정적 장벽 조직 모델을 동적 미세생리학 시스템으로 변환
Summary
이 프로토콜은 개방형 웰 형식과 유체 흐름 기능을 통합하는 재구성 가능한 멤브레인 기반 세포 배양 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 표준 프로토콜과 호환되며 오픈 웰과 미세유체 배양 모드 간의 가역적 전환이 가능하여 엔지니어링 및 생명과학 실험실의 요구 사항을 모두 수용할 수 있습니다.
Abstract
미세생리학적 시스템은 실험실 환경에서 인간 조직의 구조와 기능을 모방하는 데 사용되는 소형 세포 배양 플랫폼입니다. 그러나 이러한 플랫폼은 유체 흐름 기능이 부족함에도 불구하고 개방형 웰, 멤브레인 기반 접근 방식이 조직 장벽을 모방하기 위한 황금 표준 역할을 하는 생명 과학 실험실에서 널리 채택되지 않았습니다. 이 문제는 주로 기존 미세생리학 시스템과 개방형 웰 시스템용으로 개발된 표준 프로토콜 및 도구의 비호환성에 기인할 수 있습니다.
여기에서는 개방형 웰 구조, 흐름 향상 기능 및 기존 프로토콜과의 호환성을 갖춘 재구성 가능한 멤브레인 기반 플랫폼을 만들기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 오픈 웰과 미세유체 모드 간의 가역적 전환을 가능하게 하는 자기 조립 방식을 활용합니다. 이 접근 방식을 통해 사용자는 표준 프로토콜을 사용하여 개방형 웰 형식으로 실험을 시작하고 필요에 따라 흐름 기능을 추가하거나 제거할 수 있는 유연성을 갖게 됩니다. 이 시스템의 실제 사용과 표준 기술과의 호환성을 입증하기 위해 내피 세포 단층이 개방형 웰 형식으로 설정되었습니다. 유체 흐름을 도입하도록 시스템을 재구성한 다음 면역염색 및 RNA 추출을 수행하기 위해 개방형 웰 형식으로 전환했습니다. 기존의 개방형 웰 프로토콜과의 호환성 및 흐름 향상 기능으로 인해 이 재구성 가능한 설계는 엔지니어링 및 생명과학 실험실 모두에서 채택될 것으로 예상됩니다.
Introduction
혈관 장벽은 주변 조직으로부터 혈액 구획을 분리하는 중요한 인터페이스 역할을 합니다. 이들은 면역 세포를 끌어당기고, 분자 투과성을 조절하며, 병원균이 조직으로 침입하는 것을 막아 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다 1,2. in vitro 배양 모델은 in vivo 미세환경을 모방하기 위해 개발되어 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 장벽 특성에 영향을 미치는 요인과 조건에 대한 체계적인 조사를 가능하게 합니다 3,4.
이러한 배양 모델에 가장 널리 사용되는 접근법은 트랜스웰(Transwell)과 같은 “open-well” 구성(open-well) 구성5으로, 다공성의 트랙 에칭 배양막이 배지로 채워진 구획을 분리합니다(그림 1A). 이 형식에서는 세포막의 양쪽에 세포를 파종할 수 있으며 광범위한 실험 프로토콜이 개발되었습니다. 그러나, 이들 시스템은 장벽 성숙을 지원하고 생체 내 5,6에서 볼 수 있는 면역 세포 순환을 모방하는 데 필수적인 유체 흐름을 제공하는 능력에 한계가 있다. 따라서 약물 투여량, 기계적 자극 또는 유체 유도 전단 응력 6,7,8을 도입하는 동적 흐름이 필요한 연구에는 사용할 수 없습니다.
개방형 웰 시스템의 한계를 극복하기 위해 다공성 배양막과 개별적으로 주소 지정이 가능한 유체 채널을 결합한 미세유체 플랫폼이 개발되었습니다9. 이 플랫폼은 유체 라우팅, 관류 및 화합물 도입, 제어된 전단 자극 및 동적 세포 추가 기능에 대한 정밀한 제어를 제공합니다 7,10,11,12,13. 미세유체 플랫폼이 제공하는 고급 기능에도 불구하고 복잡한 미세유체 프로토콜과 확립된 실험 워크플로와의 비호환성으로 인해 생명과학 실험실에서 널리 채택되지 않았습니다 4,10,14.
이러한 기술 간의 격차를 해소하기 위해 당사는 자기적으로 재구성 가능한 모듈 기반 시스템을 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 실험의 특정 요구 사항에 따라 개방형 웰 모드와 미세유체 모드 사이를 쉽게 전환할 수 있습니다. 이 플랫폼은 100nm 두께의 배양막(나노막)이 있는 m-μSiM(실리콘 멤브레인에 의해 활성화되는 모듈식 미세생리학 시스템)으로 알려진 개방형 웰 장치를 갖추고 있습니다. 이 나노멤브레인은 그림 1B와 같이 높은 다공성(15%)과 유리와 같은 투명도를 가지고 있습니다. 상부 구획을 하부 채널로부터 물리적으로 분리하여, 생리학적 길이 척도15를 가로지르는 분자 수송을 허용한다. 명시야 이미징으로 살아있는 세포를 이미징하는 데 문제가 있는 것으로 알려진 기존의 트랙 에칭 멤브레인과 달리 나노멤브레인의 유리한 광학 및 물리적 특성은 멤브레인표면 15,16,17의 양쪽에 있는 세포의 명확한 시각화를 가능하게 합니다.
본 프로토콜은 특수 시드 및 플로우 모듈의 제작을 간략하게 설명하고 플랫폼의 자기 재구성을 설명합니다. 정적 및 동적 조건 모두에서 내피 장벽을 구축하기 위해 플랫폼을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 시연은 내피 세포가 전단 자극 하에서 전단 민감성 유전자 표적의 상향 조절과 함께 흐름 방향을 따라 정렬됨을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 목적은 초박형 나노멤브레인을 특징으로 하는 개방형 웰 플랫폼에 유동 기능을 통합하기 위한 실용적인 방법을 개발하는 것입니다. 이 설계에서는 자기 래칭 접근 방식이 사용되어 실험 중에 오픈 웰 모드와 유체 모드 사이를 전환하고 두 접근 방식의 장점을 결합할 수 있습니다. 종래의 영구적으로 결합된 플랫폼과는 달리, 마그네틱 래칭은 플랫폼이 실험 워크플로우(16,25,26,27…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 자금 지원을 받아 R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 및 NSF 보조금 CBET 2150798에 따라 수여되었습니다. 저자는 알루미늄 금형 제작에 대해 RIT Machine Shop에 감사를 표합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
Referências
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengenharia. 10 (5), 519 (2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).
