Summary
マルチプレックスサイクリック免疫組織化学は、抗原抗体のインキュベーション、画像スキャン、画像のアライメントと統合を繰り返すことで、複数のマーカーを同時にin situ で検出することができます。ここでは、肺癌および対の脳転移サンプルにおいて、この技術を用いて免疫細胞の基質を同定するための操作プロトコルを紹介します。
Abstract
腫瘍微小環境には、宿主細胞、腫瘍細胞、免疫細胞、間質細胞、および血管系の間の相互作用が含まれます。免疫細胞のサブセットと標的タンパク質を特徴づけ、空間的に組織化することは、予後および治療の目的にとって非常に重要です。これにより、マルチプレックス免疫組織化学染色法が開発されました。マルチプレックス蛍光免疫組織化学は、複数のマーカーの同時検出を可能にし、細胞機能と細胞間相互作用の包括的な理解を促進します。この論文では、マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学アッセイのワークフローと、リンパ球サブセットの定量分析におけるその応用について説明します。マルチプレックス環状蛍光免疫組織化学染色は、抗原賦活化、環状抗体インキュベーション、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織スライドでの染色など、標準的な免疫組織化学と同様の手順と試薬に従います。抗原抗体反応中に、異なる種からの抗体の混合物が調製されます。抗原賦活化時間や抗体濃度などの条件が最適化され、検証され、S/N比が向上します。この技術は再現性があり、免疫療法の研究や臨床応用のための貴重なツールとして機能します。
Introduction
脳転移(BM)は最も一般的な中枢神経系(CNS)腫瘍であり、非小細胞肺がん(NSCLC)症例のほぼ半数に発生し、予後不良である1。NSCLC患者の推定10%〜20%は、初期診断時にすでにBMを患っており、NSCLC症例の約40%は治療の過程でBMを発症します2。腫瘍微小環境(TME)は、血管、線維芽細胞、マクロファージ、細胞外マトリックス(ECM)、リンパ球、骨髄由来免疫細胞、シグナル伝達分子などのさまざまな構成要素を含む、NSCLCの発生およびBMと密接に関連しています3,4。微小環境免疫細胞は、がん細胞の増殖と発達に影響を与える上で重要な役割を果たします。脳転移は、複雑な免疫学的微小環境とシグナル伝達プロセスを特徴とする多数の潜在的な治療標的を提示します。例えば、PD-1阻害剤は、肺がん脳転移(LCBM)患者に対して、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)として臨床効果を示しています。しかしながら、PD-1療法に対する反応の頻度は、原発性NSCLCとLCBM5の間で異なり、腫瘍免疫微小環境が重要なICI調節因子として作用することが示唆されている。
免疫組織化学(IHC)は、生物学、基礎医学、病理学の分野で非常に貴重なツールです6。この検出法は、組織スライド上の抗原抗体の相互作用を通じて抗原発現を可視化する7。IHCは、予測マーカーの診断、予後マーカーの評価、標的療法の指導、腫瘍細胞の生物学的機能の調査に使用されます8。しかし、従来のIHC法では、一度に1つのバイオマーカーしか検出できません。この限界に対処するために、免疫組織化化学技術の革新により、明視野と蛍光野の両方で、同じ組織スライド上の複数のタンパク質マーカーを同時に同定できるマルチプレックス蛍光免疫組織化学(mfIHC)が開発されました9。この進歩により、TME内の間質細胞、免疫細胞、およびがん細胞間の細胞組成と分子相互作用の正確な分析が可能になります。
本研究では、免疫細胞の空間分布を解析するためのマルチプレックスサイクリック免疫組織化学のプロトコルを提示する。ウサギとラットなどの異なる種の2つの一次抗体を同時にインキュベーション用に選択し、続いて蛍光標識した二次抗体を選択します。抗原賦活化は、抗原抗体反応の各ラウンドの後に行われます。自家蛍光をブロックし、4', 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を用いて核を染色します。このパネルには、CD3、CD8、CD20、およびCKの連続検出が含まれており、細胞はマーカーに従って分類されます:腫瘍細胞(CK+)、成熟T細胞(CD3+)、細胞傷害性T細胞(CD3 + CD8 +)、B細胞(CD20 +)10,11。
