Summary
このプロトコルはマウスの肺静脈の顕微鏡検査導かれた隔離そしてimmunofluorescenceの汚損を示す。左心房、肺静脈、および対応する肺を含む組織サンプルを調製し、心臓トロポニンTおよびコネキシン43について染色します。
Abstract
肺静脈(PV)は、心房性不整脈における異所性拍動の主要な原因であり、心房細動(AF)の発症と進行に重要な役割を果たします。PVには、心筋細胞で構成される心筋スリーブ(MS)が含まれています。MSは、異所性電気インパルスを生成する能力など、心臓の働く心筋との類似性を維持するため、AFの開始と維持に関与しています。げっ歯類は広く使用されており、心筋細胞は血管壁全体に広く存在するため、肺静脈心筋を研究するための優れた動物モデルを表す可能性があります。しかし、マウスPVの正確なマイクロダイセクションと調製は、臓器のサイズが小さく、解剖学的構造が複雑なため、困難です。
マウスの左心房(LA)をPVとともに単離するための顕微鏡ガイド下顕微解剖プロトコルを実証します。 心臓トロポニン-T(cTNT)およびコネキシン43(Cx43)抗体を使用して免疫蛍光染色を行い、LAとPVの全長を可視化します。10倍および40倍の倍率でのイメージングは、PV構造の包括的なビューと心筋構造への詳細な洞察を提供し、特にMS内のコネキシン43の存在を強調しています。
Introduction
心房細動(AF)は、最も一般的な持続性不整脈です1。心房細動の有病率はさらに増加しており、2060年にはヨーロッパで~1,790万人の患者数が見込まれています1。心房細動は、心筋梗塞、心不全、脳卒中の発症に不可欠な危険因子であり、個人的、社会的、社会経済的に多大な負担をもたらすため、臨床的に非常に重要です1。心房細動は何十年も前から知られていますが、心房細動の病態生理学はまだ完全には理解されていません2。
すでに1990年代後半には、肺静脈(PV)が心房細動を誘発する異所性拍動の主な発生源であるため、心房細動の開始と維持に大きな影響を与えることが研究で実証されています3。PVは他の血管とは構造的に異なることが実証されています。一般的な血管には平滑筋細胞が含まれていますが、PVのチュニカ培地には心筋細胞も含まれています4。げっ歯類では、この心臓の筋肉組織は、肺内および肺外部分、ならびに開口部領域を含むPV全体に遍在する5。ヒトでは、PVには心筋細胞も含まれており、左心房(LA)の心筋、いわゆる心筋スリーブ(MS)の延長部内で観察することができます6,7。
多発性硬化症は心房心筋と形態学的に類似している8。心房とPV心筋細胞の形状とサイズは互いに有意に変化せず、同等の電気生理学的特性を示します8。PV内の電気生理学的記録はMSの電気的活動を証明し、血管造影画像は心拍と同期した収縮を明らかにしました9,10。
ギャップ結合は、6つのコネキシンサブユニットからなる細孔形成タンパク質複合体であり、イオンと低分子の通過を可能にする11。ギャップ結合は細胞間アポジションに存在し、隣接する心筋細胞を相互接続し、心筋細胞間の細胞間電気的結合を可能にする12,13。いくつかのコネキシンアイソフォームが心臓で発現しており、コネキシン43(Cx43)は心臓のすべての領域で発現する最も一般的なアイソフォームである14。以前の研究は、PVの心筋細胞におけるCx43の発現の証拠を提供します15,16。
インタクトPV内のMSは、そのデリケートな構造のため、特に小動物モデルでは依然として困難です。ここでは、顕微鏡ガイド下マイクロダイセクションを使用して、マウスのLAおよび肺葉とともにPVを同定および分離する方法を示します。さらに、PVの免疫蛍光染色を実証し、PV内の心筋細胞とその相互接続を可視化します。
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Protocol
動物の飼育とすべての実験手順は、ミュンヘンのルートヴィヒ・マクシミリアン大学の動物管理および倫理委員会のガイドラインに従って実施され、マウスを使用したすべての手順は、Regierung von Oberbayern(ROB 55.2-2532)によって承認されました。Vet_02-20-215、ロブ55.2-2532。Vet_02-18-46、ロブ55.2-2532。Vet_02-19-86、ROB 55.2-2532。Vet_02-21-178、ロブ55.2-2532。Vet_02-22-170)です。C57BL6/Nマウスを市販した。
