Summary
Questo protocollo descrive una piattaforma di coltura cellulare riconfigurabile basata su membrana che integra il formato a pozzetto aperto con capacità di flusso del fluido. Questa piattaforma è compatibile con i protocolli standard e consente transizioni reversibili tra le modalità di coltura a pozzetto aperto e microfluidica, soddisfacendo le esigenze dei laboratori di ingegneria e bioscienze.
Abstract
I sistemi microfisiologici sono piattaforme di coltura cellulare miniaturizzate utilizzate per imitare la struttura e la funzione dei tessuti umani in un ambiente di laboratorio. Tuttavia, queste piattaforme non hanno ottenuto un'adozione diffusa nei laboratori di bioscienze, dove gli approcci basati su membrana a pozzetto aperto fungono da gold standard per imitare le barriere tissutali, nonostante la mancanza di capacità di flusso dei fluidi. Questo problema può essere attribuito principalmente all'incompatibilità dei sistemi microfisiologici esistenti con i protocolli standard e gli strumenti sviluppati per i sistemi a pozzo aperto.
Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di una piattaforma riconfigurabile basata su membrana con una struttura a pozzetto aperto, capacità di miglioramento del flusso e compatibilità con i protocolli convenzionali. Questo sistema utilizza un approccio di assemblaggio magnetico che consente la commutazione reversibile tra le modalità a pozzetto aperto e microfluidica. Con questo approccio, gli utenti hanno la flessibilità di iniziare un esperimento nel formato a pozzetto aperto utilizzando protocolli standard e di aggiungere o rimuovere funzionalità di flusso in base alle esigenze. Per dimostrare l'uso pratico di questo sistema e la sua compatibilità con le tecniche standard, è stato creato un monostrato di cellule endoteliali in un formato a pozzetto aperto. Il sistema è stato riconfigurato per introdurre il flusso di fluido e quindi è passato al formato a pozzetto aperto per condurre l'immunocolorazione e l'estrazione dell'RNA. Grazie alla sua compatibilità con i protocolli convenzionali a pozzo aperto e alla capacità di miglioramento del flusso, si prevede che questo design riconfigurabile sarà adottato sia dai laboratori di ingegneria che da quelli di bioscienze.
Introduction
Le barriere vascolari fungono da interfaccia critica che separa il compartimento sanguigno dal tessuto circostante. Svolgono un ruolo fondamentale nel preservare l'omeostasi attirando le cellule immunitarie, controllando la permeabilità molecolare e proteggendo dall'intrusione di agenti patogeni nel tessuto 1,2. Sono stati sviluppati modelli di coltura in vitro per imitare il microambiente in vivo, consentendo indagini sistematiche sui fattori e sulle condizioni che influenzano le proprietà di barriera sia in stato sano che malato 3,4.
L'approccio più utilizzato per tali modelli di coltura è la configurazione "a pozzetto aperto"simile a Transwell 5, in cui una membrana di coltura porosa e incisa separa i compartimenti pieni di terreno (Figura 1A). In questo formato, le cellule possono essere seminate su entrambi i lati della membrana ed è stata sviluppata un'ampia gamma di protocolli sperimentali. Tuttavia, questi sistemi sono limitati nella loro capacità di fornire i flussi di fluidi essenziali per supportare la maturazione della barriera e imitare la circolazione delle cellule immunitarie osservate in vivo 5,6. Di conseguenza, non possono essere utilizzati per studi che richiedono flussi dinamici che introducono dosi di farmaco, stimolazione meccanica o sollecitazioni di taglio indotte da fluidi 6,7,8.
Per superare i limiti dei sistemi a pozzetto aperto, sono state sviluppate piattaforme microfluidiche che combinano membrane di coltura porose con canali fluidici indirizzabili individualmente9. Queste piattaforme offrono un controllo preciso sull'instradamento dei fluidi, la perfusione e l'introduzione di composti chimici, la stimolazione a taglio controllata e le capacità di aggiunta dinamica delle cellule 7,10,11,12,13. Nonostante le capacità avanzate fornite dalle piattaforme microfluidiche, non hanno visto un'adozione diffusa nei laboratori di bioscienze a causa dei complessi protocolli microfluidici e della loro incompatibilità con i flussi di lavoro sperimentali stabiliti 4,10,14.
