3D-Bioprinting von phototunbaren Hydrogelen zur Untersuchung der Fibroblastenaktivierung
Summary
In diesem Artikel wird beschrieben, wie phototunbare Hydrogele in 3D biogedruckt werden, um die Versteifung der extrazellulären Matrix und die Aktivierung von Fibroblasten zu untersuchen.
Abstract
Phototunbare Hydrogele können sich als Reaktion auf Lichteinwirkung räumlich und zeitlich verändern. Die Integration dieser Art von Biomaterialien in Zellkulturplattformen und das dynamische Auslösen von Veränderungen, wie z. B. die Erhöhung der Steifigkeit der Mikroumgebung, ermöglicht es den Forschern, Veränderungen in der extrazellulären Matrix (EZM) zu modellieren, die während des Fortschreitens der fibrotischen Erkrankung auftreten. Hierin wird ein Verfahren zum 3D-Bioprinting eines phototunbaren Hydrogel-Biomaterials vorgestellt, das in der Lage ist, zwei aufeinanderfolgende Polymerisationsreaktionen innerhalb eines Gelatineträgerbades durchzuführen. Die Technik des FRESH-Bioprintings (Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels) wurde angepasst, indem der pH-Wert des Stützbades angepasst wurde, um eine Michael-Additionsreaktion zu ermöglichen. Zunächst wurde die Biotinte, die Poly(ethylenglykol)-alphamethacrylat (PEGαMA) enthielt, außerhalb der Stöchiometrie mit einem zellabbaubaren Vernetzer umgesetzt, um weiche Hydrogele zu bilden. Diese weichen Hydrogele wurden später Photoinitator und Licht ausgesetzt, um die Homopolymerisation nicht umgesetzter Gruppen zu induzieren und das Hydrogel zu versteifen. Dieses Protokoll umfasst die Hydrogelsynthese, das 3D-Bioprinting, die Photoversteifung und die Charakterisierung von Endpunkten zur Beurteilung der Fibroblastenaktivierung in 3D-Strukturen. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es Forschern, eine Vielzahl von Materialien, die pH-katalysierten Polymerisationsreaktionen durchlaufen, in 3D zu drucken und könnten zur Entwicklung verschiedener Modelle der Gewebehomöostase, -krankheit und -reparatur eingesetzt werden.
Introduction
3D-Bioprinting ist eine transformative Technologie, die es Forschern ermöglicht, Zellen und Biomaterialien präzise in 3D-Volumina abzulegen und die komplexe hierarchische Struktur biologischer Gewebe nachzubilden. In den letzten zehn Jahren haben Fortschritte im 3D-Bioprinting schlagendes menschliches Herzgewebe1, Funktionsmodelle von Nierengewebe2, Modelle des Gasaustauschs in der Lunge3 und Tumormodelle für die Krebsforschung4 hervorgebracht. Die Erfindung eingebetteter 3D-Bioprinting-Techniken, wie z. B. das Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH) Bioprinting, hat es ermöglicht, komplexe Weichteilstrukturen wie Lungenblutgefäße5 und sogar das menschliche Herz6 in 3D zu reproduzieren. Der FRESH 3D-Biodruck ermöglicht den schichtweisen Druck von weichen und niedrigviskosen Biotinten durch Extrusion in ein scherverdünnendes Stützbad. Das Trägerbad besteht aus einem Material, wie z. B. dicht gepackten Gelatine-Mikropartikeln, die als Bingham-Kunststoff fungieren und die beabsichtigte Form und Struktur der Biotinte nach dem Druck beibehalten. Sobald das gedruckte Konstrukt erstarrt ist, kann das Stützbad durch Erhöhung der Temperatur auf 37 °Cweggelöst werden 7.
In einem kürzlich erschienenen Übersichtsartikel wurden die Materialien zusammengefasst, die in verschiedenen Publikationen mit der FRESH-Technik in 3D biogedruckt wurden. Diese natürlich gewonnenen Materialien reichen von Kollagen Typ I bis hin zu methacrylierter Hyaluronsäure und repräsentieren verschiedene Gelierungsmechanismen7. Die meisten Forschungsstudien, die mit dieser 3D-Bioprinting-Technik durchgeführt werden, verwenden statische Biomaterialien, die sich als Reaktion auf äußere Reize nicht verändern. Dynamische, phototunbare Hydrogel-Biomaterialien wurden von unserem Labor und anderen 8,9,10,11,12 verwendet, um eine Vielzahl von fibrotischen Erkrankungen zu modellieren. Im Gegensatz zu statischen Biomaterialien ermöglichen phototunable Biotinten die Erstellung eines weichgezeichneten Modells mit niedrigerem Elastizitätsmodulwert und späterer Versteifung, um zelluläre Reaktionen auf eine Zunahme der Versteifung der Mikroumgebung zu untersuchen.