1. 事前準備
- 500 mL三角フラスコに3 mgのアガロースと1xトリス緩衝生理食塩水100 mLを混合して、3%アガロースゲルを調製します。ゲルが均一になるまで、溶液を600Wの電子レンジで2〜3分間加熱します。
- 直径100mmのシャーレにゲルを静かに流し込んで、解剖ディッシュを準備します。ペトリ皿の半分をゲルで満たします。ゲルから気泡を取り除き、均質な粘稠度を確保します。ゲルが固まるまで解剖皿を冷ましておきます。
- 固定液、透過処理液、ブロッキング液、洗浄液など、必要なすべての緩衝液と溶液を、 表 1 のレシピに従って調製します。
2. 臓器摘出と組織調製
注:マウスの麻酔と心臓の採取の手順を詳述した広範なプロトコルは、以前に公開されています17,18。したがって、その部分の簡単な説明のみを提示します。実験は、12〜16週齢のC57BL6マウス(雄6匹、雌4匹)で行われました。オスの体重は26gから28g、メスの体重は19gから22gに伸びた。以下のステップは、以前の全身性ヘパリン注射なしで実行されました。
- マウスにイソフルラン(5%、95%酸素、流量:1 L / min)で麻酔をかけ、十分な麻酔深度を確保します。
- マウスを操作机に移し、仰臥位に置きます。麻酔マスクを通してイソフルラン吸入(2%、98%酸素、流量:1 L / min)で麻酔を維持し、マウスを四肢にテープで固定します。鎮痛のためにフェンタニルを注射します(0.1 mg / 25 g体重i.p.)。
- 剣状突起で毛皮を持ち上げ、横方向に2mmのカットを設定します。鈍い解剖(ハサミの裏側)を使用して皮下筋膜から毛皮を外し、切り口を頭側および外側に伸ばして胸部を露出させます。
- 腹部尾側を肋骨弓まで慎重に開きます。剣状突起を少し持ち上げて、尾側から横隔膜を切開し、肺を崩壊させます。次に、臓器を傷つけずに横隔膜を左から右に切断し、胸部を左右に開いて心臓を露出させます。
- 心臓がまだ鼓動している間に下大静脈(IVC)を切断してマウスを放血し、27 Gの針で左心室を貫通し、10 mLの氷冷1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注入して心臓を灌流します。
- マウスの心臓から血液を除去した後、大動脈弓、上大静脈(SVC)、および気管を見つけます。心臓の基部から~3mm上に切り取り、接続された肺と一緒に心臓を採取します。
- 摘出した臓器を、滅菌した30%ショ糖溶液2 mLを含む10 mLのコニカルチューブに浸します。サンプルを4°Cで24時間脱水します。
3. 顕微鏡ガイドによるLAおよびPVの作製
- 脱水した心臓と肺を、40〜50 mLの1x PBSを含む解剖皿に入れます。倍率10倍の明視野顕微鏡の下に置き、照明を設定します。心臓の背側を解剖皿の上に置きます。心室壁と心房壁の間の移行を特定し、外科用ハサミを使用して心室を心房から慎重に分離します。
注:心房より約1mm下をカットして、心室組織を維持します。これは、心臓の底部の構造を損なうことなく心房を解剖皿に固定するために後で必要になります。心室は陽性対照サンプルとして使用できるため、保管することをお勧めします。心室組織を埋め込むには、セクション 4 で説明したように、PV の埋め込みに概説されているのと同じ手順に従います。 - 心室の切断面(ステップ3.1)で分離した心房を解剖皿に置き、心臓の底が上を向くようにします。肺葉が後方、LAと左心耳(LAA)が右側、右心房(RA)と右心耳(RAA)が左側になるように心房を向けます。残りの左心室組織を解剖皿に固定して準備を固定します。無理な力を加えずに肺葉を静かに広げ、解剖皿に固定します(図1A)。
- 心臓の基部にある解剖学的ランドマークの概要をご覧ください。
- 心臓基部の中心に大動脈弓がある大動脈を見つけます。
- 大動脈のすぐ右側にある肺幹(PT)を検出し、後方に向かってそのコースをたどって肺動脈(PA)を区別します。左葉と右上葉/中葉までのコースをたどって、対応する肺門(LH)を見つけて、それらの位置を確認します。
- 大動脈の後方に位置する気管および/または左右の主気管支(L Br、R Br)の位置を決定し、LHに向かうコースをたどって位置を確認します(図1A)。