Per colmare il divario tra queste tecnologie, presentiamo un protocollo che impiega un sistema basato su moduli riconfigurabile magneticamente. Questo sistema può essere facilmente commutato tra la modalità a pozzetto aperto e la modalità microfluidica in base alle esigenze specifiche dell'esperimento. La piattaforma è dotata di un dispositivo a pozzetto aperto, noto come m-μSiM (sistema microfisiologico modulare abilitato da una membrana di silicio), con una membrana di coltura (nanomembrana) spessa 100 nm. Questa nanomembrana possiede un'elevata porosità (15%) e una trasparenza simile al vetro, come illustrato nella Figura 1B. Separa fisicamente il compartimento superiore da un canale inferiore, consentendo il trasporto molecolare attraverso scale di lunghezza fisiologiche15. A differenza delle membrane convenzionali incise su traccia, che presentano sfide note nell'imaging di cellule vive con imaging in campo chiaro, le proprietà ottiche e fisiche favorevoli della nanomembrana consentono una chiara visualizzazione delle cellule su entrambi i lati della superficie della membrana 15,16,17.
Il presente protocollo delinea la fabbricazione di moduli specializzati per la semina e il flusso e spiega la riconfigurazione magnetica della piattaforma. Dimostra come la piattaforma possa essere impiegata per stabilire barriere endoteliali sia in condizioni statiche che dinamiche. Questa dimostrazione rivela che le cellule endoteliali si allineano lungo la direzione del flusso, con una sovraregolazione dei bersagli genici sensibili al taglio sotto stimolazione al taglio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Questo design può essere utilizzato in varie modalità in base alle esigenze sperimentali e alle preferenze dell'utente finale. Prima di ogni esperimento, consultare il diagramma di flusso decisionale presentato nella Figura 2 per determinare i passaggi e i moduli necessari per il protocollo. Ad esempio, se l'utente intende mantenere il formato a pozzetto aperto per tutta la durata di un esperimento per confrontarlo direttamente con il sistema di tipo Transwell, lo stencil di patterning non è necessario per la semina delle cellule. Il modulo centrale è disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) e la nanomembrana ultrasottile può essere selezionata da una libreria di materiali con diverse porosità e dimensioni dei pori per soddisfare le esigenze sperimentali.
1. Fabbricazione dello stencil di modellazione
NOTA: Lo stencil di patterning serve a posizionare le celle esclusivamente sulla regione porosa del chip di membrana, impedendo alle celle di depositarsi sullo strato di silicio circostante dove potrebbero potenzialmente subire danni dopo l'aggiunta del modulo di flusso16 (fare riferimento alla Figura 3). Il danneggiamento del monostrato può influire negativamente sull'integrità della barriera e compromettere i risultati sperimentali. Lo stencil non è necessario in una cultura aperta e statica, in quanto non vi è alcun rischio di danneggiamento.
- Acquistare, lavorare o stampare in 3D uno stampo utilizzando il progetto fornito nel file di codifica supplementare 1 (Figura 4A).
NOTA: Le pareti dello stencil sono rastremate per aumentare la capacità dei supporti e ridurre al minimo l'intrappolamento delle bolle rispetto alle caratteristiche a parete diritta ad alto rapporto d'aspetto. - Fissare una pellicola adesiva sensibile alla pressione (PSA) da 130 μm su un foglio acrilico da 3,2 mm utilizzando un rullo freddo (vedere la tabella dei materiali).
- Tagliare al laser la lastra acrilica secondo il disegno fornito nel file di codifica supplementare 2 per creare una serie di cavità (Figura 4B).
- Staccare lo strato protettivo dalla pellicola PSA e fissare il foglio acrilico allo stampo.
NOTA: Assicurarsi che la lamiera tagliata al laser sia allineata con lo stampo in modo che le caratteristiche dello stampo siano centrate all'interno della cavità (Figura 4C). L'accuratezza del posizionamento delle cellule sulla membrana dipende da questo passaggio. - Miscelare accuratamente il prepolimero PDMS (utilizzando un rapporto base/catalizzatore di 10:1) (vedere la tabella dei materiali) e degasarlo in una camera a vuoto fino a quando non rimangono bolle visibili (5-15 min).
