Omvandling av statiska barriärvävnadsmodeller till dynamiska mikrofysiologiska system
Summary
Detta protokoll beskriver en omkonfigurerbar membranbaserad cellodlingsplattform som integrerar formatet med öppen brunn med vätskeflödeskapacitet. Denna plattform är kompatibel med standardprotokoll och möjliggör reversibla övergångar mellan odlingslägen med öppen brunn och mikrofluidik, vilket tillgodoser behoven hos både tekniska och biovetenskapliga laboratorier.
Abstract
Mikrofysiologiska system är miniatyriserade cellodlingsplattformar som används för att efterlikna strukturen och funktionen hos mänskliga vävnader i laboratoriemiljö. Dessa plattformar har dock inte fått någon utbredd användning i biovetenskapliga laboratorier där membranbaserade metoder med öppen brunn fungerar som guldstandard för att efterlikna vävnadsbarriärer, trots att de saknar vätskeflödeskapacitet. Detta problem kan främst hänföras till inkompatibiliteten mellan befintliga mikrofysiologiska system och standardprotokoll och verktyg som utvecklats för öppna brunnssystem.
Här presenterar vi ett protokoll för att skapa en omkonfigurerbar membranbaserad plattform med en öppen brunnsstruktur, flödesförbättringsförmåga och kompatibilitet med konventionella protokoll. Detta system använder en magnetisk monteringsmetod som möjliggör reversibel växling mellan öppen brunn och mikrofluidik. Med den här metoden har användarna flexibiliteten att påbörja ett experiment i formatet med öppen brunn med hjälp av standardprotokoll och lägga till eller ta bort flödesfunktioner efter behov. För att demonstrera den praktiska användningen av detta system och dess kompatibilitet med standardtekniker etablerades ett endotelcellsmonolager i ett öppet brunnsformat. Systemet konfigurerades om för att introducera vätskeflöde och bytte sedan till det öppna brunnsformatet för att utföra immunfärgning och RNA-extraktion. På grund av dess kompatibilitet med konventionella öppna brunnsprotokoll och flödesförbättringsförmåga förväntas denna omkonfigurerbara design att antas av både tekniska och biovetenskapliga laboratorier.
Introduction
Vaskulära barriärer fungerar som ett kritiskt gränssnitt som separerar blodfacket från den omgivande vävnaden. De spelar en avgörande roll för att bevara homeostas genom att attrahera immunceller, kontrollera molekylär permeabilitet och skydda mot intrång av patogener i vävnaden 1,2. In vitro-odlingsmodeller har utvecklats för att efterlikna mikromiljön in vivo, vilket möjliggör systematiska undersökningar av de faktorer och förhållanden som påverkar barriäregenskaper i både friska och sjuka tillstånd 3,4.
Den mest använda metoden för sådana odlingsmodeller är den Transwell-liknande “open-well”-konfigurationen5, där ett poröst, spåretsat odlingsmembran separerar mediefyllda fack (figur 1A). I detta format kan celler sås på vardera sidan av membranet, och ett brett spektrum av experimentella protokoll har utvecklats. Dessa system är dock begränsade i sin förmåga att tillhandahålla de vätskeflöden som är nödvändiga för att stödja barriärmognad och efterlikna immuncellscirkulationen som ses in vivo 5,6. Följaktligen kan de inte användas för studier som kräver dynamiska flöden som introducerar läkemedelsdoser, mekanisk stimulering eller vätskeinducerade skjuvspänningar 6,7,8.
För att övervinna begränsningarna i öppna brunnssystem har mikrofluidikplattformar som kombinerar porösa odlingsmembran med individuellt adresserbara fluidiska kanaler utvecklats9. Dessa plattformar erbjuder exakt kontroll över vätskedirigering, perfusion och införande av kemiska föreningar, kontrollerad skjuvstimulering och dynamiska celladditionsmöjligheter 7,10,11,12,13. Trots de avancerade funktionerna som tillhandahålls av mikrofluidikplattformar har de inte sett någon utbredd användning i biovetenskapliga laboratorier på grund av komplexa mikrofluidiska protokoll och deras inkompatibilitet med etablerade experimentella arbetsflöden 4,10,14.
För att överbrygga gapet mellan dessa tekniker presenterar vi ett protokoll som använder ett magnetiskt omkonfigurerbart, modulbaserat system. Detta system kan enkelt växlas mellan öppen brunn och mikrofluidikläge baserat på experimentets specifika behov. Plattformen har en enhet med öppen brunn, känd som m-μSiM (modulärt mikrofysiologiskt system som möjliggörs av ett kiselmembran), med ett 100 nm tjockt odlingsmembran (nanomembran). Detta nanomembran har hög porositet (15 %) och glasliknande transparens, vilket illustreras i figur 1B. Den separerar fysiskt det övre facket från en nedre kanal, vilket möjliggör molekylär transport över fysiologiska längdskalor15. Till skillnad från konventionella spåretsade membran, som har kända utmaningar med att avbilda levande celler med ljusfältsavbildning, möjliggör nanomembranets gynnsamma optiska och fysikaliska egenskaper tydlig visualisering av celler på vardera sidan av membranytan 15,16,17.
Det nuvarande protokollet beskriver tillverkningen av specialiserade sådd- och flödesmoduler och förklarar den magnetiska omkonfigurationen av plattformen. Den visar hur plattformen kan användas för att etablera endotelbarriärer under både statiska och dynamiska förhållanden. Denna demonstration avslöjar att endotelceller anpassar sig längs flödesriktningen, med en uppreglering av skjuvkänsliga genmål under skjuvstimulering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syftet med detta protokoll är att utveckla en praktisk metod för att införliva flödeskapacitet i en öppen brunnsplattform med ett ultratunt nanomembran. I denna design används en magnetisk låsningsmetod, vilket gör det möjligt att växla mellan öppen brunn och fluidiska lägen under experiment och kombinera fördelarna med båda metoderna. Till skillnad från konventionella permanent bundna plattformar gör magnetisk låsning att plattformen kan demonteras vid lämpliga punkter under det experimentella arbetsfl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades delvis av National Institute of Health under tilldelningsnummer R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 och NSF-anslag CBET 2150798. Författarna tackar RIT Machine Shop för tillverkning av aluminiumformar. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis National Institutes of Healths officiella åsikter.
Materials
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
Referências
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengenharia. 10 (5), 519 (2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).