- 大動脈の左側にあるSVCを見つけ、RAAの隣のRAへのコースをたどって確認します。
- 心臓底の結合組織と脂肪組織を取り除き、上記の識別されたランドマークをすべて保存します。さらに、大動脈弓と気管を切除して、心臓の底部を自由に見ることができます(図1B)。
- 細かい鉗子を使用して鈍く解剖することにより、心房の上面からPAを静かに分離します。その後、LHで切り取り、横にひっくり返して、左心房自由壁(LAFW)とPVを全寸法で露出させます。LHから主気管支を切り取り、気管支組織を切除します(図1C)。
注:LHは、PAと肺への気道の一般的な入り口として、またPVの出口としても機能します。PVの損傷を避けるために、LHですべての手順を慎重に実行することが重要です。 - LA/RAと左右心室(LV、RV)を分離するには、残りのRVの前部から三尖弁(TV)を通ってSVCの前側まで上向きに切断を行い、前側からRAを開きます。心房中隔の隣にある後部RA自由壁(RAFW)を切断して、RAとLAを分離します。心室中隔の隣の右心室後壁を切断して、LVとRVを完全に切断します。
注:右心房の準備と分離の手順を詳細に説明する広範なプロトコルは、以前に公開されています19。RAの分離は、LA-PV組織複合体から不要な組織を除去し、追加の実験のために組織を採取するのに役立ちます。 - 約3〜4mmの肺組織が残るように、基底肺組織の一部を切り取って肺葉のサイズを縮小します。
注:肺葉の頂点は、その後の埋め込みステップ中にフロートとして機能するため保存し、PVをO.C.Tコンパウンドに水平に埋め込むことができます。
4. 組織包埋
- LAとPVを含む製剤をクライオモールドに移し、心臓の基部と肺の頂点が上を向くようにします。それらを生理学的構成で配置します-PVがねじれたりひっくり返ったりしないようにします。
- クライオモールドにO.C.Tコンパウンドを充填し、微細な鉗子でPVを静かに圧縮して、残っている空気を取り除きます。プロセス全体を通して生理学的構成を変化させません。
- 組織を埋め込んだクライオモールドをドライアイスの上に置き、O.C.T.化合物を凍結します。サンプルは、将来の使用のために-80°Cで保管してください。
注:PVを水平位置に保ち、後続の手順でPVを含む全長のセクションを確実に取得することが重要です。
5.凍結組織切片の切断と収集
注:組織ブロックを切断するために、機械の設定は、試験片温度-18°C、ブレード温度-25°Cに調整されました。
- 組織ブロックと標本ホルダーの間にO.C.T.化合物の層を塗布することにより、標本ホルダーに組織ブロックを取り付けます。3〜4分間冷凍します。
- 試料ヘッドをブロックし、試料チャックリリースレバーを閉じて、試料ヘッドに組織ブロックを載せた試料ホルダーをロードします。微調整ノブを使用して組織ブロックの位置を微調整します。
- 試料からクライオモールドを取り出します。試料ヘッドとクライオスタットの電気ブレーキのブロックを解除します。
- クライオスタットをトリムサイズを30μmから50μmのトリムモードに設定します。PVが見えるようになるまで組織標本をトリミングします。
- 微細断面切断モードに切り替えて、厚さを10μmに設定します。PVや接続された肺組織や心房組織などの切片の収集を開始します。アンチロールプレートを使用するか、各セクションの自由端を細いコールドブラシでブレードホルダーに固定してセクションを収集し、広げます。
- スライド(室温で保存)をセクションに隣接して配置します。凍結した部分とO.C.T.コンパウンドが暖かいスライド面に触れると溶けるため、セクションをブラシから慎重に解放し、セクションがスライドに自然に付着するようにします。
注意: 切片の破裂や折り目を防ぐために、切片作成プロセス中は安定した穏やかな状態を維持してください。必要に応じて、ブレードを新しいブレードと交換します。 - 各スライドに最大 3 つのセクションを収集します。スライドにラベルを付け、-20°Cで保管します。
注:各PVについて、少なくとも5つのセクション(2枚のスライドに相当)を収集することをお勧めします。
6. PVからの凍結切片の免疫蛍光染色
- 凍結スライドを染色システム上に並べ、切片を室温で約20分間解凍します。
