Summary
다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
종양 미세환경은 숙주 세포, 종양 세포, 면역 세포, 기질 세포 및 혈관 조직 간의 상호 작용을 포함합니다. 면역 세포 subset과 표적 단백질을 특성화하고 공간적으로 구성하는 것은 예후 및 치료 목적에 매우 중요합니다. 이는 다중 면역조직화학 염색법의 개발로 이어졌습니다. 다중 형광 면역조직화학을 통해 여러 마커를 동시에 검출할 수 있어 세포 기능 및 세포 간 상호 작용에 대한 포괄적인 이해를 촉진할 수 있습니다. 이 논문에서는 다중 순환 형광 면역조직화학 분석을 위한 워크플로우와 림프구 하위 집합의 정량 분석에서의 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 다중 순환 형광 면역조직화학 염색은 항원 회수, 순환 항체 배양 및 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 슬라이드 염색을 포함하는 표준 면역조직화학과 유사한 단계 및 시약을 따릅니다. 항원-항체 반응 중에 서로 다른 종의 항체 혼합물이 준비됩니다. 항원 회수 시간 및 항체 농도와 같은 조건은 신호 대 잡음비를 높이기 위해 최적화되고 검증됩니다. 이 기술은 재현성이 있으며 면역 요법 연구 및 임상 응용 분야에 유용한 도구 역할을 합니다.
Introduction
뇌 전이(BM)는 가장 흔한 중추신경계(CNS) 종양으로, 비소세포폐암(NSCLC) 사례의 거의 절반에서 발생하며 예후가 좋지 않다1. 비소세포폐암 환자의 약 10%-20%가 초기 진단 시점에 이미 BM을 가지고 있으며, 약 40%의 비소세포폐암 환자가 치료 과정에서 BM으로 발전한다2. 종양 미세환경(tumor microenvironment, TME)은 혈관, 섬유아세포, 대식세포, 세포외기질(ECM), 림프구, 골수 유래 면역세포, 신호전달 분자 3,4와 같은 다양한 구성 요소를 포함하여 비소세포폐암(NSCLC) 발생 및 BM과 밀접한 관련이 있습니다. 미세환경 면역세포는 암세포의 성장과 발달에 영향을 미치는 데 중요한 역할을 합니다. 뇌 전이는 복잡한 면역학적 미세환경과 신호전달 과정을 특징으로 하는 수많은 잠재적 치료 표적을 제시합니다. 예를 들어, PD-1 억제제는 면역관문억제제(ICI)로서 폐암 뇌전이(LCBM) 환자에게 임상적 효능을 보였다. 그러나 PD-1 요법에 대한 반응 빈도는 원발성 NSCLC와 LCBM5 간에 다르며, 이는 종양 면역 미세환경이 중요한 ICI 조절자로 작용한다는 것을 시사한다.
면역조직화학(IHC)은 생물학, 기초 의학 및 병리학 분야에서 매우 유용한 도구입니다6. 이 검출 방법은 조직 슬라이드(7) 상의 항원-항체의 상호작용을 통해 항원 발현을 시각화한다. IHC는 예측 마커를 진단하고, 예후 마커를 평가하고, 표적 치료를 안내하고, 종양 세포의 생물학적 기능을 탐색하는 데 사용됩니다8. 그러나 기존의 IHC 방법은 한 번에 하나의 바이오마커만 검출할 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 면역조직화학 기술의 혁신은 다중 형광 면역조직화학(mfIHC)의 개발로 이어졌으며, 이를 통해 명시야 및 형광 필드 모두에서 동일한 조직 슬라이드에서 여러 단백질 마커를 동시에 식별할 수 있습니다9. 이러한 발전은 TME 내에서 기질 세포, 면역 세포 및 암세포 간의 세포 구성 및 분자 상호 작용에 대한 정확한 분석을 제공합니다.
본 연구에서는 면역세포의 공간적 분포를 분석하기 위한 multiplex cyclic immunohistochemistry 프로토콜을 제시합니다. 토끼와 쥐와 같은 서로 다른 종의 두 가지 1차 항체를 동시에 선택하여 배양한 후 형광 표지 2차 항체를 선택합니다. 항원 회수는 항원-항체 반응의 각 라운드 후에 수행됩니다. 자가형광은 차단되고 4', 6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)은 핵 염색에 사용됩니다. 이 패널에는 CD3, CD8, CD20 및 CK의 순차 검출이 포함되어 있으며, 세포는 마커에 따라 종양 세포(CK+), 성숙 T 세포(CD3+), 세포 독성 T 세포(CD3+CD8+), B 세포(CD20+)로 분류됩니다10,11.
