Statische barrièreweefselmodellen transformeren in dynamische microfysiologische systemen
Summary
Dit protocol beschrijft een herconfigureerbaar, op membraan gebaseerd celkweekplatform dat het open-well-formaat integreert met vloeistofstroommogelijkheden. Dit platform is compatibel met standaardprotocollen en maakt omkeerbare overgangen mogelijk tussen open-well en microfluïdische kweekmodi, om tegemoet te komen aan de behoeften van zowel technische als biowetenschappelijke laboratoria.
Abstract
Microfysiologische systemen zijn geminiaturiseerde celkweekplatforms die worden gebruikt om de structuur en functie van menselijke weefsels in een laboratoriumomgeving na te bootsen. Deze platforms zijn echter niet wijdverbreid toegepast in biowetenschappelijke laboratoria waar open-well, membraangebaseerde benaderingen dienen als de gouden standaard voor het nabootsen van weefselbarrières, ondanks het ontbreken van vloeistofstroommogelijkheden. Dit probleem kan voornamelijk worden toegeschreven aan de onverenigbaarheid van bestaande microfysiologische systemen met standaardprotocollen en hulpmiddelen die zijn ontwikkeld voor open-well-systemen.
Hier presenteren we een protocol voor het creëren van een herconfigureerbaar membraangebaseerd platform met een open-well-structuur, stroomverbeteringsmogelijkheden en compatibiliteit met conventionele protocollen. Dit systeem maakt gebruik van een magnetische assemblagebenadering die omkeerbaar schakelen tussen open-well en microfluïdische modi mogelijk maakt. Met deze aanpak hebben gebruikers de flexibiliteit om een experiment te starten in het open-well-formaat met behulp van standaardprotocollen en indien nodig stroommogelijkheden toe te voegen of te verwijderen. Om het praktische gebruik van dit systeem en de compatibiliteit met standaardtechnieken aan te tonen, werd een endotheelcelmonolaag in een open-well-formaat vastgesteld. Het systeem werd opnieuw geconfigureerd om vloeistofstroom te introduceren en schakelde vervolgens over op het open-well-formaat om immunokleuring en RNA-extractie uit te voeren. Vanwege de compatibiliteit met conventionele open-well-protocollen en de mogelijkheid om de stroming te verbeteren, zal dit herconfigureerbare ontwerp naar verwachting worden overgenomen door zowel technische als biowetenschappelijke laboratoria.
Introduction
Vasculaire barrières dienen als een kritische interface die het bloedcompartiment scheidt van het omringende weefsel. Ze spelen een cruciale rol bij het behoud van de homeostase door immuuncellen aan te trekken, de moleculaire permeabiliteit te beheersen en af te schermen tegen het binnendringen van ziekteverwekkers in hetweefsel1,2. Er zijn in-vitrokweekmodellen ontwikkeld om de in vivo micro-omgeving na te bootsen, waardoor systematisch onderzoek mogelijk is naar de factoren en omstandigheden die van invloed zijn op de barrière-eigenschappen in zowel gezonde als zieke toestanden 3,4.
De meest gebruikte benadering voor dergelijke kweekmodellen is de Transwell-achtige “open-well”-configuratie5, waarbij een poreus, spoorgeëtst kweekmembraan met media gevulde compartimenten scheidt (Figuur 1A). In dit formaat kunnen cellen aan weerszijden van het membraan worden gezaaid en is een breed scala aan experimentele protocollen ontwikkeld. Deze systemen zijn echter beperkt in hun vermogen om de vloeistofstromen te leveren die essentieel zijn voor het ondersteunen van barrièrerijping en het nabootsen van de circulatie van immuuncellen die in vivo 5,6 worden gezien. Bijgevolg kunnen ze niet worden gebruikt voor onderzoeken die dynamische stromen vereisen die geneesmiddeldoses, mechanische stimulatie of door vloeistof geïnduceerde schuifspanningen introduceren 6,7,8.
Om de beperkingen van open-well-systemen te overwinnen, zijn microfluïdische platforms ontwikkeld die poreuze kweekmembranen combineren met individueel adresseerbare fluïdische kanalen9. Deze platforms bieden nauwkeurige controle over vloeistofroutering, perfusie en de introductie van chemische verbindingen, gecontroleerde afschuifstimulatie en dynamische celadditiemogelijkheden 7,10,11,12,13. Ondanks de geavanceerde mogelijkheden die microfluïdische platforms bieden, zijn ze niet wijdverbreid toegepast in biowetenschappelijke laboratoria vanwege complexe microfluïdische protocollen en hun onverenigbaarheid met gevestigde experimentele workflows 4,10,14.
Om de kloof tussen deze technologieën te overbruggen, presenteren we een protocol dat gebruik maakt van een magnetisch herconfigureerbaar, op modules gebaseerd systeem. Dit systeem kan eenvoudig worden omgeschakeld tussen open-well en microfluïdische modi op basis van de specifieke behoeften van het experiment. Het platform beschikt over een open-well-apparaat, bekend als m-μSiM (modulair microfysiologisch systeem mogelijk gemaakt door een siliciummembraan), met een 100 nm dik kweekmembraan (nanomembraan). Dit nanomembraan heeft een hoge porositeit (15%) en glasachtige transparantie, zoals geïllustreerd in figuur 1B. Het scheidt fysiek het bovenste compartiment van een onderste kanaal, waardoor moleculair transport over fysiologische lengteschalenmogelijk is 15. In tegenstelling tot conventionele spoorgeëtste membranen, die bekende uitdagingen hebben bij het afbeelden van levende cellen met helderveldbeeldvorming, maken de gunstige optische en fysische eigenschappen van het nanomembraan een duidelijke visualisatie van cellen aan weerszijden van het membraanoppervlak mogelijk 15,16,17.
Het huidige protocol schetst de fabricage van gespecialiseerde zaai- en stromingsmodules en verklaart de magnetische herconfiguratie van het platform. Het laat zien hoe het platform kan worden gebruikt om endotheliale barrières op te zetten onder zowel statische als dynamische omstandigheden. Deze demonstratie laat zien dat endotheelcellen zich uitlijnen langs de stroomrichting, met een opregulatie van afschuifgevoelige gendoelen onder schuifstimulatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van dit protocol is om een praktische methode te ontwikkelen voor het integreren van stromingsmogelijkheden in een open-well platform met een ultradun nanomembraan. In dit ontwerp wordt gebruik gemaakt van een magnetische vergrendelingsbenadering, waardoor tijdens experimenten kan worden geschakeld tussen open-well- en fluïdische modi en de voordelen van beide benaderingen kunnen worden gecombineerd. In tegenstelling tot conventionele permanent gebonden platforms, maakt magnetische vergrendeling het mogelijk om…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door het National Institute of Health onder de toekenningsnummers R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 en NSF-subsidie CBET 2150798. De auteurs bedanken de RIT Machine Shop voor de fabricage van aluminium matrijzen. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
Referências
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengenharia. 10 (5), 519 (2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).
