Umwandlung von statischen Barrieregewebemodellen in dynamische mikrophysiologische Systeme
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine rekonfigurierbare membranbasierte Zellkulturplattform, die das Open-Well-Format mit Flüssigkeitsflussfunktionen integriert. Diese Plattform ist mit Standardprotokollen kompatibel und ermöglicht reversible Übergänge zwischen Open-Well- und mikrofluidischen Kulturmodi, um den Anforderungen von Ingenieur- und Biowissenschaftslabors gerecht zu werden.
Abstract
Mikrophysiologische Systeme sind miniaturisierte Zellkulturplattformen, die verwendet werden, um die Struktur und Funktion menschlicher Gewebe in einer Laborumgebung nachzuahmen. Diese Plattformen haben jedoch keine breite Akzeptanz in biowissenschaftlichen Labors gefunden, wo membranbasierte Ansätze mit offenen Bohrlöchern als Goldstandard für die Nachahmung von Gewebebarrieren dienen, obwohl sie keine Flüssigkeitsflussfähigkeiten haben. Dieses Problem kann in erster Linie auf die Inkompatibilität bestehender mikrophysiologischer Systeme mit Standardprotokollen und -werkzeugen zurückgeführt werden, die für Open-Well-Systeme entwickelt wurden.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Erstellung einer rekonfigurierbaren membranbasierten Plattform mit einer Open-Well-Struktur, Durchflussverbesserungsfähigkeit und Kompatibilität mit herkömmlichen Protokollen vor. Dieses System verwendet einen magnetischen Montageansatz, der ein reversibles Umschalten zwischen Open-Well- und Mikrofluidik-Modus ermöglicht. Mit diesem Ansatz haben Benutzer die Flexibilität, ein Experiment im Open-Well-Format mit Standardprotokollen zu beginnen und bei Bedarf Durchflussfunktionen hinzuzufügen oder zu entfernen. Um die praktische Anwendung dieses Systems und seine Kompatibilität mit Standardtechniken zu demonstrieren, wurde eine Endothelzell-Monoschicht in einem Open-Well-Format etabliert. Das System wurde neu konfiguriert, um einen Flüssigkeitsfluss einzuführen, und dann auf das Open-Well-Format umgestellt, um Immunfärbung und RNA-Extraktion durchzuführen. Aufgrund seiner Kompatibilität mit herkömmlichen Open-Well-Protokollen und der Fähigkeit zur Flussverbesserung wird erwartet, dass dieses rekonfigurierbare Design sowohl von technischen als auch von biowissenschaftlichen Labors übernommen wird.
Introduction
Gefäßbarrieren dienen als kritische Schnittstelle, die das Blutkompartiment vom umgebenden Gewebe trennt. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der Homöostase, indem sie Immunzellen anziehen, die molekulare Permeabilität kontrollieren und das Eindringen von Krankheitserregern in das Gewebe verhindern 1,2. In-vitro-Kulturmodelle wurden entwickelt, um die In-vivo-Mikroumgebung nachzuahmen und systematische Untersuchungen der Faktoren und Bedingungen zu ermöglichen, die die Barriereeigenschaften sowohl im gesunden als auch im kranken Zustand beeinflussen 3,4.
Der am weitesten verbreitete Ansatz für solche Kulturmodelle ist die Transwell-ähnliche “Open-Well”-Konfiguration5, bei der eine poröse, spurgeätzte Kulturmembran mediengefüllte Kompartimente trennt (Abbildung 1A). In diesem Format können Zellen auf beiden Seiten der Membran ausgesät werden, und es wurde eine breite Palette von experimentellen Protokollen entwickelt. Diese Systeme sind jedoch nur begrenzt in ihrer Fähigkeit, die Flüssigkeitsströme bereitzustellen, die für die Unterstützung der Barrierereifung und die Nachahmung der Immunzellzirkulation in vivo unerlässlich sind 5,6. Folglich können sie nicht für Studien verwendet werden, die dynamische Strömungen erfordern, die Arzneimitteldosen, mechanische Stimulation oder flüssigkeitsinduzierte Scherspannungen einführen 6,7,8.
Um die Einschränkungen von Open-Well-Systemen zu überwinden, wurden mikrofluidische Plattformen entwickelt, die poröse Kulturmembranen mit individuell adressierbaren fluidischen Kanälen kombinieren9. Diese Plattformen bieten eine präzise Kontrolle über das Routing von Flüssigkeiten, die Perfusion und das Einbringen chemischer Verbindungen, eine kontrollierte Scherstimulation und dynamische Zelladditionsfunktionen 7,10,11,12,13. Trotz der fortschrittlichen Fähigkeiten, die mikrofluidische Plattformen bieten, haben sie aufgrund komplexer mikrofluidischer Protokolle und ihrer Inkompatibilität mit etablierten experimentellen Arbeitsabläufen keine weit verbreitete Akzeptanz in biowissenschaftlichen Laborsgefunden 4,10,14.
Um die Lücke zwischen diesen Technologien zu schließen, stellen wir ein Protokoll vor, das ein magnetisch rekonfigurierbares, modulbasiertes System verwendet. Dieses System kann je nach den spezifischen Anforderungen des Experiments einfach zwischen Open-Well- und Mikrofluidik-Modus umgeschaltet werden. Die Plattform verfügt über ein Open-Well-Gerät, bekannt als m-μSiM (modulares mikrophysiologisches System, das durch eine Siliziummembran ermöglicht wird), mit einer 100 nm dicken Kulturmembran (Nanomembran). Diese Nanomembran besitzt eine hohe Porosität (15 %) und glasartige Transparenz, wie in Abbildung 1B dargestellt. Es trennt physikalisch das obere Kompartiment von einem unteren Kanal und ermöglicht so den molekularen Transport über physiologische Längenskalen15. Im Gegensatz zu herkömmlichen spurgeätzten Membranen, die bekannte Herausforderungen bei der Bildgebung lebender Zellen mit Hellfeld-Bildgebung haben, ermöglichen die günstigen optischen und physikalischen Eigenschaften der Nanomembran eine klare Visualisierung von Zellen auf beiden Seiten der Membranoberfläche 15,16,17.
Das vorliegende Protokoll skizziert die Herstellung von spezialisierten Seeding- und Flow-Modulen und erklärt die magnetische Rekonfiguration der Plattform. Es zeigt, wie die Plattform eingesetzt werden kann, um Endothelbarrieren sowohl unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen zu etablieren. Diese Demonstration zeigt, dass sich Endothelzellen entlang der Flussrichtung ausrichten, wobei die scherempfindlichen Genziele unter Scherstimulation hochreguliert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ziel dieses Protokolls ist es, eine praktische Methode zu entwickeln, um Durchflussfähigkeiten in eine Open-Well-Plattform mit einer ultradünnen Nanomembran zu integrieren. Bei diesem Design wird ein magnetischer Verriegelungsansatz verwendet, der es ermöglicht, während der Experimente zwischen Open-Well- und Fluidic-Modus zu wechseln und die Vorteile beider Ansätze zu kombinieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen dauerhaft verklebten Plattformen ermöglicht die magnetische Verriegelung die Demontage der Plattform an …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde teilweise vom National Institute of Health unter den Fördernummern R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 und NSF-Zuschuss CBET 2150798 finanziert. Die Autoren danken dem RIT Machine Shop für die Herstellung von Aluminiumformen. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.
Materials
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
Referências
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