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Protocol
이 연구는 쿤밍 의과대학 윈난암병원/제3부속병원 의료윤리위원회의 승인을 받았다. 모든 피험자/법적 보호자는 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다.
1. 슬라이드 준비
- 원발성 폐종양 또는 폐암 뇌전이가 포함된 쌍의 파라핀 블록 절편을 마이크로톰을 사용하여 4μm 두께로 세포를 절단합니다. 물을 묻힌 부분을 제거하고 핀셋으로 분리한 후 가장 좋은 부분을 선택하여 폴리리신 코팅 슬라이드에 부착합니다.
- 조직 밀착력을 높이기 위해 65°C의 오븐에 조직 슬라이드를 30분 동안 넣습니다.
- 슬라이드를 크실렌에 담그고 각각 10분 동안 지속되는 세 번의 변화를 거칩니다.
- 점차적으로 알코올 농도를 낮추고 슬라이드를 100% 에탄올에서 5분, 90% 에탄올에서 5분, 75% 에탄올에서 5분, 탈이온수에서 3분 동안 배양합니다.
2. 열 유도 에피토프 회수(HIER)
- 100x 구연산나트륨 완충 용액(pH 6.0)을 탈이온수에 1x(10mM)로 희석하여 슬라이드가 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 완충 용액을 준비합니다.
- 슬라이드를 압력솥에 넣고 100분 동안 고열(30°C)과 압력(~2psi)에 노출시킵니다. 가열 후 슬라이드를 증류수에서 3분 동안 실온으로 식힙니다.
- PBS 완충 용액(pH 7.0)을 제조하기 위해 5L의 탈이온수에 인산염 완충 식염수(PBS, 분말) 52g 한 패킷을 녹입니다. 슬라이드를 PBS 버퍼 용액에 5분 동안 넣고 3번 변경합니다.
3. 과산화효소 차단
- 절편을 3% 과산화수소로 덮고 실온에서 10분 동안 배양합니다. PBS에서 슬라이드를 각각 3분 동안 5번 헹굽니다.
- 여과지를 사용하여 조직 주변에서 과도한 물을 흡수합니다. 한편, 티슈가 촉촉한지 확인하십시오.
4. 1차 항체 배양
- CD8 (토끼 단클론 항체, 클론 SP16) 및 CD20 (마우스 단클론 항체, 클론 L26)에 대한 1 차 항체의 작동 혼합물을 Bond 1 차 항체 희석제에서 1:50으로 희석하여 준비합니다.
- 항체 복합체를 절편에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- PBS 완충 용액 1L에 Tween 1mL를 함유한 0.1% 트윈/인산염 완충 식염수 용액을 준비합니다.
- 0.1% 트윈/인산염 완충 식염수로 절편을 각각 5분 동안 3번 세척합니다. 여과지를 사용하여 조직 주변에서 과도한 물을 빼내고 조직이 촉촉한지 확인하십시오.
5. 1차 항체 배양
- 형광 표지된 염소 항-토끼 항체(Excitation (Ex): 495 nm) 및 염소 항-마우스 항체(Ex: 578 nm)의 혼합물을 인산염 완충 식염수에 1:50으로 희석하여 제조한다. 염소 항 토끼 항체는 CD8의 1차 항체에 부착되고, 염소 항 마우스 항체는 CD20의 1차 항체에 부착됩니다.
- 2차 항체 혼합물을 적가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
6. 열 유도 에피토프 회수 및 과산화효소 차단
- 100x 구연산나트륨(pH 6.0)을 탈이온수에 1x(10mM)로 희석하여 슬라이드가 완전히 잠길 수 있는 충분한 완충 용액을 준비합니다.
- 슬라이드를 압력솥에 넣고 1분 동안 고열(100°C)과 압력(~30psi)에 노출시킵니다. 가열 후 슬라이드를 증류수에 넣어 실온으로 3분 동안 식힙니다.
- 3단계에서 설명한 대로 과산화효소 차단을 수행합니다.
7. 2차 항체 배양
- CD3 (토끼 단클론 항체, 클론 SP7) 및 CK (마우스 단클론 항체, MX005)에 대한 1 차 항체의 작동 혼합물을 1 차 항체 희석액에 1:50으로 희석하여 준비합니다.