- Versare lentamente il PDMS nelle cavità dello stampo, livellandolo con un bordo piatto.
NOTA: Per evitare l'intrappolamento delle bolle, versare lentamente il PDMS in ciascuna cavità. Se sono presenti bolle dopo il versamento, posizionare lo stampo nella camera a vuoto e degasarlo nuovamente. - Polimerizzare il PDMS su una piastra a 70 °C per 1 ora, quindi lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
- Estrarre gli stencil dalle cavità dello stampo utilizzando una pinzetta a punta piatta.
2. Realizzazione del modulo di flusso
NOTA: Il modulo di flusso condivide un ingombro simile con il pozzetto a forma di trifoglio del modulo centrale e include un microcanale stampato (larghezza = 1,5 mm, altezza = 0,2 mm, lunghezza = 5 mm). La forma a trifoglio aiuta ad allineare il canale sulla regione porosa della coltura (Figura 5).
- Utilizzare le tecniche standard di litografia morbida18 per creare uno stampo in silicone con caratteristiche definite dal progetto fornito nel file di codifica supplementare 3 (Figura 4D).
- Fissare una pellicola PSA da 130 μm a un foglio acrilico di 3,2 mm di spessore.
- Tagliare al laser la lastra acrilica in base al disegno fornito nel file di codifica supplementare 4 per creare una serie di cavità a forma di trifoglio (Figura 4E).
NOTA: L'altezza della cavità determina l'altezza del modulo di flusso, che deve essere leggermente più alto (di 0-0.1 mm) rispetto all'altezza del pozzetto del modulo centrale per garantire una corretta tenuta. - Rimuovere lo strato protettivo dalla pellicola PSA, quindi fissare il foglio tagliato al laser allo stampo in silicone allineando i segni di allineamento triangolari sullo stampo in silicone con quelli sul foglio tagliato al laser.
NOTA: Analogamente al passaggio 1.4, assicurarsi che il foglio acrilico tagliato al laser sia allineato con lo stampo in silicone in modo che le caratteristiche dello stampo siano centrate all'interno di ciascuna cavità (Figura 4F). Questo passaggio determina la posizione del microcanale rispetto all'impronta. - Versare lentamente il PDMS degassato sulle cavità dello stampo e livellarlo con un bordo piatto.
NOTA: Se sono presenti bolle dopo il versamento, degassare lo stampo fino a quando le bolle non vengono rimosse. - Posizionare lo stampo su una piastra riscaldante e cuocere il PDMS a 70 °C per 1 ora, quindi lasciare raffreddare lo stampo a temperatura ambiente.
- Rimuovere con cautela i moduli di flusso dalle cavità dello stampo utilizzando una pinzetta a punta piatta.
- Orientare il modulo di flusso con le caratteristiche del microcanale rivolte verso l'alto e posizionare le porte di ingresso e uscita del nucleo all'estremità del canale utilizzando un punzone per biopsia (vedere la tabella dei materiali).
3. Fabbricazione di alloggiamenti in acrilico inferiore e superiore
NOTA: Il modulo principale si inserisce nell'alloggiamento inferiore. L'attrazione tra i magneti incorporati negli alloggiamenti comprime e sigilla il modulo di flusso al modulo centrale (Figura 6).
- Tagliare al laser una lastra acrilica da 2 mm utilizzando il disegno fornito nel file di codifica supplementare 5 per creare l'alloggiamento superiore con i fori per l'inserimento del magnete.
- Fissare una pellicola PSA da 130 μm su un foglio acrilico da 3,5 mm.
- Tagliare al laser la lastra acrilica in base al disegno fornito nel file di codifica supplementare 6 per creare l'alloggiamento inferiore con i fori per l'inserimento del magnete.
NOTA: Lo spessore dell'alloggiamento inferiore è un parametro critico e deve corrispondere allo spessore complessivo del modulo centrale per evitare perdite durante il flusso. - Rimuovere lo strato protettivo PSA e fissare l'alloggiamento inferiore a un vetrino coprioggetti.
- Inserire magneti al neodimio nichelati da 4,75 mm (vedi Tabella dei materiali) nei fori tagliati al laser degli alloggiamenti.
