פרוטוקול זה מתאר פלטפורמת תרבית תאים מבוססת קרום הניתנת להגדרה מחדש המשלבת את פורמט הבאר הפתוחה עם יכולות זרימת נוזלים. פלטפורמה זו תואמת לפרוטוקולים סטנדרטיים ומאפשרת מעברים הפיכים בין מצבי תרבית פתוחה ומיקרופלואידית, תוך מתן מענה לצרכים של מעבדות הנדסה וביו-מדע כאחד.
מערכות מיקרופיזיולוגיות הן פלטפורמות ממוזערות של תרביות תאים המשמשות לחיקוי המבנה והתפקוד של רקמות אנושיות בתנאי מעבדה. עם זאת, פלטפורמות אלה לא זכו לאימוץ נרחב במעבדות ביו-מדעיות שבהן גישות פתוחות מבוססות ממברנה משמשות כתקן הזהב לחיקוי מחסומי רקמות, למרות שאין להן יכולות זרימת נוזלים. בעיה זו ניתן לייחס בעיקר את חוסר התאימות של מערכות מיקרופיזיולוגיות קיימות עם פרוטוקולים סטנדרטיים וכלים שפותחו עבור מערכות באר פתוחה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת פלטפורמה מבוססת ממברנה הניתנת להגדרה מחדש עם מבנה באר פתוחה, יכולת שיפור זרימה ותאימות לפרוטוקולים קונבנציונליים. מערכת זו משתמשת בגישת הרכבה מגנטית המאפשרת מעבר הפיך בין מצב באר פתוחה למצב מיקרופלואיד. בגישה זו, למשתמשים יש את הגמישות להתחיל ניסוי בפורמט באר פתוחה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים ולהוסיף או להסיר יכולות זרימה לפי הצורך. כדי להדגים את השימוש המעשי במערכת זו ואת התאמתה לטכניקות סטנדרטיות, הוקמה מונושכבה של תאי אנדותל בפורמט פתוח. המערכת הוגדרה מחדש כדי להכניס זרימת נוזלים ולאחר מכן עברה לפורמט באר פתוחה כדי לבצע אימונוסטיין ומיצוי RNA. בשל תאימותו לפרוטוקולי באר פתוחה קונבנציונליים ויכולת שיפור זרימה, תכנון זה הניתן להגדרה מחדש צפוי להיות מאומץ הן על ידי מעבדות הנדסה והן על ידי מעבדות ביו-מדעיות.
מחסומי כלי הדם משמשים כממשק קריטי המפריד בין תא הדם לרקמה הסובבת אותו. הם ממלאים תפקיד קריטי בשימור הומאוסטזיס על ידי משיכת תאים חיסוניים, שליטה בחדירות מולקולרית והגנה מפני חדירת פתוגנים לרקמה 1,2. מודלים של תרביות חוץ גופיות פותחו כדי לחקות את המיקרו-סביבה in vivo, ומאפשרים חקירות שיטתיות של הגורמים והתנאים המשפיעים על תכונות המחסום במצבים בריאים וחוליםכאחד 3,4.
הגישה הנפוצה ביותר עבור מודלים כאלה של תרביות היא תצורת “באר פתוחה”5 דמוית Transwell, שבה קרום תרבית נקבובי חרוט מסילה מפריד בין תאים מלאים במדיה (איור 1A). בפורמט זה ניתן לזרוע תאים משני צדי הממברנה, ופותח מגוון רחב של פרוטוקולים ניסיוניים. עם זאת, מערכות אלה מוגבלות ביכולתן לספק את זרמי הנוזלים החיוניים לתמיכה בהבשלת מחסום ולחיקוי זרימת תאי מערכת החיסון הנראית in vivo 5,6. כתוצאה מכך, לא ניתן להשתמש בהם למחקרים הדורשים זרימות דינמיות המציגות מינוני תרופות, גירוי מכני או לחצים גזירים הנגרמים על ידי נוזל 6,7,8.
כדי להתגבר על המגבלות של מערכות באר פתוחה, פותחו פלטפורמות מיקרופלואידיות המשלבות קרומי תרבית נקבוביות עם תעלות פלואידיות הניתנות להתייחסות בנפרד9. פלטפורמות אלה מציעות שליטה מדויקת על ניתוב נוזלים, זילוח והכנסת תרכובות כימיות, גירוי גזירה מבוקר ויכולות חיבור תאים דינמיות 7,10,11,12,13. למרות היכולות המתקדמות שמספקות פלטפורמות מיקרופלואידיות, הן לא ראו אימוץ נרחב במעבדות ביו-מדעיות בשל פרוטוקולים מיקרופלואידים מורכבים וחוסר התאמתם לתהליכי עבודה ניסיוניים מבוססים 4,10,14.
כדי לגשר על הפער בין טכנולוגיות אלה, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במערכת מגנטית הניתנת להגדרה מחדש, מבוססת מודולים. מערכת זו ניתנת להחלפה בקלות בין מצב באר פתוחה למצב מיקרופלואיד בהתבסס על הצרכים הספציפיים של הניסוי. הפלטפורמה כוללת התקן באר פתוחה, המכונה m-μSiM (מערכת מיקרופיזיולוגית מודולרית המופעלת על ידי קרום סיליקון), עם קרום תרבית בעובי 100 ננומטר (ננו-ממברנה). לנומברנה זו נקבוביות גבוהה (15%) ושקיפות דמוית זכוכית, כפי שמודגם באיור 1B. הוא מפריד פיזית את התא העליון מהתעלה התחתונה, ומאפשר הובלה מולקולרית על פני סקאלות אורך פיזיולוגיות15. שלא כמו ממברנות קונבנציונליות חרוטות מסלול, שיש להן אתגרים ידועים בדימות תאים חיים עם דימות שדה בהיר, התכונות האופטיות והפיזיקליות החיוביות של הננו-ממברנה מאפשרות הדמיה ברורה של תאים משני צדי משטח הממברנה 15,16,17.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הייצור של מודולי זריעה וזרימה מיוחדים ומסביר את התצורה המגנטית מחדש של הפלטפורמה. הוא מדגים כיצד ניתן להשתמש בפלטפורמה כדי ליצור מחסומי אנדותל בתנאים סטטיים ודינמיים כאחד. הדגמה זו מגלה כי תאי אנדותל מתיישרים לאורך כיוון הזרימה, עם ויסות מוגבר של מטרות גנים רגישות לגזירה תחת גירוי גזירה.
מטרת פרוטוקול זה היא לפתח שיטה מעשית לשילוב יכולות זרימה בפלטפורמת באר פתוחה הכוללת ננו-ממברנה דקה במיוחד. בתכנון זה נעשה שימוש בגישת הצמדה מגנטית, המאפשרת מעבר בין מצב באר פתוחה למצב זורם במהלך ניסויים ושילוב היתרונות של שתי הגישות. שלא כמו פלטפורמות קונבנציונליות מלוכדות לצמיתות, הצמדה…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות תחת מספרי פרסים R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 ומענק NSF CBET 2150798. המחברים מודים ל-RIT Machine Shop על ייצור עובש אלומיניום. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |