線維芽細胞の活性化を研究するための3Dバイオプリンティング用フォトチューナブルハイドロゲル
Summary
本稿では、フォトチューナブルハイドロゲルを3Dバイオプリントして、細胞外マトリックスの硬化と線維芽細胞の活性化を研究する方法について説明します。
Abstract
フォトチューナブルハイドロゲルは、光曝露に応答して空間的および時間的に変化します。これらのタイプの生体材料を細胞培養プラットフォームに組み込み、微小環境の剛性を高めるなどの変化を動的に引き起こすことで、研究者は線維性疾患の進行中に発生する細胞外マトリックス(ECM)の変化をモデル化することができます。本明細書では、ゼラチン支持体浴内で2つの連続重合反応が可能な光可変ヒドロゲル生体材料を3Dバイオプリンティングする方法を提示する。懸濁ハイドロゲルのフリーフォーム可逆的包埋(FRESH)バイオプリンティングの手法は、マイケル付加反応を促進するためにサポートバスのpHを調整することによって適応されました。まず、ポリ(エチレングリコール)-αメタクリレート(PEGαMA)を含むバイオインクを非化学量論的に細胞分解性架橋剤と反応させ、ソフトハイドロゲルを形成しました。これらの軟質ハイドロゲルは、後に光開始剤と光に曝露され、未反応基のホモ重合を誘導し、ヒドロゲルを硬くしました。このプロトコルは、ハイドロゲル合成、3Dバイオプリンティング、光硬化、および3D構造内の線維芽細胞の活性化を評価するためのエンドポイントの特性評価をカバーしています。今回紹介する手法により、研究者はpH触媒による重合反応を起こすさまざまな材料を3Dバイオプリントすることができ、組織の恒常性、疾患、修復のさまざまなモデルを設計するために実装することができます。
Introduction
3Dバイオプリンティングは、研究者が細胞や生体材料を3Dボリューム内に正確に堆積させ、生体組織の複雑な階層構造を再現することを可能にする革新的な技術です。過去10年間で、3Dバイオプリンティングの進歩により、鼓動するヒト心臓組織1、腎臓組織の機能モデル2、肺内のガス交換モデル3、がん研究用の腫瘍モデル4が作成されました。懸濁ハイドロゲルのフリーフォーム可逆埋め込み(FRESH)バイオプリンティングなどの組み込み3Dバイオプリンティング技術の発明により、肺血管5 やヒトの心臓6 などの複雑な軟部組織構造を3Dで再現することが可能になりました。 FRESH 3Dバイオプリンティングは、せん断希釈サポートバスへの押し出しにより、軟質および低粘度のバイオインクの層ごとの印刷を容易にします。サポートバスは、ビンガムプラスチックとして機能し、印刷後にバイオインクの意図した形状と構造を維持する、密集したゼラチン微粒子などの材料で構成されています。プリントされた構造物が固まったら、温度を37°Cに上げることでサポートバスを溶解することができます7。
最近の総説では、FRESH技術を使用してさまざまな出版物で3Dバイオプリントされた材料がまとめられています。これらの天然由来の物質は、I型コラーゲンからメタクリル化ヒアルロン酸まで多岐にわたり、いくつかの異なるゲル化メカニズムを表しています7。この3Dバイオプリンティング技術を使用して行われるほとんどの調査研究は、外部刺激に反応して変化しない静的な生体材料を使用しています。動的光可変ハイドロゲル生体材料は、さまざまな線維性疾患をモデル化するために、私たちの研究室や他の研究室で使用されています8,9,10,11,12。静的な生体材料とは異なり、光可変バイオインクでは、弾性率の低い軟化モデルを作成し、後で硬化させて、微小環境硬化の増加に対する細胞応答を調べることができます。
線維性疾患は、瘢痕化や硬化を引き起こす可能性のある細胞外マトリックス産生の増加を特徴としています13。組織の硬化は、影響を受けた組織のさらなる損傷と破壊を引き起こし、永久的な臓器損傷や死に至ることさえあります。線維化疾患は、世界の死亡率の3分の1を占めています。線維芽細胞は、この疾患状態で過剰で異常な細胞外マトリックスを産生します14,15。線維芽細胞の増殖の増加および細胞外マトリックスの沈着は、組織をさらに硬化させ、原線維化促進性の正のフィードバックループを活性化する16,17,18,19。線維芽細胞の活性化を研究することは、線維性疾患を理解するために不可欠です。