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Protocol
この研究は、雲南がん病院/昆明医科大学第三附属病院の医療倫理委員会によって承認されました。すべての被験者/法定後見人はインフォームドコンセントに署名しました。
1. スライドの準備
- 原発性肺腫瘍または肺がんの脳転移細胞を含む対パラフィンブロックの切片を、ミクロトームを用いて厚さ4μmで切断します。切片を水にかけ、ピンセットで分離し、最適なものを選択して、ポリリジンでコーティングされたスライドに接着します。
- 組織のスライドを65°Cのオーブンに30分間入れて、組織の接着を強化します。
- スライドをキシレンに浸し、それぞれ10分間持続させる3回の変更を行います。
- アルコール濃度を徐々に下げ、100%エタノールで5分間、90%エタノールで5分間、75%エタノールで5分間、脱イオン水で3分間スライドをインキュベートします。
2. 熱誘起エピトープ賦活化(HIER)
- 100倍のクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)を脱イオン水で1倍(10 mM)に希釈し、スライドを完全に浸すのに十分な緩衝液を調製します。
- スライドを圧力鍋に入れ、強火(100°C)と高圧(~30psi)に2分間さらします。加熱後、スライドを蒸留水で室温まで3分間冷まします。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS;粉末)52g1パケットを5Lの脱イオン水に溶解し、PBS緩衝液(pH 7.0)を調製します。スライドをPBS緩衝液に5分間入れ、3回交換します。
3. ペルオキシダーゼの遮断
- 切片を3%過酸化水素で覆い、室温で10分間インキュベートします。スライドをPBSで3回、それぞれ5分間すすぎます。
- 濾紙を使用して、組織の周囲から余分な水分を吸収します。その間、ティッシュが湿っていることを確認してください。
4. 第1ラウンドの一次抗体インキュベーション
- CD8(ウサギモノクローナル抗体、クローンSP16)およびCD20(マウスモノクローナル抗体、クローンL26)の一次抗体を、ボンド一次抗体希釈液で1:50に希釈したワーキング混合物を調製します。
- 抗体複合体を切片に加え、室温で1時間インキュベートします。
- 0.1%トゥイーン/リン酸緩衝生理食塩水(1 LのPBS緩衝液に1 mLのトゥイーン)の溶液を調製します。
- 切片を0.1%トゥイーン/リン酸緩衝生理食塩水で、それぞれ5分間3回洗浄します。濾紙を使用して組織の周囲から余分な水を引き出し、その間、組織が湿っていることを確認します。
5. 第1ラウンドの二次抗体インキュベーション
- 蛍光標識ヤギ抗ウサギ抗体(励起(例:495 nm)とヤギ抗マウス抗体(例:578 nm)の混合物を、リン酸緩衝生理食塩水で1:50に希釈して調製します。ヤギ抗ウサギ抗体はCD8の一次抗体に結合し、ヤギ抗マウス抗体はCD20の一次抗体に結合します。
- 二次抗体混合物を滴下し、室温で1時間インキュベートします。
6. 熱によるエピトープ賦活化とペルオキシダーゼ遮断
- 100倍のクエン酸ナトリウム(pH 6.0)を脱イオン水で1倍(10 mM)に希釈し、スライドを完全に浸すのに十分な緩衝液を調製します。
- スライドを圧力鍋に入れ、強火(100°C)と圧力(~30psi)に1分間さらします。加熱後、スライドを蒸留水に入れ、室温まで3分間冷却します。
- ステップ3の説明に従ってペルオキシダーゼブロッキングを行います。
7. 第2ラウンドの一次抗体インキュベーション
- 一次抗体希釈液で1:50に希釈したCD3(ウサギモノクローナル抗体、クローンSP7)とCK(マウスモノクローナル抗体、MX005)の一次抗体のワーキング混合物を調製します。