注:染色システムを水で満たし、サンプルを加湿してください。組織の乾燥は抗原を損傷し、染色手順中に非特異的抗体結合および過剰染色アーチファクトを引き起こす可能性があります。 - 20分間の解凍後、切片を数滴の固定液(4%パラホルムアルデヒド[PFA]、 表1)で覆い、室温で10分間スライド上に組織を固定します。
- 固定後、スライドを垂直スライドラックに移し、1x PBSで満たされた容器に浸します。容器をシェーカーの上に低速で置き、スライドを5分間洗浄します。この洗浄サイクルをさらに2回繰り返し、毎回新しい1x PBSを使用します。
- 洗浄後、キシロール含有液体ブロッカーペンで各スライドの各セクションを丸で囲みます。染色システム上でスライドを再配置し、パスツールピペットで各サンプルに1〜2滴の透過処理溶液(0.1% Triton X-100、 表1)を塗布します。切片を室温で10分間インキュベートして、細胞および細胞小器官膜を透過させます。
- 透過処理後、ステップ 6.3 と同じ手順に従って、スライドを 1x PBS で 3 x 5 分間洗浄し、0.1% Triton X-100 溶液を除去します。
- 洗浄後、染色システム上のスライドを再配置し、ブロッキングバッファー(表1)を各切片に1〜2滴塗布し、ブロッキングバッファーで完全に覆われていることを確認します。スライドを室温で1時間インキュベートします。
- 5 μLのマウス抗cTNT抗体(1:200に希釈)と1 μLのウサギ抗Cx43抗体(1:1,000に希釈)を、994 μLのブロッキングバッファーで満たされた1.5 mLの微量遠心チューブにピペッティングして、1 mLの一次抗体ミックスを調製します。混合物を上下にピペットで動かして、完全に混合します。
注:切片のサイズに応じて、塗布する抗体混合物の量を調整してください。切片が抗体混合物で完全に覆われていることを確認します。抗体の濃度、インキュベーション時間、および最適なインキュベーション温度は、抗体の種類、抗体クローン、組織特性などの要因によって異なります。染色条件は、抗体ごとに個別に試験し、最適化することをお勧めします。 - ブロッキングステップ(ステップ6.6)の後、残りのブロッキングバッファーを除去し、一次抗体ミックスを各切片に直接2〜3滴塗布します。スライドを4°Cで一晩インキュベートします。
- 一次抗体のインキュベーション後、スライドをWashing Bufferで5分×3秒間、穏やかに振とうします(表1)。
- AF488標識ヤギ抗マウス二次抗体(1:1,000希釈)1 μLとAF568標識ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:1,000希釈)1 μLを、998 μLの洗浄バッファーで満たされた1.5 mLの微量遠心チューブにピペッティングして、1 mLの二次抗体ミックスを調製します。混合物を上下にピペットで動かしてよく混ぜます。
- 洗浄ステップ(ステップ6.9)の後、染色システムでスライドを再配置し、ピペットで各切片に二次抗体混合物を2〜3滴塗布します。抗体を室温で45分間インキュベートさせながら、サンプルを光から保護して蛍光色素の消光を防ぎます。二次抗体のインキュベーション後、スライドをWashing Bufferで5分×3秒間、穏やかに振とうします(表1)。
- 染色システムのスライドを再配置します。Hoechst-33342溶液を各切片に2〜3滴塗布して、Hoechst-33342(1x PBSで1:1,000に希釈)で切片を対比染色します。スライドを室温で10分間インキュベートします。
- インキュベーション後、スライドを洗浄バッファーで3 x 5分間、穏やかに振とうします(表1)。各スライドに蛍光封入剤を1滴または2滴塗布して、スライドを取り付けます。スライドをカバーガラスで覆います。
注意: カバーガラスを配置するときは、カバーガラスが平らであることを確認してください。気泡が存在する場合は、気泡の側面にそっと圧力をかけて気泡を取り除きます。 - 取り付けたスライドは、4°Cのスライドセーバーに保管してください。
注:スライドはできるだけ早く画像化することをお勧めします。このプロトコルは、上記の抗体に対して排他的に有効ではありません。標的抗原および抗体は、個々の実験要件または代替抗原検出戦略に従って置換または変更することができます。
7. 免疫蛍光染色スライスのイメージング
- 顕微鏡をセットアップします。