NOTA: Assicurarsi che i magneti negli alloggiamenti inferiore e superiore siano posizionati con polarità opposta per garantire l'attrazione magnetica (Figura 6).
4. Fabbricazione del circuito di flusso
NOTA: Il circuito di flusso a circuito chiuso contiene due fiale di raccolta del campione come serbatoi (Figura 7). Il serbatoio di ingresso è dotato di un filtro in difluoruro di polivinilidene (PVDF) per consentire al terreno cellulare di equilibrarsi con la concentrazione di CO2 nell'incubatore.
- Utilizzare un punzone per biopsia da 1 mm per creare due fori nel tappo di una fiala di raccolta del campione.
- Utilizzare i punzoni per biopsia per creare due fori (1 mm e 4 mm) nel tappo di una fiala di raccolta separata del campione e creare un foro di 1 mm nella parte inferiore di questa fiala.
- Inserire i puntali di erogazione da 20 G in ciascuno dei fori da 1 mm e sigillarli con colla a caldo.
- Posizionare un filtro in PVDF da 0,22 μm (vedi Tabella dei materiali) nel foro da 4 mm e sigillarlo con colla a caldo.
- Tagliare al laser un foglio acrilico da 1,5 mm utilizzando il design fornito nel file di codifica supplementare 7 per creare una fase di conservazione del campione.
- Posizionare i serbatoi sul tavolino acrilico.
- Collegare i puntali di erogazione utilizzando tubi di microflusso (vedere la tabella dei materiali).
- Collegare i tubi all'ingresso e all'uscita del modulo di flusso utilizzando punte di erogazione da 21 G.
- Utilizzare una pompa peristaltica (vedi Tabella dei materiali) per la circolazione del flusso.
NOTA: Se lo si desidera, è possibile utilizzare anche pompe a siringa o pneumatiche per introdurre il flusso. La portata deve essere determinata in base alle esigenze sperimentali. Una tabella completa, derivata da un modello COMSOL validato sperimentalmente, è fornita nella Tabella supplementare 1 per aiutare gli utenti a selezionare la portata necessaria per ottenere la sollecitazione di taglio desiderata al monostratodi cella 16.
5. Semina cellulare
NOTA: Analogamente agli inserti di membrana convenzionali, diversi tipi di cellule possono essere coltivati sulla nanomembrana. Un tipo di cellula secondaria può anche essere co-coltivato sull'altro lato della membrana nel canale inferiore15.
- Rivestire la membrana con 5 μg/cm2 di fibronectina (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 1 ora per migliorare l'adesione cellulare.
NOTA: Il tipo di cella scelto può influenzare il rivestimento richiesto e la densità delle celle. La procedura qui descritta è per le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC, vedere la tabella dei materiali). - Aspirare la soluzione di rivestimento utilizzando una pipetta P200 e posizionare uno stencil di patterning nel pozzetto del modulo centrale.
- Aggiungere il supporto cellulare al pozzetto e al canale inferiore del dispositivo.
- Seminare HUVEC a una densità di 40.000 cellule/cm2 nel pozzetto.
NOTA: Gli HUVEC a questa densità formano tipicamente un monostrato confluente dopo 24 ore di incubazione16,19. - Mettere il dispositivo in una capsula di Petri. Aggiungere un tappo conico per provetta da 15 mL con acqua deionizzata alla capsula di Petri per mantenere l'umidità locale.
- Trasferire la capsula di Petri nell'incubatrice.
NOTA: I supporti cellulari nel pozzetto superiore e nel canale inferiore del dispositivo devono essere cambiati ogni 24 ore. Per cambiare il supporto nel canale inferiore, iniettare delicatamente il supporto nuovo in una delle porte per spostare il vecchio supporto dall'altra porta.
6. Riconfigurazione in modalità microfluidica
- Sterilizzare l'alloggiamento superiore, l'alloggiamento inferiore, il modulo di flusso, i serbatoi, i tubi e i puntali di erogazione mettendoli in una camera di sterilizzazione UV per 30 minuti prima dell'assemblaggio. Far circolare etanolo al 70% e poi PBS sterile nel circuito di flusso.
- Riempire i serbatoi e le provette con i terreni di crescita delle cellule endoteliali (vedere la tabella dei materiali).