Fibrotische Erkrankungen sind gekennzeichnet durch eine Zunahme der Produktion der extrazellulären Matrix, die zu Narbenbildung und Versteifung führen kann13. Eine Versteifung des Gewebes kann weitere Verletzungen und Zerstörungen des betroffenen Gewebes auslösen, was zu dauerhaften Organschäden und sogar zum Tod führen kann. Fibrotische Erkrankungen sind weltweit für ein Drittel der Sterblichkeit verantwortlich. Fibroblasten produzieren in diesem Krankheitszustand überschüssige und abnorme extrazelluläre Matrix14,15. Erhöhte Fibroblastenproliferation und extrazelluläre Matrixablagerung versteifen das Gewebe weiter und aktivieren eine profibrotische positive Rückkopplungsschleife16,17,18,19. Die Untersuchung der Aktivierung von Fibroblasten ist für das Verständnis fibrotischer Erkrankungen von entscheidender Bedeutung. Hier stellen wir die humane pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) als Beispiel für eine fibrotische Erkrankung vor, bei der es wichtig ist, die 3D-Geometrie des Blutgefäßes mittels 3D-Bioprinting nachzuahmen und die dynamischen Versteifungsfähigkeiten von phototunbaren Hydrogelen vorzustellen. PAH ist eine Erkrankung, bei der der Druck in den Hauptpulmonalarterien über das normale Niveau hinausgeht und das Herz belastet, wodurch die Aktivierung der adventitialen Fibroblasten der menschlichen Lungenarterie (HPAAF) erhöht und das Blutgefäßgewebe versteiftwird 16,17,18,19. Eine phototunbare Poly(ethylenglykol)-alpha-methacrylat (PEGαMA)-Biotintenformulierung ermöglicht eine zeitliche Versteifung in Konstrukten und hilft bei der Modellierung von gesundem Gewebe und dem Fortschreiten der Krankheit 5,8,9,10. Die Ausnutzung dieser einzigartigen Eigenschaft ermöglicht die Quantifizierung der HPAAF-Aktivierung und -Proliferation als Reaktion auf die Versteifung der Mikroumgebung in 3D und könnte wertvolle Einblicke in die zellulären Mechanismen liefern, die an dieser Krankheit beteiligt sind. Das hier beschriebene Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, 3D-Modelle zu erstellen, die Veränderungen in der extrazellulären Mikroumgebung während des Fortschreitens der Krankheit oder der Gewebereparatur rekapitulieren und die Aktivierung von Fibroblasten untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zweistufige Polymerisationsreaktionen als Reaktion auf kontrollierte Lichtexposition können Biomaterialien räumlich und zeitlich kontrollierend versteifen. Mehrere Studien haben diese Technik genutzt, um Zell-Matrix-Interaktionen auf verschiedenen Plattformen zu bewerten 5,8,9,10,11,21,22,23.</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) und den Gastgebern des Open-Source-Workshops zum Thema 3D-Bioprinting. Diese Personen ermöglichten es, die Techniken des FRESH-Bioprintings zu erlernen und den 3D-Biodrucker zu bauen, der für diese Studien verwendet wurde. Darüber hinaus möchten die Autoren Biorender.com würdigen, die für die Herstellung von Abbildungen in diesem Manuskript verwendet wurden. Diese Arbeit wurde von mehreren Gruppen oder Finanzierungsquellen unterstützt, darunter die Rose Community Foundation (DDH und CMM), ein Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH und CMM), die National Science Foundation unter Award 1941401 (CMM), das Department of the Army unter dem Award W81XWH-20-1-0037 (CMM), das National Cancer Institute der NIH unter dem Award R21 CA252172 (CMM), das Ludeman Family Center for Women’s Health Research am Anschutz Medical Campus der University of Colorado (DDH und CMM), das National Heart, Lung, and Blood Institute der National Institutes of Health unter den Auszeichnungen R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) und T32 HL072738 (DDH und AT).
Materials
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
Referências
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