- 抗体複合体を切片に加え、室温で1時間インキュベートします。
- 0.1%トゥイーン/リン酸緩衝生理食塩水で、各5分間3回洗浄します。濾紙を使用して組織の周囲から余分な水を引き出し、その間、組織が湿っていることを確認します。
8. 第2ラウンドのための二次抗体インキュベーション
- ヤギ抗ウサギ抗体(例:652 nm)とヤギ抗マウス抗体(例:590 nm)の混合物を調製し、リン酸緩衝生理食塩水で1:50に希釈します。ヤギ抗ウサギ抗体はCD3の一次抗体に結合し、ヤギ抗マウス抗体はCKの一次抗体に結合します。
- 二次抗体混合物を滴下し、室温で1時間インキュベートします。0.1%トゥイーン/リン酸緩衝生理食塩水で、各5分間3回洗浄します。
9. 自家蛍光消光とDAPI染色
- 試薬(0.15 M/L KMnO4)を組織切片に1分間添加します。流水で5分間すすいでください。
注意: KMnO4 は有毒であり、皮膚に損傷を与えます。スライドを取り扱うときは、必ず手袋を着用してください。液体が皮膚に滴り落ちた場合は、清潔なナプキンですばやく拭き取り、流水で洗い流してください。 - アルコール濃度(70%、90%、100%)を上げながら、各濃度で3分間スライドを乾燥させます。
- マルチスペクトルイメージング用のDAPIとカバーガラスを追加します。DAPIの量は組織の大きさによって異なります。カバーガラスを追加した後、ティッシュがDAPIで完全に覆われていることを確認してください。
10.スライドスキャン
- スライドをトレイに置き、それ以上押せなくなるまで押します。
- プログラムを起動するには、デスクトップの プログラムアイコン をダブルクリックします。起動時には、モード選択ウィンドウが表示されます。選択ウィンドウには、自動モードと手動モードの2つの明視野モードと蛍光モードが表示されます。蛍光スキャンモードで、[ 自動モード]をクリックします。
- マウスカーソルを 上に移動しますか? ボタンをクリックして、設定に関する情報を表示します。 「フィルタ設定」>「フィルタチャンネル 」をクリックして、「 疑似カラー」>チャンネル番号を選択します。色を定義して保存します。
- [ルーチンワーク] > [スキャン モード] > [全自動] をクリックします。「ルーチンワーク」>「スライド名」をクリックして、出力するスライド名を定義します。「ルーチンワーク」>「チャンネル設定」をクリックして、フィルターを選択します。
- 「 ルーチン・ワーク」>「スキャン・オプション 」をクリックして、仮想スライドの品質と保存場所を決定します。
- [ プレビュー ]をクリックすると、しきい値の設定とスキャンする範囲の選択が表示されます。
- [ハードウェア] > [フィルター] > [ライブ] > [オートフォーカス] > [自動露出] > [デジタルゲイン] > [チェックマーク] をクリックして、手動露出時間を使用する > [現在に設定] > 範囲を制限するチェックマークを付けます。
- [ ルーチンワーク]をクリックして>スキャンを開始します。倍率を20倍または40倍から選択します。適切なファイルサイズとして 20x を選択します。MRXS拡張子は、3D Pannoramic MIDIスキャナーによって定義されます。画像拡張子をTIFF画像に変更することもできます。
- Multiview Toolbox>スライドビューアをクリックして共焦点の画像を選択し、画像を整列して統合します。
11. 細胞密度の定量的評価
- Halo 10 スキャナー ソフトウェアを使用して、腫瘍および間質領域における陽性免疫細胞 (CD3+、CD3+CD8+、CD20+) の割合を定量化します。CK染色を検証して腫瘍組織を同定します。
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Representative Results