- Posizionare l'alloggiamento inferiore sul tavolino del campione. Inserire il modulo centrale a pozzetto aperto nell'alloggiamento inferiore.
- Aspirare il terreno cellulare dal pozzetto del modulo. Posizionare il modulo di flusso nel pozzetto.
- Posizionare l'alloggiamento superiore per sigillare il modulo di flusso nel pozzetto del modulo centrale. Collegare i puntali di erogazione in ingresso e in uscita alle porte del modulo di flusso.
- Avviare la pompa peristaltica per introdurre il flusso di fluido nel sistema.
7. Esecuzione dell'analisi a valle in formato a pozzo aperto dopo l'introduzione del flusso
NOTA: il tempo di coltura in questo caso dipende dagli obiettivi sperimentali. Gli utenti possono condurre analisi a valle (ad esempio, immunocitochimica, estrazione dell'RNA) in formato a pozzetto aperto o microfluidico in base alle loro preferenze. Ad esempio, se si preferisce un formato a pozzetto aperto, il sistema deve essere riconfigurato per condurre saggi basati su protocolli standard16,19.
- Arrestare la pompa quando viene raggiunto il tempo desiderato per l'esposizione al flusso di taglio. Rimuovere i puntali di erogazione in ingresso e in uscita.
- Rimuovere l'alloggiamento superiore. Rimuovere delicatamente il modulo di flusso dal pozzetto utilizzando una pinzetta.
- Aggiungere 100 μL di terreno cellulare al pozzetto. Condurre i saggi desiderati in base ai protocolli standard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il modulo centrale a pozzetto aperto è inizialmente posizionato all'interno di una cavità specifica creata da un alloggiamento inferiore e da un vetrino coprioggetto, come illustrato nella Figura 6A. Successivamente, il modulo di flusso, che include un microcanale e porte di accesso, viene inserito nel pozzetto del modulo centrale. Il modulo di flusso è sigillato saldamente contro lo strato di supporto in silicio della membrana a causa della forza di attrazione magnetica tra i magneti incorporati negli alloggiamenti inferiore e superiore, come illustrato nella Figura 6B. Per valutare l'efficacia di questo meccanismo di aggancio magnetico, è stato condotto un test di pressione di scoppio, dimostrando che il sistema può resistere a pressioni senza uscita fino a 38,8 ± 2,4 kPa. Questa tolleranza di pressione supera significativamente le tipiche pressioni di esercizio che si incontrano nelle applicazioni di coltura cellulare. Inoltre, il sistema rimane privo di perdite se sottoposto a portate fino a 4000 μL/min, che equivale a una sollecitazione di taglio di 74 dynes/cm2 nella regione di coltura16.
Quando si sviluppa una piattaforma in grado di passare dalla modalità a pozzetto aperto a quella microfluidica, è necessario considerare attentamente l'approccio di semina cellulare, che in genere non è un problema per le piattaforme statiche a pozzetto aperto convenzionali16. Il danneggiamento del monostrato intorno al confine del canale potrebbe introdurre complicazioni nei risultati sperimentali20. Per risolvere questo problema, è stato progettato uno stencil rimovibile che si inserisce all'interno del pozzetto aperto del modulo centrale e fornisce una finestra specifica per consentire alle cellule di depositarsi preferenzialmente sulla superficie della membrana (Figura 3). Una volta che il monostrato cellulare è modellato e raggiunge la confluenza, l'utente ha la flessibilità di continuare l'esperimento nel formato a pozzetto aperto o di riconfigurare la piattaforma in modalità microfluidica per esporre il monostrato cellulare a sollecitazioni di taglio fisiologiche (Figura 3). Il meccanismo di chiusura magnetica offre la possibilità di passare facilmente dal formato a pozzetto aperto a quello microfluidico e viceversa in base alle esigenze. Ad esempio, il dispositivo può essere ripristinato al formato a pozzetto aperto dopo una stimolazione del flusso, offrendo agli utenti la flessibilità di condurre una varietà di saggi (come l'immunocolorazione, l'estrazione dell'RNA e le misurazioni della permeabilità molecolare) utilizzando protocolli sperimentali standard15,16.
