sains et la progression de la maladie 5,8,9,10. L’exploitation de cette caractéristique unique permet de quantifier l’activation et la prolifération de HPAAF en réponse au raidissement microenvironnemental en 3D et peut fournir des informations précieuses sur les mécanismes cellulaires impliqués dans cette maladie. Le protocole décrit ici permettra aux chercheurs de créer des modèles 3D qui récapitulent les changements dans le microenvironnement extracellulaire au cours de la progression de la maladie ou de la réparation tissulaire et d’étudier l’activation des fibroblastes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les réactions de polymérisation en deux étapes en réponse à une exposition contrôlée à la lumière peuvent rigidifier les biomatériaux avec un contrôle spatial et temporel. Plusieurs études ont exploité cette technique pour évaluer les interactions cellule-matrice dans diverses plateformes 5,8,9,10,11,21,22,23.<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Adam Feinberg (Université Carnegie Mellon) et ceux qui ont organisé l’atelier 3D Bio-Printing Open-Source. Ces personnes ont permis d’apprendre les techniques de bio-impression FRESH et de construire la bio-imprimante 3D utilisée pour ces études. De plus, les auteurs tiennent à remercier Biorender.com, qui a été utilisé pour produire des figures dans ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par de multiples groupes ou sources de financement, notamment la Rose Community Foundation (DDH et CMM), une bourse de recherche sur les maladies vasculaires pulmonaires du Colorado (DDH et CMM), la National Science Foundation sous le prix 1941401 (CMM), le ministère de l’Armée sous le prix W81XWH-20-1-0037 (CMM), le National Cancer Institute du NIH sous le prix R21 CA252172 (CMM), le Ludeman Family Center for Women’s Health Research du campus médical Anschutz de l’Université du Colorado (DDH et CMM), l’Institut national du cœur, des poumons et du sang des National Institutes of Health dans le cadre des prix R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) et T32 HL072738 (DDH et AT).
Materials
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
Referências
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