5色マルチプレックス蛍光を用いたサイクリック抗原検出のプロトコルを1枚のスライドで紹介します。アッセイを最適化することで、異なる動物種由来の2つの抗体のインキュベーションが可能になりました(図1)。実験手順に必要な機器には、圧力鍋と免疫染色ボックスが含まれます(図2A)。
アッセイ終了後、スライドをスキャンする前に、4つのマーカーの疑似色を定義します。CD3、CD8、CD20、CKの疑似色は、それぞれ黄色、赤、緑、シアンです。核はDAPIで標識されています。腫瘍と間質の代表的な領域が分析のために選択されます。495 nm、578 nm、652 nm、590 nmの蛍光スペクトルは、3D自動デジタルスライドスキャナーを使用してキャプチャされます。肺がんの脳転移組織における代表的なスタック画像と単一標識画像を 図2Bに示す。スキャナーソフトウェアは、単一マーカーの蛍光シグナルを含む画像に基づいて、疑似色に基づいて細胞表現型の特徴を抽出しました。対応する陽性免疫細胞数と総免疫細胞数もカウントしました。各染色タンパク質レベルは、Hスコア12を計算することにより、検出された組織で定量化されます。これらの手順の後、各腫瘍浸潤リンパ球タイプの数と、標的細胞の総数に占める各細胞タイプの割合をカウントし、分析します。各免疫細胞の種類の割合は、腫瘍浸潤リンパ球の有効割合を示します。原発性肺癌切片と比較して、肺癌の脳転移におけるCD3+、CD3+CD8+ T細胞およびCD20+ B細胞の割合を分析した。代表的な結果を 図3に示します。免疫細胞(CD3+ T細胞、CD3+ CD8+ T細胞)の密度は、原発性肺がんよりも肺がんの脳転移で低くなります。CD20+ B細胞は、原発性肺がん群よりも脳転移群で高い。ただし、限られたサンプルについて、これら2つのグループ間で結果に有意差はありません。
図1:マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学染色のワークフロー。 4μmの切片を切断し、粘着スライドに接着します。脱パラフィン処理と再水和、抗原賦活化、抗原賦活化、抗原賦活化、抗原ブロッキング、一次抗体混合物インキュベーション、二次抗体インキュベーション、抗原賦活化、抗原ブロッキング、一次抗体混合物インキュベーション、二次抗体インキュベーションのステップを繰り返し、自家蛍光を低減し、スライドスキャンに適したフィルターを選択し、結果を分析します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:マルチプレックス蛍光免疫組織化学染色の操作方法。 抗原治療は、圧力鍋で切片を加熱することによって行われます。(A)圧力鍋は、熱誘起エピトープ賦活化に使用されます。抗体のインキュベーションの過程で、スライドは免疫染色ボックスに入れられます。(B)肺がんの脳転移組織に用いるパネルの代表的な合成画像と単染色画像。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:原発性肺がんと肺がんの脳転移における免疫細胞の割合。 4つの肺がん脳転移組織におけるCD3+、CD3+CD8+、CD20+免疫細胞の割合は、対の原発性肺がん組織よりも低い(エラーバー:標準偏差)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学染色のプロセスについて説明しました。一次抗体の選択は、蛍光免疫組織化学アッセイの重要な側面であり、特異性と再現性を向上させるためにモノクローナル抗体が推奨されます。一次抗体の使用濃度を最適化するために、免疫組織化学実験を通じて一連の希釈液を試験しました。ポジティブコントロール(標的抗原発現を評価するため)とネガティブコントロール(一次抗体のインキュベーションなし)の両方が不可欠であり、設定する必要があります。