Nel contesto fisiologico del corpo umano, la barriera vascolare è esposta allo stress di taglio indotto dal flusso, che funge da segnale biofisico chiave che influisce sulla struttura e sulla funzione della barriera 5,21,22. Pertanto, l'aggiunta di flusso di fluidi nei sistemi microfisiologici è un requisito chiave. Per dimostrare la versatilità della piattaforma, è stato creato un monostrato HUVEC in un formato a pozzetto aperto utilizzando protocolli standard. Dopo 24 ore di coltura statica, la piattaforma è stata riconfigurata in modalità microfluidica per esporre il monostrato cellulare a 10,7 dynes/cm2 di sforzo di taglio per 24 ore. I risultati hanno indicato che le cellule coltivate sotto flusso si sono allineate lungo la direzione del flusso, mentre le cellule coltivate senza flusso sono rimaste orientate in modo casuale (Figura 8A,B). Dopo la stimolazione a taglio, la piattaforma è stata riconfigurata nel formato a pozzetto aperto per estrarre l'RNA utilizzando protocolli standard. I risultati hanno indicato che l'esposizione delle cellule allo stress da taglio ha provocato la sovraregolazione del fattore Kruppel-like 2 (KLF2) e dell'ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS), che svolgono ruoli critici come le funzioni antitrombotiche e ateroprotettive nei vasi sanguigni sani23,24 (Figura 8C).
Figura 1: Confronto tra modelli di barriera vascolare in vitro . Illustrazione schematica di (A) inserti convenzionali simili a Transwell e (B) m-μSiM a pozzetto aperto. Le immagini in campo chiaro di un monostrato HUVEC confluente evidenziano la differenza nella qualità dell'imaging in campo chiaro tra una membrana incisa su traccia e una nanomembrana ultrasottile. Barre di scala = 100 μm. Adattato da Mansouri et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diagramma di flusso del processo decisionale. Un diagramma di flusso basato sulle esigenze sperimentali e sulle preferenze di analisi a valle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Flusso di lavoro sperimentale della piattaforma. (A) Per posizionare direttamente le cellule sulla membrana porosa, uno stencil di patterning rimovibile viene inserito nel pozzetto del modulo centrale (l'inserto mostra le celle modellate, le linee gialle mostrano i confini dei microcanali). (B) Lo stencil può essere conservato o rimosso nel dispositivo per la coltura cellulare statica. (C) Per riconfigurare la piattaforma in modalità microfluidica, lo stencil viene sostituito con il modulo di flusso. Grazie al meccanismo di tenuta magnetica, la configurazione è reversibile; Gli alloggiamenti e il modulo di flusso possono essere rimossi per passare alla modalità a pozzetto aperto. Barra della scala = 200 μm. Adattato da Mansouri et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Illustrazione schematica degli stampi. (A) Lo stampo dello stencil. (B) Lastra acrilica tagliata al laser. (C) vista assemblata dello stampo dello stencil. (D) Stampo del modulo di flusso. (E) Lastra acrilica tagliata al laser. (F) Vista assemblata dello stampo del modulo di flusso. Le caratteristiche a forma di triangolo sono segni di allineamento per facilitare il fissaggio di fogli acrilici agli stampi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Schema del modulo di flusso a forma di trifoglio. (A) L'interfaccia di contatto tra il modulo di flusso e il chip a membrana. Le porte di ingresso e di uscita per il flusso del fluido sono mostrate in rosa. (B) Immagine 3D del modulo di flusso PDMS. Adattato da Mansouri et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Assemblaggio magnetico per la riconfigurazione del dispositivo. (A) Dimostrazione schematica dei componenti per la riconfigurazione del dispositivo in modalità microfluidica. I magneti incorporati con poli opposti inducono l'attrazione per la tenuta. (B) Vista in sezione trasversale del dispositivo riconfigurato che mostra il canale vascolare in rosa e il compartimento tissutale in verde. Adattato da Mansouri et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Vista