- 製造元のマニュアルに従って、レーザー光源、接続されたコンピューター、および付属のソフトウェアを使用して顕微鏡を起動します。
- [構成] メニューに入ります。蛍光イメージングに適したカメラタイプ(モノクロカメラなど)をクリックして選択しますDFC365FX。
- [Acquire]メニューに入り、3つのチャンネルを作成します。
- Hoechst-33342 の検出用にチャネル FCr1 を選択してラベルを付け、選択セクションで DAP フィルター キューブを選択します。露光時間を200ms、電子ゲインを2、光強度を17%に設定します。
- cTNT(AF488標識抗体で染色)の検出にチャンネルFCr2を選択し、標識して、選択セクションでL5フィルターキューブを選択します。露光時間を200〜300ミリ秒、電子ゲインを1.8、光強度を100%に設定します。
- Cx43(AF568標識抗体で染色)の検出にチャンネルFCr3を選択し、標識して、選択セクションでTXRフィルターキューブを選択します。露光時間を150ms、電子ゲインを2、光強度を100%に設定します。
注:フィルターキューブのスペクトル特性を 表2に示します。
- スライドを顕微鏡ステージにセットします。
- 10倍の倍率でオーバービューイメージングを実行します。
- 10倍対物レンズを選択し、[ライブ]をクリックしてレーザーシャッターを開きます。FCr1チャンネルを選択した状態で、ナビゲーター機能を使用して、信号が検出されるまでスライド内をナビゲートします。細胞核が区別できるまでサンプルを大まかに焦点を合わせます。
- スパイラルスキャンモードを開始して、サンプルの完全なプレビューをキャプチャします。試料を保護するためにボタンをもう一度クリックして、ライブを非アクティブ化します。LA、PV、および肺組織を特定します。
- 後続のタイル スキャンの対象地域を定義します。対象領域内の複数のフォーカスポイントを選択します。FCr1チャンネルの[ライブ]をクリックし、各フォーカスポイントのフォーカスを調整します。各フォーカスポイントの正確なフォーカス位置を表す、対応するZ位置を保存します。10倍の倍率でタイルスキャンを開始して、サンプルの完全な概要画像をキャプチャします。
- スキャンが完了したら、タイル スキャンを開き、個々の画像をマージします。単一チャンネルの明るさとコントラストを高めるには、 オブジェクトバー でチャンネルを選択し、必要に応じてスライダーで 信号範囲 を調整します。
- 40倍の倍率でズームイン画像を取得します。
- 40倍の対物レンズを選択します。各チャンネルの露光時間とゲイン設定を次のように調整します:FCr1:DAPフィルターキューブ:露光時間:50ミリ秒、ゲイン:1.5;FCr2:L5フィルターキューブ:露光時間:80ms、ゲイン:1.8;FCr3:TXRフィルターキューブ:露光時間:20ms、ゲイン:2。
- ステップ 7.3 の概要画像を使用して、PV オリフィス (PVO)、および肺外および肺内 PV (PVex、PVin) 領域を見つけます。スキャンする領域を定義します。
- サブメニューの 画像 を開き、zをクリックして Zスタックをアクティブにします。
- FCr1チャンネルを選択し、レーザーシャッターを開いてライブプレビューを取得します。
- Z-Stackサブメニューに移動し、全体的な信号がフォーカスを失い始めるまで、focus微調整ノブを時計回りと反時計回りに回して、Z-Stackの開始点と終了点を決定します。
- フォーカス範囲を設定したら、 システム最適化 Zスタックモードを選択し、 拡張被写界深度画像 (EDF)の計算オプションを有効にします。組織の平坦度にもよりますが、約0.5μmのステップ間隔で約20層が予想されます。
- タイル スキャンを開始します。スキャン後、タイルスキャンを開き、EDF画像のみをマージします。単一チャンネルの明るさとコントラストを高めるには、 オブジェクトバー でチャンネルを選択し、必要に応じてスライダーで 信号範囲 を調整します(ステップ7.3.4を参照)。
- 画像を生成したら、プロジェクトを保存し、各画像のマージされたバージョンとRAWチャンネルの両方をTIFFファイルとしてエクスポートします。