- 항체 복합체를 절편에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 0.1% 트윈/인산염 완충 식염수로 각각 5분씩 3번 세척합니다. 여과지를 사용하여 조직 주변에서 과도한 물을 빼내고 조직이 촉촉한지 확인하십시오.
8. 2차 항체 배양
- 염소 항-토끼(Ex: 652 nm)와 염소 항-마우스 항체(Ex: 590 nm)를 혼합하여 인산염 완충 식염수로 1:50 희석하여 제조한다. 염소 항 토끼 항체는 CD3의 1차 항체에 부착되고, 염소 항 마우스 항체는 CK의 1차 항체에 부착됩니다.
- 2차 항체 혼합물을 적가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 0.1% 트윈/인산염 완충 식염수로 각각 5분씩 3번 세척합니다.
9. 자가형광 담금질 및 DAPI 염색
- 시약(0.15 M/L KMnO4)을 조직 섹션에 1분 동안 추가합니다. 흐르는 물로 5분 동안 헹굽니다.
주의 : KMnO4 는 독성이 있으며 피부를 손상시킵니다. 슬라이드를 다룰 때는 반드시 장갑을 착용하십시오. 액체가 피부에 떨어지면 깨끗한 냅킨으로 빠르게 닦아내고 흐르는 물로 씻어내십시오. - 알코올 농도를 높인 상태(70%, 90%, 100%)로 슬라이드를 각 농도에서 3분 동안 건조시킵니다.
- 다중 스펙트럼 이미징을 위해 DAPI 및 커버슬립을 추가합니다. DAPI의 양은 조직 크기에 따라 다릅니다. 커버슬립을 추가한 후 조직이 DAPI로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.
10. 슬라이드 스캔
- 슬라이드를 트레이에 놓고 더 이상 밀 수 없을 때까지 밉니다.
- 프로그램을 시작하려면 바탕 화면에서 프로그램 아이콘을 두 번 클릭합니다. 시작하는 동안 모드 선택 창이 표시됩니다. 선택 창에는 두 가지 명시야 및 형광 모드(자동 모드와 수동 모드)가 표시됩니다. 형광 스캔 모드에서 자동 모드(Automatic Mode)를 클릭합니다.
- 마우스 커서를 ? 버튼을 눌러 설정에 대한 정보를 표시합니다. 필터 설정(Filter Setting) > 필터 채널(Filter Channel )을 클릭하여 채널 번호(Channel Number) > 의사 색상(Pseudo Color)을 선택합니다. 색상을 정의하고 저장합니다.
- Routine Work(일상 작업) > Scanning Mode(스캔 모드)> 완전 자동(Full Automatic)을 클릭합니다. 루틴 작업(Routine Work) > 슬라이드 이름(Slide Name)을 클릭하여 출력할 슬라이드 이름을 정의합니다. [루틴 작업] > [채널 설정]을 클릭하여 필터를 선택합니다.
- Routine Work > Scan Options(일상적인 작업) Scan Options(스캔 옵션)를 클릭하여 가상 슬라이드의 결과 품질과 저장 위치를 결정합니다.
- 임계값 설정 및 스캔할 범위 선택을 위해 미리 보기(Preview )를 클릭합니다.
- 하드웨어 > 필터(Hardware Filters) > 라이브 > 자동 초점(Auto Focus) > 자동 노출(Auto Exposure) > 디지털 게인(Digital Gain) > 틱(Tick)을 클릭하고 수동 노출 시간 사용(Use manual exposure time) > 틱(Tick)을 클릭하여 현재 설정(Set Current)> 범위를 제한합니다.
- 일상적인 작업(Routine Work)> 스캔 시작(Start Scan)을 클릭합니다. 배율 수준을 20x 또는 40x로 선택합니다. 적절한 파일 크기로 20x를 선택합니다. MRXS 확장은 3D Pannoramic MIDI 스캐너에 의해 정의됩니다. 이미지 확장자를 TIFF 이미지로 변경할 수도 있습니다.
- 슬라이드 뷰어 > Multiview Toolbox를 클릭하여 공초점에 사용할 이미지를 선택한 다음 이미지를 정렬하고 통합합니다.
11. 세포 밀도의 정량적 평가
- Halo 10 스캐너 소프트웨어를 사용하여 종양 및 기질 영역에서 양성 면역 세포(CD3+, CD3+CD8+, CD20+)의 백분율을 정량화합니다. 종양 조직을 정의하기 위해 CK 염색을 검증합니다.