assemblata del circuito di flusso. Il circuito è costituito da una pompa peristaltica, due serbatoi per l'alimentazione dei terreni cellulari e le fluttuazioni di smorzamento, tubi e uno stadio acrilico per tenere in posizione i componenti. Adattato da Mansouri et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Confronto tra HUVEC coltivati in modalità a pozzetto aperto e microfluidica. Le cellule sono state seminate e coltivate in pozzetti aperti per 24 ore per stabilire un monostrato confluente. Durante il successivo periodo di 24 ore, un set di dispositivi è stato riconfigurato in modalità microfluidica. (A) Cellule coltivate sotto flusso (10,7 dynes.cm-2 sforzo di taglio) allineate lungo la direzione del flusso (l'inserto mostra l'actina e i nuclei delle cellule rispettivamente in verde e blu). (B) Le cellule coltivate senza flusso in formato a pozzetto aperto non hanno mostrato alcun allineamento. La lunghezza delle barre nei grafici radar mostra il numero di celle nella direzione corrispondente. (C) Le cellule coltivate sotto flusso hanno mostrato una maggiore sovraregolazione dei geni KLF2 ed eNOS rispetto alla condizione di assenza di flusso (**p < 0,01, n = 3, media ± DS). Barre di scala = 100 μm. Adattato da Mansouri et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella supplementare 1: Sforzo di taglio sulla superficie della nanomembrana a diverse portate. Questa tabella fornisce informazioni sui valori di sollecitazione di taglio sulla superficie della nanomembrana a varie velocità di flusso. Fare clic qui per scaricare il file.
File di codifica supplementare 1: modello CAD dello stampo per stencil. Fare clic qui per scaricare il file.
File di codifica supplementare 2: modello CAD delle cavità tagliate al laser per lo stampo dello stencil. Fare clic qui per scaricare il file.
File di codifica supplementare 3: modello CAD del modulo di flusso. Fare clic qui per scaricare il file.
File di codifica supplementare 4: modello CAD delle cavità tagliate al laser per lo stampo del modulo di flusso. Fare clic qui per scaricare il file.
File di codifica supplementare 5: modello CAD dell'alloggiamento superiore. Fare clic qui per scaricare il file.
File di codifica supplementare 6: modello CAD dell'alloggiamento inferiore. Fare clic qui per scaricare il file.
File di codifica supplementare 7: modello CAD del tavolino acrilico. Fare clic qui per scaricare il file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lo scopo di questo protocollo è quello di sviluppare un metodo pratico per incorporare le capacità di flusso in una piattaforma a pozzetto aperto con una nanomembrana ultrasottile. In questo progetto, viene utilizzato un approccio di aggancio magnetico, che consente di passare dalla modalità a pozzetto aperto a quella fluidica durante gli esperimenti e combinando i vantaggi di entrambi gli approcci. A differenza delle piattaforme convenzionali incollate in modo permanente, la chiusura magnetica consente di smontare la piattaforma in punti convenienti durante il flusso di lavoro sperimentale 16,25,26,27. In questa piattaforma, le cellule vengono seminate e la barriera viene stabilita nel familiare formato a pozzetto aperto, quindi il sistema viene riconfigurato in modalità fluidica semplicemente aggiungendo un modulo di flusso e sigillandolo magneticamente. Questa riconfigurazione offre due vantaggi chiave: in primo luogo, consente la simulazione di condizioni fisiologiche esponendo il monostrato cellulare a sollecitazioni di taglio indotte da fluidi; In secondo luogo, facilita l'introduzione di componenti secondari come le cellule immunitarie in condizioni di flusso16. La funzione di chiusura magnetica offre un metodo di assemblaggio senza attrezzi, consentendo la commutazione su richiesta tra formati a pozzetto aperto e microfluidici. Di conseguenza, le analisi a valle, come l'immunocitochimica e l'estrazione dell'RNA, possono essere condotte nel familiare formato a pozzetto aperto utilizzando tecniche standard o utilizzando tecniche microfluidichea piacere 16.