注: ファイルを ImageJ で読み取り可能な TIFF として保存すると、ImageJ は元のタイル サイズをピクセル単位ではなく μm 単位でインポートできます。二次抗体の光退色を防ぐために、レーザー信号が不要な場合は、必ずレーザーシャッターを閉じてください。
8. ImageJによる画像編集
- 対応する生のチャネルファイルを ImageJ にロードします。画像をクリック |カラー |各 チャンネルをマージして目的の 色 を選択します。
- 縮尺記号を作成するには、[ 分析] |ツール |スケールバー をクリックして、右下隅に貼り付けます。画像の要件に応じて、さらなる処理と分析を進めます。終了したら、マージした画像を保存します。
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Representative Results
12-16週齢のマウス10匹でPVのマイクロダイセクション、染色、イメージングを行いました。プロトコールに従って、すべての実験マウスでLAとともにPVをマイクロダイクすることに成功し、8匹のマウスでPVを包括的に把握した切片を取得しました。LA-PV接合部のPVオリフィス(PVO)領域、肺外PV(PV ex)(肺門とLA-PV接合部の間のPV)、肺内PV(PVin)(肺組織に囲まれたPV)を特定するために、10倍の倍率で概要画像を撮影しました(図2)。上記の領域の拡大画像は、40倍の倍率対物レンズで取得されました(図3)。
その結果、PVO、PVex、PVinに典型的な筋条線を有する特異的なcTNTシグナルが見つかりました(図3)。Cx43は3つのPV領域すべてで見られ、ほとんどが隣接する心筋細胞間で投射されていました(図3および図4A)。Cx43関連のシグナルは、MSの心筋細胞の極側(図3、黄色の矢印)と外側(図3、赤い矢印)の両方で観察されました。
図1:顕微鏡下でのマウスの肺静脈の同定。 明視野顕微鏡(倍率10倍)。心臓は、心房、左肺葉、右中肺葉、右下肺葉の4つのピンで解剖皿に固定されます。(A)心室組織を心房から分離した後の心臓底の概観で、中央に大動脈弓がある。アトリウムは下部にあります。肺葉は写真の上半分に広がっています。PVは、AA、主気管支、およびPAによって隠されます。(B)気管、主気管支の一部、大動脈弓、結合組織、脂肪組織を切除した後の心臓底の上面図画像。画像中央のPAは、PTからLHまでのフルコースを示し、PVを覆っています。 (C)肺葉からPAを切断し、肺外気管支組織を除去した後のPVの上面図。スケールバー = 5 mm。略語:AA =大動脈弓;AscA = 上行大動脈;IVC = 下大静脈;L Br =左主気管支;L PV = 左肺静脈;LA-PV J = 左心房 - 肺静脈接合部;LAA = 左心耳;LAFW = 左心房自由壁;LH =肺門;L. LL = 左肺葉;PA = 肺動脈;PT =肺動脈幹;R Br =右主気管支;R PV =右肺静脈;R-A PV = 右上行肺静脈;RAA = 右心耳;R. acc. LL = 右副肺葉;R. inf. LL = 右下肺葉;R. mid. LL = 右中肺葉;R. sup. LL = 右上肺葉;SVC = 上大静脈。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:免疫蛍光顕微鏡による成体マウスの肺静脈と左心房の横断断面画像の概要。細胞核をHoechst-33342(青色)で染色した。心筋細胞を抗cTNT抗体(白色)で標識した。ギャップ接合は、抗Cx43抗体(緑)を用いて検出しました。白い長方形は、次の領域を強調しています。b、肺外PV(PVex);c、肺内PV(PVin)。スケールバー = 500 μm。 略語: L PV = 左肺静脈;LAA = 左心耳;LAFW = 左心房自由壁;LV-EP = 左心室 - 駆出経路;R PV =右肺静脈;R-A PV = 右上行肺静脈;RV = 右心室。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:免疫蛍光顕微鏡を用いた右心筋の拡大図。 細胞核をHoechst-33342(青色)で染色した。心筋細胞を抗cTNT抗体(白色)で標識した。Cx43+ ギャップ接合は、抗Cx43抗体(緑色)によって検出されました。(A)右肺外PVを通る縦断面を示すEDFタイルスキャン。LAとPVオリフィスは画像に示されておらず、左側に配置され、肺内PVと対応する肺実質(これも示されていません)は右側に配置されます。