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Immunology and Infection

उपकला सेल संक्रमण शिगेला के साथ विश्लेषण

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/66426
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल इन विट्रो उपकला सेल लाइनों का उपयोग करके शिगेला पालन, आक्रमण और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति से पूछताछ करने के लिए संक्रमण परख का वर्णन करता है।

Abstract

मानव-अनुकूलित एंटरिक बैक्टीरियल रोगज़नक़ शिगेला हर साल लाखों संक्रमण का कारण बनता है, बाल रोगियों के बीच दीर्घकालिक विकास प्रभाव पैदा करता है, और दुनिया भर में दस्त से होने वाली मौतों का एक प्रमुख कारण है। संक्रमण रोगज़नक़ के जठरांत्र संबंधी मार्ग को स्थानांतरित करने और बृहदान्त्र को अस्तर करने वाली उपकला कोशिकाओं को संक्रमित करने के परिणामस्वरूप पानी या खूनी दस्त को प्रेरित करता है। एंटीबायोटिक प्रतिरोध में चौंका देने वाली वृद्धि और अनुमोदित टीकों की वर्तमान कमी के साथ, मानकीकृत अनुसंधान प्रोटोकॉल इस दुर्जेय रोगज़नक़ का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यहां, कोलोनिक उपकला कोशिकाओं में बैक्टीरिया के पालन, आक्रमण और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति के इन विट्रो विश्लेषण का उपयोग करके शिगेला के आणविक रोगजनन की जांच करने के लिए तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं। संक्रमण विश्लेषण से पहले, शिगेला कॉलोनियों के विषाणु फेनोटाइप को अगर प्लेटों पर कांगो लाल डाई के तेज द्वारा सत्यापित किया गया था। पूरक प्रयोगशाला मीडिया भी विवो स्थितियों में नकल करने के लिए जीवाणु संवर्धन के दौरान विचार किया जा सकता है. बैक्टीरियल कोशिकाओं तो संक्रमण के प्रत्येक चरण का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलन के साथ संक्रमण की एक स्थापित बहुलता पर टिशू कल्चर प्लेटों में colonic उपकला कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है. पालन परख के लिए, उपकला कोशिकाओं के साथ बैक्टीरिया के संपर्क को बढ़ावा देने के लिए शिगेला कोशिकाओं को कम मीडिया के स्तर के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। आक्रमण और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति परख दोनों के लिए, एक्स्ट्रासेल्युलर बैक्टीरिया को खत्म करने और आक्रमण के आकलन और / या इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति दरों की मात्रा का ठहराव सक्षम करने के लिए विभिन्न समय अंतराल के लिए जेंटामाइसिन लागू किया जाता है। सभी संक्रमण प्रोटोकॉल अनुयायी, आक्रमण, और/या इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया को क्रमिक रूप से संक्रमित उपकला सेल lysates को पतला करके और कांगो लाल अगर प्लेटों पर टाइटर्स को संक्रमित करने के सापेक्ष बैक्टीरिया कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों को चढ़ाते हैं। साथ में, ये प्रोटोकॉल इस रोगज़नक़ का सफलतापूर्वक अध्ययन करने के लिए उपकला कोशिकाओं के शिगेला संक्रमण के प्रत्येक चरण के लिए स्वतंत्र लक्षण वर्णन और तुलना को सक्षम करते हैं।

Introduction

एंटरिक बैक्टीरियल रोगजनकों के कारण होने वाले डायरिया रोग एक महत्वपूर्ण वैश्विक स्वास्थ्य बोझ हैं। 2016 में, दस्त संबंधी बीमारियां दुनिया भर में 1.3 मिलियन मौतों के लिए जिम्मेदार थीं और 1,2 साल से कम उम्र के पांच साल से कम उम्र के बच्चों में मौत का चौथा प्रमुख कारण थीं। ग्राम-नकारात्मक, आंत्र जीवाणु रोगज़नक़ शिगेला शिगेलोसिस का प्रेरक एजेंट है, जो दुनिया भर में दस्त से होने वाली मौतों का एक प्रमुख कारणहै। शिगेलोसिस निम्न और मध्यम आयवाले देशों 4,5 के बच्चों में हर साल महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु दर का कारण बनता है, जबकि उच्च आय वाले देशों में संक्रमण डेकेयर सेंटर, फूडबोर्न और जलजनित प्रकोप 6,7,8,9से जुड़े होते हैं। अप्रभावी टीका विकास10 और रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर)11,12 की बढ़ती दरों ने बड़े पैमाने पर शिगेला प्रकोपों के प्रबंधन को जटिल बना दिया है। रोग नियंत्रण और रोकथाम के आंकड़ों के हालिया केंद्रों से पता चलता है कि संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 46% शिगेला संक्रमणों ने 202013,14 में दवा प्रतिरोध प्रदर्शित किया, जबकि विश्व स्वास्थ्य संगठन ने शिगेला को एएमआर प्राथमिकता वाले रोगज़नक़ के रूप में घोषित किया है जिसके लिए नए उपचारों की तत्काल आवश्यकता है15.