La tenuta magnetica è un parametro critico del design che consente la riconfigurabilità della piattaforma e, pertanto, sono necessarie diverse considerazioni per il suo funzionamento accurato: (1) L'altezza dell'alloggiamento inferiore deve corrispondere all'altezza del modulo centrale (tolleranza: ±0,1 mm) per racchiudere correttamente il modulo. (2) L'altezza del modulo di flusso deve essere leggermente più alta del pozzetto del modulo centrale (0-0,1 mm). (3) Questo design è adattabile a un'ampia gamma di materiali e non impone che il modulo di flusso sia costruito con materiali elastomerici. L'elemento cruciale è quello di incorporare un materiale morbido, simile a una guarnizione, all'interfaccia tra il modulo di flusso e il chip della membrana per stabilire una tenuta affidabile. (4) Il diametro delle cavità tagliate al laser negli alloggiamenti per i magneti a pressare deve essere ottimizzato in base allo strumento utilizzato28. I magneti potrebbero staccarsi e causare perdite di flusso se il diametro della cavità è troppo grande, oppure gli alloggiamenti potrebbero rompersi durante l'inserimento del magnete se le cavità sono troppo piccole. Seguendo le considerazioni di cui sopra, l'approccio di assemblaggio magnetico qui introdotto può essere applicato per riconfigurare altri sistemi a pozzo aperto in modalità microfluidica.
Per avere la capacità di riconfigurazione, è necessario utilizzare uno stencil di patterning che consenta il posizionamento preciso delle cellule sulla superficie della membrana. Lo stencil assicura che nessuna cellula si trovi al di fuori della regione porosa della coltura (cioè sulla regione di supporto del silicio), che può essere danneggiata al momento dell'inserimento del modulo di flusso. Questo aspetto diventa particolarmente cruciale nei modelli di co-coltura perché le cellule seminate inavvertitamente in posizioni non intenzionali non possono partecipare attivamente allo sviluppo del tessuto barriera. Ciononostante, queste cellule fuori posto vengono solitamente recuperate durante il processo di lisi e possono potenzialmente introdurre distorsioni negli studi di espressione genica che studiano le interazioni tra le cellule attraverso la membrana20. La semina di cellule a pozzetto aperto utilizzando lo stencil migliora l'efficienza di semina mitigando le perdite cellulari lungo il percorso del flusso, che sono inerenti alle piattaforme microfluidiche convenzionali 4,16. Questa piattaforma è anche in grado di incorporare più tipi di celle e materiali ECM 15,16,17. Ad esempio, un idrogel carico di cellule può essere iniettato nel canale inferiore del dispositivo per imitare il compartimento tissutale mentre un endotelio si stabilisce sulla parte superiore della membrana.
Sebbene i moduli e i componenti magnetici possano essere riutilizzati, il mantenimento di una tenuta efficace in diversi usi può essere un problema a causa dell'allentamento dei magneti nell'alloggiamento e della diminuzione della forza di tenuta. Questo problema può essere mitigato realizzando nuovi moduli laminati per ogni esperimento o producendo componenti in serie utilizzando tecniche di stampaggio a iniezione o stampa 3D una volta che i progetti sono stati stabiliti. Nel metodo descritto in questo protocollo, il modulo di flusso viene posizionato manualmente nel modulo principale e la capacità di multiplexing e automazione del sistema è limitata. Per migliorare la produttività sperimentale, il modulo di flusso e l'alloggiamento superiore possono essere integrati in un unico modulo funzionale contenente canali di instradamento interni e connessioni di tubi standardizzate che perfondono simultaneamente più moduli in parallelo.
I componenti del modulo centrale a pozzetto aperto sono prodotti in serie e disponibili in commercio. Anche altri componenti del sistema, come il modulo di flusso, gli alloggiamenti e lo stencil di patterning, possono essere fabbricati su larga scala. Inoltre, la riconfigurabilità della piattaforma consente l'aggiunta di sensori e attuatori (ad esempio, modulo di resistenza elettrica transendoteliale, modulo di elettroporazione) per la stimolazione e le misurazioni in tempo reale. Nel complesso, questa piattaforma combina approcci convenzionali e microfluidici per supportare un uso diffuso al di fuori dei laboratori di ingegneria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.L.M. è co-fondatore di SiMPore, Inc. e detiene una partecipazione azionaria nella società. SiMPore sta commercializzando le tecnologie ultrasottili a base di silicio, comprese le membrane utilizzate in questo studio.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata in parte dal National Institute of Health con i numeri di premio R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 e la sovvenzione NSF CBET 2150798. Gli autori ringraziano la RIT Machine Shop per la fabbricazione di stampi in alluminio. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
References
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E.
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).