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Representative Results
단일 슬라이드에서 5색 다중 형광을 사용한 순환 항원 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다. 분석의 최적화를 통해 서로 다른 종의 두 항체를 배양할 수 있습니다(그림 1). 실험 절차에 필요한 장치에는 압력솥과 면역염색 상자가 포함됩니다(그림 2A).
분석을 완료한 후 슬라이드를 스캔하기 전에 4개의 마커의 유사 색상을 정의합니다. CD3, CD8, CD20 및 CK의 의사 색상은 각각 노란색, 빨간색, 녹색 및 청록색입니다. 핵은 DAPI로 표시됩니다. 종양과 기질의 대표 부위를 선택하여 분석합니다. 495nm, 578nm, 652nm 및 590nm의 형광 스펙트럼은 3D 자동 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 캡처됩니다. 폐암 뇌 전이 조직의 대표적인 스택 이미지와 단일 표지 이미지가 그림 2B에 나와 있습니다. 단일 마커 형광 신호가 포함된 이미지를 기반으로 스캐너 소프트웨어는 유사 색상을 기반으로 세포 표현형 특성을 추출했습니다. 양성 면역 세포와 총 면역 세포의 해당 수도 계산되었습니다. 염색된 각 단백질 수준은 H-점수12를 계산하여 검출된 조직에서 정량화됩니다. 이러한 시술 후 각 종양 침윤 림프구 유형의 수와 전체 표적 세포 수에서 각 세포 유형의 비율을 계산하고 분석합니다. 각 면역 세포 유형의 비율은 종양 침윤 림프구의 유효 비율을 나타냅니다. CD3+, CD3+CD8+ T 세포 및 CD20+ B 세포의 비율은 원발성 폐암 절편과 비교하여 폐암 뇌 전이에서 분석되었습니다. 대표적인 결과는 그림 3에 나와 있습니다. 면역세포(CD3+ T세포, CD3+ CD8+ T세포)의 밀도는 원발성 폐암보다 폐암 뇌 전이에서 낮습니다. CD20+ B 세포는 원발성 폐암 그룹보다 뇌 전이 그룹에서 더 높습니다. 그러나 제한된 표본에 대해 이 두 그룹 간에 결과는 크게 다르지 않습니다.
그림 1: 다중 순환 형광 면역조직화학 염색의 워크플로우. 4μm 섹션을 절단하여 접착 슬라이드에 부착합니다. 탈파라핀화 및 재수화, 항원 회수, 항원 회수, 항원 차단, 1차 항체 혼합물 배양, 2차 항체 배양, 항원 회수, 항원 차단, 1차 항체 혼합물 배양 및 2차 항체 배양 단계를 반복한 후 자가형광 감소, 슬라이드 스캔에 적합한 필터 선택 및 결과 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다중 형광 면역조직화학 염색의 작동 방법. 항원 치료는 압력솥에서 섹션을 가열하여 수행됩니다. (A) 압력솥은 열 유도 에피토프 회수에 사용됩니다. 항체 배양 과정에서 슬라이드는 면역염색 상자에 배치됩니다. (B) 폐암 뇌 전이 조직에 사용된 패널에 대한 대표적인 합성 및 단일 염색 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 원발성 폐암과 폐암 뇌 전이의 면역 세포 비율. 4개의 폐암 뇌 전이 조직에서 CD3+, CD3++CD8+, CD20+ 면역세포 비율은 쌍을 이루는 원발성 폐암 조직보다 낮습니다(오차 막대: 표준 편차). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 다중 순환 형광 면역조직화학 염색 과정을 설명했습니다. 1차 항체 선택은 형광 면역조직화학 분석의 중요한 측면이며, 더 나은 특이성과 반복성을 위해 단클론 항체를 권장합니다. 1차 항체의 작동 농도를 최적화하기 위해 면역조직화학 실험을 통해 일련의 희석액을 테스트했습니다. 양성 대조군(표적 항원 발현 평가)과 음성 대조군(1차 항체 배양 없음)은 모두 필수적이며 설정해야 합니다.