このプロトコルでは、一次抗体を希釈し、異なる種からの混合物用に調製します。蛍光標識された二次抗体も、異なる動物種由来の同じ方法でプールおよびインキュベートされます。したがって、重要なステップは、抗原に基づいて異なる一次抗体の種を選択することであり、モノクローナル抗体はポリクローナル抗体よりも好まれます。これにより、一次抗体と二次抗体の組み合わせが特異的であることを確認できます。混合液は、両方の一次抗体の使用濃度を達成し、2つの抗体間に交差反応性が同時に存在してはなりません。一次抗体が同じ種の場合、最初に1つの二次抗体をインキュベートし、次に2番目の二次抗体をインキュベートします。パネル内で一次抗体のインキュベーションの順序を決定する際には、抗原抗体反応に敏感な抗体を優先する必要があり、低発現抗原の場合、2番目のエピトープ賦活化中に強度が強くなります。2回目の抗体インキュベーションの前に、抗原賦活化を繰り返すことは、1回目の操作(2分)に比べて短い時間(1分)で済みます。以前の周期染色による蛍光強度は、切片が熱誘起回収を2回受けても減少しません。非特異的免疫反応性を回避するには、抗体の作用濃度、インキュベーション時間、環境温度など、インキュベーション条件を最適化する必要があります。
エピトープ賦活化の様々な方法がここ数十年で開発され、主に熱誘起エピトープ賦活化(HIER)とプロテアーゼ誘起エピトープ賦活化(PIER)に分けられます。加熱は、抗原エピトープを露出させ、抗体によってより効果的に検出できるようにする効率的な抗原賦活化法である13。抗原賦活化のための2つの主な選択肢は、クエン酸緩衝液と高pH EDTA緩衝液14に基づいています。標的抗原に応じて最適な賦活化条件を同定します。
自家蛍光は、組織処理に使用される内因性蛍光色素および試薬によって引き起こされる切片の蛍光イメージングを妨げる可能性がある15。溶出には関連する試薬を使用する必要があります。蛍光色素は、自家蛍光ピーク(約490 nm)を避けて発光ピークで選択されます16,17。スーダンブラックBおよびNaBH4は、組織自家蛍光を消光することが報告されています18,19。スーダンブラックBとNaBH4の組み合わせは、標的腎臓ホルマリン固定パラフィン包埋組織における蛍光バックグラウンドを減少させた20。このプロトコルでは、0.15 M/Lの集中のKMnO4のティッシュの処置は1分間時間の節約です。 KMnO4は自発の蛍光を遮蔽するためのティッシュの層をカバーし、背景の蛍光を、検出された蛋白質の特定の汚損より視覚化されます減らします。
スライド全体は4つの異なるフィルターチャンネルでスキャンされ、画像アライメント分析が必要であり、単一細胞および細胞内構造の局在をアライメントすることは大きな課題です。この手法によるマルチスペクトル画像の場合、スペクトルクロストークを回避するために、専門の光イメージング機器と定量分析ソフトウェアが必要です。機器の高価なコストは、その用途を制限します。2つの抗体の共インキュベーションは、特に3サイクルのインキュベーションを必要とする6マーカーパネルを扱う場合、時間を節約できます。この手法は、腫瘍免疫微小環境における免疫細胞のより詳細な特性評価を視覚化するために使用されます。将来的には、腫瘍関連三次リンパ系構造の定量解析への応用が期待されます。
要約すると、マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学により、1枚のスライド上で個別に標識された蛍光色素で複数のターゲットを染色することができます。このアッセイは、腫瘍免疫微小環境における細胞の空間分布の理解を深め、腫瘍免疫細胞の空間的近接性は、免疫療法の恩恵を受ける患者のスクリーニングに貢献します。
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Disclosures
著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる競合する金銭的利害関係や個人的な関係は知られていないと宣言しています。
Acknowledgments
本研究は、中国国家自然科学基金会(NO.81860413、81960455)、雲南省科学技術部基金(202001AY070001-080)、雲南省教育部科学研究財団(2019J1274)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
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