ここでは、ヒト肺動脈性肺高血圧症(PAH)を線維化疾患の例として紹介し、3Dバイオプリンティングを使用して血管の3D形状を模倣し、光波長可変ハイドロゲルの動的硬化能力を紹介します。PAHは、主肺動脈の圧力が正常レベルを超え、心臓に負担がかかり、ヒト肺動脈外膜線維芽細胞(HPAAF)の活性化を増加させ、血管組織を硬化させる状態です16,17,18,19。光可変ポリ(エチレングリコール)-αメタクリレート(PEGαMA)バイオインク製剤は、コンストラクトの経時的な硬化を可能にし、健康な組織と疾患の進行の両方をモデル化するのに役立ちます5,8,9,10。このユニークな特徴を利用することで、微小環境硬化に応答したHPAAFの活性化と増殖を3Dで定量化することができ、この疾患に関与する細胞メカニズムに関する貴重な洞察が得られる可能性があります。ここで説明するプロトコルにより、研究者は、疾患の進行または組織修復中の細胞外微小環境の変化を再現する3Dモデルを作成し、線維芽細胞の活性化を研究することができます。
Protocol
1. PEGαMAの合成と特性評価 注:ポリ(エチレングリコール)-αメタクリレート(PEGαMA)合成は、Hewawasam ら から採用され、水分のない条件下で実施されました9。 反応物の秤量を量ります。注:例えば、5 g 10 kg/mol 8アームPEG-ヒドロキシル(PEG-OH)と0.38 gの水素化ナトリウム(NaH)を秤量します( 材料表を参照)。 250 mLの?…
Representative Results
このプロトコルは、サポートバス内の光可変ヒドロゲルを3Dバイオプリントして、人間の組織を模倣する形状の線維芽細胞の活性化を研究するための動的および一時的な硬化が可能な構造物を作成する方法について説明します。まず、このプロトコルでは、この光可変ポリマー系のバックボーンであるPEGαMAを合成する方法が説明されました。核磁気共鳴(NMR)分光法測定では、96.5%でPEGαMAの官?…
Discussion
制御された光照射に応答する二段重合反応は、空間的および時間的制御によって生体材料を硬化させることができます。いくつかの研究では、この手法を利用して、さまざまなプラットフォーム5、8、9、10、11、21、22、</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Adam Feinberg博士(カーネギーメロン大学)と3Dバイオプリンティングオープンソースワークショップを主催した人々に感謝の意を表したいと思います。これらの人々は、FRESHバイオプリンティングの技術を学び、これらの研究に使用される3Dバイオプリンターを構築することを可能にしました。さらに、著者らは、この原稿の図を作成するために使用された Biorender.com に感謝したいと思います。この研究は、ローズコミュニティ財団(DDHおよびCMM)、コロラド肺血管疾患研究賞(DDHおよびCMM)、全米科学財団賞1941401(CMM)、陸軍省賞W81XWH-20-1-0037(CMM)、米国国立がん研究所(NIH賞R21 CA252172(CMM)など、複数のグループまたは資金源によって支援されました。 コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスのルードマンファミリーセンター(DDHおよびCMM)、国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所(R01 HL080396(CMM)、R01 HL153096(CMM)、F31 HL151122(DDH)、およびT32 HL072738(DDHおよびAT)の賞。
Materials
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
Referências
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Citar este artigo
Tanneberger, A. E., Blair, L., Davis-Hall, D., Magin, C. M. 3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation. J. Vis. Exp. (196), e65639, doi:10.3791/65639 (2023).