이 프로토콜에서는 1차 항체를 희석하여 다른 종의 혼합물을 준비합니다. 형광 표지된 2차 항체는 또한 다른 종에서 유래한 동일한 방식으로 풀링되고 배양됩니다. 따라서 중요한 단계는 항원에 따라 다른 1차 항체에 대한 종을 선택하는 것이며, 다클론 항체에 비해 단클론 항체가 선호됩니다. 이를 통해 1차 항체와 2차 항체 간의 조합이 특이적임을 확인할 수 있습니다. 혼합된 액체는 1차 항체 모두에 대한 작동 농도를 달성해야 하며 두 항체 사이에 교차 반응이 동시에 존재해서는 안 됩니다. 1차 항체가 동일한 종인 경우 2차 항체 1개를 먼저 배양한 다음 2차 항체를 배양합니다. 패널에서 1차 항체 배양 서열을 결정할 때 항원-항체 반응에 민감한 항체에 우선 순위를 부여해야 하며, 발현이 낮은 항원의 경우 2차 항원결정기 회수 중에 강도가 강화됩니다. 2차 항체 배양 전 반복 항원 채취는 1차 수술(2분)에 비해 시간(1분)이 적게 소요됩니다. 이전 순환 염색의 형광 강도는 절편이 열 유도 회수를 두 번 거치더라도 감소하지 않습니다. 비특이적 면역 반응을 피하기 위해서는 항체 작용 농도, 배양 시간, 환경 온도 등 배양 조건을 최적화해야 합니다.
최근 수십 년 동안 다양한 에피토프 회수 방법이 개발되었으며, 주로 열 유도 에피토프 회수(HIER)와 프로테아제 유도 에피토프 회수(PIER)로 나뉩니다. 가열은 항원 에피토프를 노출시켜 항체에 의해 보다 효과적으로 검출되도록 하는 효율적인 항원 회수 방법이다13. 항원 회수를 위한 두 가지 주요 옵션은 구연산염 완충액과 높은 pH EDTA 완충액을 기반으로합니다 14. 표적 항원에 따라 최적화된 회수 조건을 식별합니다.
자가형광은 조직 처리에 사용되는 내인성 형광단 및 시약에 의해 야기된 절편의 형광 이미징을 방해할 수 있다15. 용출을 위해서는 관련 시약을 사용해야 합니다. 형광단은 자가형광 피크(약 490nm)를 피하는 방출 피크로 선택됩니다16,17. Sudan Black B 및 NaBH4는 조직 자가형광18,19를 소멸시키는 것으로 보고되었습니다. Sudan Black B와 NaBH4의 조합은 표적 신장 포르말린 고정 파라핀 포매 조직20에서 형광 배경을 감소시켰다. 이 프로토콜에서 0.15M/L 농도의 KMnO4 조직 처리는 1분 동안 시간을 절약합니다. KMnO4는 자발적 형광을 차폐하기 위해 조직 상의 층을 덮고 배경 형광을 감소시키며, 검출된 단백질의 특이적 염색을 보다 시각화합니다.
전체 슬라이드는 4개의 서로 다른 필터 채널에서 스캔되며, 이미지 정렬 분석이 필요하며, 단일 세포 및 세포 내 구조의 국소화를 정렬하는 것은 큰 도전입니다. 이 기법의 다중 스펙트럼 이미지의 경우, 스펙트럼 누화를 방지하기 위해 전문 광 이미징 장비와 정량 분석 소프트웨어가 필요합니다. 기기의 비싼 비용은 적용을 제한합니다. 두 항체의 동시 배양은 특히 3주기의 배양이 필요한 6-마커 패널을 처리할 때 시간을 절약합니다. 이 기술은 종양 면역 미세환경에서 면역 세포의 보다 상세한 특성을 시각화하는 데 사용됩니다. 앞으로 이 방법은 종양 관련 3차 림프 구조의 정량 분석에 적용될 것입니다.
요약하면, multiplex cyclic fluorescence immunohistochemistry를 사용하면 단일 슬라이드에서 개별적으로 표지된 형광단으로 여러 표적을 염색할 수 있습니다. 이 분석법은 종양 면역 미세환경에서 세포의 공간적 분포에 대한 이해를 향상시키고, 종양 면역 세포의 공간적 근접성은 면역 요법의 혜택을 받을 환자를 선별하는 데 기여합니다.
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Disclosures
저자들은 이 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계를 알지 못한다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NO.81860413, 81960455), 윈난 과학 기술부 기금 (202001AY070001-080), 윈난성 교육부 과학 연구 재단 (2019J1274)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
- Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).
- Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).
- Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
- Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
- Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
- Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
- Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).
- Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
- Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
- McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
- Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