(B、C)右肺外PVのEDFシングルタイルスキャン。矢印は、心筋細胞の細胞境界にあるCx43+ ギャップ結合を強調しています。黄色の矢印は、椎間板と共局在する心筋細胞の極側のギャップ結合を示し、赤い矢印は心筋細胞の外側のギャップ結合を示します。スケールバー = 50 μm (A)、20 μm (B、C)。略語:PV =肺静脈;EDF = 拡張被写界深度;LA = 左心房。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:対照組織の免疫蛍光染色。 (A)マウスLVのポジティブコントロール染色。 細胞核をHoechst 33342(青色)で染色した。心筋細胞を抗cTNT抗体(白色)で標識した。Cx43+ ギャップ結合を抗Cx43抗体(緑)で検出しました。(B)二次抗体のみを使用した右肺外PVのネガティブコントロール染色。細胞核はHoechst 33342(青色)で染色されています。スケールバー = 20 μm (A)、50 μm (B)。略語:LV =左心室;PV = 肺静脈。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| フィルターキューブ | 励起フィルタ | エミッションフィルター |
| DAPの | 350 / 50 | 460 / 50 |
| L5の | 480 / 40 | 527 / 30 |
| TXRの | 560 / 40 | 630 / 75 |
表1: Leica DM6 Bフィルターキューブの励起フィルターと発光フィルターの特性。
| 化合物 | 最終濃度 | g または mL / 100 mL が必要 |
| 固定ソリューション | ||
| パラホルムアルデヒド(PFA)16% | 4% | 25 mLの |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1倍濃縮 | 75 mLの | |
| 透過処理ソリューション | ||
| トリトンX-100 | 0.1% | 0.1 mLの |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1倍濃縮 | 99.9 mLの | |
| ブロッキングバッファ | ||
| ノーマルゴーズ血清(NGS) | 10% | 10 mLの |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | 0.5% | 0.5ミリグラム |
| トゥイーン 20 | 0.1% | 0.1 mLの |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1倍濃縮 | 89.9ミリリットル | |
| 洗浄バッファー | ||
| ウシ血清アルブミン(BSA) | 0.5% | 0.5ミリグラム |
| トゥイーン 20 | 0.1 mLの | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1倍濃縮 | 99.9 mLの | |
表 2: バッファーレシピ。
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Discussion
このプロトコルでは、マウス心臓のPVを区別して単離し、免疫蛍光染色を行う方法を共有しています。臓器摘出後、心臓と肺を滅菌したスクロース溶液で脱水し、続いて顕微鏡ガイド下で心室を心房と肺葉から分離しました。その後、心臓ベースを準備してPVを視覚化し、肺門からPVを切除しました。その後の免疫蛍光染色は、組織をO.C.T.化合物に包埋し、クライオトームで切断し、cTNTとCx43の免疫蛍光染色を行うことにより、クライオ技術を用いて行った。
PVの単離は、心房細動の不整脈形成におけるPVの役割を研究するのに役立ちます。しかし、マウスのPV単離は困難です。PVはサイズが小さいことに加えて、主気管支と心臓基部の突出した血管の後ろに隠れているため、検出が非常に複雑になります。このプロトコルは、マウスPVを調査するためのシンプルで透明性の高い方法を提供し、その形態学的特徴を詳細に研究するための経済的アプローチを可能にします。提案された採取および調製アプローチは、PV、対応する肺葉、およびLA間の解剖学的関係を保持し、LA-PV組織複合体全体の調査を容易にします。
