静的バリア組織モデルを動的微生理学的システムに変換する
Summary
このプロトコルは、オープンウェルフォーマットと流体フロー機能を統合する再構成可能なメンブレンベースの細胞培養プラットフォームについて説明しています。このプラットフォームは標準プロトコルと互換性があり、オープンウェル培養モードとマイクロ流体培養モード間の可逆的な移行を可能にし、工学とバイオサイエンスの両方のラボのニーズに対応します。
Abstract
マイクロ生理学的システムは、実験室でヒト組織の構造と機能を模倣するために使用される小型化された細胞培養プラットフォームです。しかし、これらのプラットフォームは、流体フロー機能がないにもかかわらず、オープンウェルのメンブレンベースのアプローチが組織バリアを模倣するためのゴールドスタンダードとして機能するバイオサイエンスラボでは広く採用されていません。この問題は、主に、既存の微生理学的システムと、オープンウェルシステム用に開発された標準的なプロトコルおよびツールとの非互換性に起因している可能性があります。
ここでは、オープンウェル構造、フローエンハンスメント機能、および従来のプロトコルとの互換性を備えた再構成可能なメンブレンベースのプラットフォームを作成するためのプロトコルを紹介します。このシステムは、オープンウェルモードとマイクロ流体モードの可逆的な切り替えを可能にする磁気アセンブリアプローチを利用しています。このアプローチにより、ユーザーは標準プロトコルを使用してオープンウェルフォーマットで実験を開始し、必要に応じてフロー機能を追加または削除できる柔軟性が得られます。このシステムの実用的使用法および標準技術との適合性を実証するために、内皮細胞単層をオープンウェルフォーマットで確立した。流体の流れを導入するようにシステムを再構成し、その後、免疫染色とRNA抽出を行うためにオープンウェルフォーマットに切り替えました。従来のオープンウェルプロトコルとの互換性と流量増強機能により、この再構成可能な設計は、工学とバイオサイエンスの両方の研究室で採用されることが期待されています。
Introduction
血管バリアは、血液区画を周囲の組織から分離する重要なインターフェースとして機能します。それらは、免疫細胞を引き付け、分子透過性を制御し、組織への病原体の侵入を防ぐことにより、恒常性を維持する上で重要な役割を果たします1,2。in vitro培養モデルは、in vivo微小環境を模倣して開発されており、健康な状態と病気の状態の両方でバリア特性に影響を与える要因と条件の体系的な調査を可能にしています3,4。
このような培養モデルに最も広く用いられているアプローチは、多孔質のトラックエッチングされた培養膜が培地で満たされた区画を分離する、トランズウェルのような「オープンウェル」構成5である(図1A)。このフォーマットでは、膜の両側に細胞を播種することができ、幅広い実験プロトコルが開発されています。しかし、これらのシステムは、バリアの成熟をサポートし、in vivoで見られる免疫細胞の循環を模倣するために不可欠な流体の流れを提供する能力に限界があります5,6。したがって、薬物投与量、機械的刺激、または流体誘起せん断応力6,7,8を導入する動的流れを必要とする研究には使用できません。
オープンウェルシステムの限界を克服するために、多孔質培養膜と個別にアドレス指定可能な流路を組み合わせたマイクロ流体プラットフォームが開発されました9。これらのプラットホームは、流体ルーティング、灌流、化合物の導入、制御されたせん断刺激、および動的細胞添加機能7,10,11,12,13を正確に制御します。マイクロ流体プラットフォームが提供する高度な機能にもかかわらず、複雑なマイクロ流体プロトコルと確立された実験ワークフローとの互換性がないため、バイオサイエンスラボでは広く採用されていません4,10,14。
これらの技術間のギャップを埋めるために、磁気的に再構成可能なモジュールベースのシステムを採用したプロトコルを紹介します。このシステムは、実験の特定のニーズに基づいて、オープンウェルモードとマイクロ流体モードを簡単に切り替えることができます。このプラットフォームは、厚さ100 nmの培養膜(ナノメンブレン)を備えたm-μSiM(シリコン膜によって実現されるモジュール式微生理学的システム)として知られるオープンウェルデバイスを備えています。このナノメンブレンは、図1Bに示すように、高い空隙率(15%)とガラスのような透明性を備えています。上部コンパートメントを下部チャネルから物理的に分離し、生理学的長さスケール15を横断する分子輸送を可能にします。明視野イメージングで生細胞をイメージングする際に既知の課題がある従来のトラックエッチングメンブレンとは異なり、ナノメンブレンの良好な光学的および物理的特性により、メンブレン表面の両側の細胞を鮮明に可視化できます15,16,17。
本プロトコルは、特殊な播種およびフローモジュールの製造の概要を説明し、プラットフォームの磁気再構成を説明します。これは、静的および動的条件下で内皮バリアを確立するためにプラットフォームをどのように使用できるかを示しています。この実証により、内皮細胞が流れ方向に沿って整列し、せん断刺激下でせん断感受性遺伝子標的がアップレギュレーションされることが明らかになりました。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの目的は、超薄膜ナノメンブレンを特徴とするオープンウェルプラットフォームにフロー機能を組み込むための実用的な方法を開発することです。この設計では、磁気ラッチング方式を採用しており、実験中にオープンウェルモードと流路モードを切り替えて、両方のアプローチの利点を組み合わせることができます。従来の恒久的に接着されたプラットフォームとは異なり?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)から、R43GM137651、R61HL154249、R16GM146687、NSFの助成金CBET 2150798の下で資金提供を受けました。著者らは、アルミニウム金型製作のRITマシンショップに感謝しています。内容は著者の責任であり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
Referências
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