MSは異種混合の配列をしています。連続性と繊維配向の著しい変動は、ラットやヒトを含む複数の種で報告されており、主にPVオリフィスの周囲に見られます4,20。これらの多様性は異方性電気伝導をもたらし、PVにおける再突入励起および自律神経活動の開始を誘発し得る21。さらに、LA-PV接合部におけるMSと心房心筋の間の電気的相互接続は、PVから左心房への非同期電気インパルスの遷移をもたらし、AF2をもたらす可能性がある。したがって、LA-PV接合部の形態学的比率を維持することは、心房心筋とPVの間の相互作用を研究するために重要です。これを達成するためには、主気管支とPAの正確な識別が不可欠です。解剖学的位置と関係性から、倍率10倍の顕微鏡を用いて、心臓底から左辺までの経路を系統的にたどって、ランドマークを特定しました。
マウスPVのIF染色を行いました。 免疫反応性色素に基づく染色アプローチは、さまざまな種で広く確立されており、標的抗原の直接検出を可能にし、顕微鏡検査で高品質の視覚的コントラストを提供します。このアプローチにより、タンパク質レベルでのインタクト組織スライスの定性的および定量的特性評価が可能になります。TNTの心臓アイソタイプを使用して、心筋と非心臓筋を区別します。PVにおける心筋細胞、ならびにSVCおよびIVCの存在は、以前に説明されています7。しかし、PA、気管支、私設肺血管など、他の肺の尿細管構造には心筋細胞が含まれていないため、IF染色で容易に区別できます7。心筋細胞は、cTNTなどの構造タンパク質を標識することにより、ビーム経路への配向に応じて特徴的な交差線条を示します。ストライエーションの方向は、OrientationJ や Directionality Plugin などのプラグインを使用して ImageJ でマッピングできます。これは、心筋細胞の方向性の定量化と特性評価に役立ち、異方性電気伝導を有する領域の同定に役立つ可能性があります。さらに、この研究は、LVと同様の方法で組織化されたマウスPV心筋にCx43が豊富に存在するという以前の知見を支持しています(図4A)15,16。驚くべきことに、マウスPVの心筋細胞の外側膜にギャップ接合が観察されました。側方化として知られるこの状態は、心房細動、特に雄マウスにおける病態生理学的メカニズムとして実証されている22。従って、このプロトコルはマウスMSの心筋細胞の同じような調査のための潜在性を強調する。
PV単離は、IF染色、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、光学マッピング、パッチクランプなど、多くの研究を可能にするため、不整脈研究にとって重要な技術です。しかし、現在のプロトコルは固定組織と包埋組織のIFイメージングのために確立されたため、心筋細胞がパッチクランプなどの実験を可能にするのに十分な品質でPV調製物から分離できるという直接的な証拠は現在のところ欠落しています。マイクロダイセクションの成功は、マウスの心臓組織のサイズが小さく脆弱であるため、研究者の経験にかかっています。IFイメージングの品質は、埋め込みステップにも大きく依存します。水平方向の配置は困難であり、切片の組織の完全性が損なわれる可能性があり、O.C.T.化合物で満たされていないとPVが破裂する可能性があります。さらに、この方法ではPVの3D再構成ができないため、プロトコルの有効性は2Dイメージングに限定されます。
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Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.)、China Scholarship Council (CSC201808130158 to R.X.)、German Research Foundation (DFG;血管医学の臨床医科学者プログラム(PRIME)、MA 2186 / 14-1からPT)、およびコロナ財団(S199 / 10079 / 2019からSC)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
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