दूषित भोजन या पानी के अंतर्ग्रहण पर, या सीधे मानव संपर्क के माध्यम से शिगेला संक्रमण आसानी से फेकल-मौखिक मार्ग के माध्यम से प्रेषित होता है। शिगेला एक कुशल, मानव-अनुकूलित रोगज़नक़ के रूप में विकसित हुआ है, जिसमें 10-100 बैक्टीरिया की संक्रामक खुराक है जो रोग16 का कारण बनने के लिए पर्याप्त है। छोटी आंतों के पारगमन के दौरान, शिगेला पर्यावरणीय संकेतों के संपर्क में है, जैसे ऊंचा तापमान और पित्त17. इन संकेतों का पता लगाने से मानव बृहदान्त्र 17,18,19को संक्रमित करने के लिए बैक्टीरिया की क्षमता को बढ़ाने वाले विषाणु कारकों को व्यक्त करने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन प्रेरित होते हैं। शिगेला एपिकल सतह से कॉलोनिक एपिथेलियम पर आक्रमण नहीं करता है, बल्कि कूप से जुड़े उपकला20,21,22के भीतर विशेष एंटीजन-प्रेजेंटिंग माइक्रोफोल्ड कोशिकाओं (एम कोशिकाओं) में तेज होने के बाद उपकला परत में पारगमन करता है। ट्रांसकाइटोसिस के बाद, शिगेला कोशिकाओं को निवासी मैक्रोफेज द्वारा फागोसाइटोज किया जाता है। शिगेला तेजी से फागोसोम से बच जाता है और मैक्रोफेज कोशिका मृत्यु को ट्रिगर करता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स 5,23,24 की रिहाई होती है। शिगेला तब बेसोलेटरल पक्ष से कोलोनिक उपकला कोशिकाओं पर हमला करता है, मैक्रोपिनोसाइटिक रिक्तिका को लाइज़ करता है, और साइटोप्लाज्म 5,25 में एक प्रतिकृति जगह स्थापित करता है। प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स, विशेष रूप से इंटरल्यूकिन -8 (आईएल -8), संक्रमण की साइट पर पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर न्यूट्रोफिल ल्यूकोसाइट्स (पीएमएन) की भर्ती करते हैं, जो उपकला तंग जंक्शनों को कमजोर करता है, और बेसोलेटरल संक्रमण को बढ़ाने के लिए उपकला अस्तर के जीवाणु घुसपैठ को सक्षम बनाताहै। पीएमएन संक्रमण को रोकने के लिए संक्रमित उपकला अस्तर को नष्ट कर देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप बेसिलरी (खूनी) पेचिश के लक्षणलक्षण होते हैं। हालांकि आक्रमण और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति तंत्र को अच्छी तरह से चित्रित किया गया है, नए शोध शिगेला संक्रमण में महत्वपूर्ण नई अवधारणाओं का प्रदर्शन कर रहे हैं, जिसमें गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पारगमन17, पालन19, बाधा पारगम्यता26 के माध्यम से बेहतर बेसोलेटरल पहुंच शामिल है, और कुपोषित बच्चों में स्पर्शोन्मुख गाड़ी27.

डायरिया रोग पैदा करने के लिए शिगेला एसपीपी की क्षमता मनुष्यों और गैर-मानव प्राइमेट्स (एनएचपी)28तक ही सीमित है। शिगेला आंतों के संक्रमण मॉडल जेब्राफिश29, चूहों30, गिनी सूअरों31, खरगोशों 21,32,33 और सूअरों 34,35 के लिए विकसित किए गए हैं। हालांकि, इन मॉडल प्रणालियों में से कोई भी सही ढंग से मानव संक्रमण36 के दौरान मनाया रोग विशेषताओं को दोहराने कर सकते हैं. शिगेला रोगजनन का अध्ययन करने के लिए शिगेलोसिस के एनएचपी मॉडल स्थापित किया गया है, इन मॉडल प्रणालियों को लागू करने के लिए महंगा कर रहे हैं और कृत्रिम रूप से उच्च संक्रामक खुराक, मानव 37,38,39,40,41,42 की संक्रामक खुराक की तुलना में अधिक परिमाण के नौ आदेश करने के लिए की आवश्यकता होती है. इस प्रकार, मानव मेजबानों के संक्रमण के लिए शिगेला के उल्लेखनीय अनुकूलन के लिए शिगेला रोगजनन की सटीक पूछताछ के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल को फिर से बनाने के लिए मानव-व्युत्पन्न सेल संस्कृतियों के उपयोग की आवश्यकता होती है।

यहां, एचटी -29 कॉलोनिक उपकला कोशिकाओं के भीतर शिगेला पालन, आक्रमण और प्रतिकृति की दरों को मापने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। इन मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, आणविक तंत्र जिसके द्वारा बैक्टीरियल विषाणु जीन और पर्यावरणीय संकेत शिगेला संक्रमण के प्रत्येक चरण को प्रभावित करते हैं, गतिशील मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन संबंध को बेहतर ढंग से समझने के लिए पूछताछ की जा सकती है।

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Protocol

1. अभिकर्मकों और सामग्रियों की तैयारी

नोट: सभी संस्करणों दो 6 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग कर एक परख के साथ संगत कर रहे हैं.

  1. टीएसबी मध्यम: 15 ग्राम ट्रिप्टिक सोया शोरबा (टीएसबी, सामग्री की तालिका) मध्यम और आटोक्लेव में 0.5 लीटर विआयनीकृत (डीआई) पानी जोड़ें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  2. पित्त लवण मध्यम (टीएसबी + बीएस): 0.4% (डब्ल्यू / वी) पित्त लवण युक्त टीएसबी तैयार करने के लिए, ऑटोक्लेव्ड टीएसबी के 15 एमएल में 0.06 ग्राम पित्त लवण ( बीएस, सामग्री की तालिकादेखें) को फिर से निलंबित करें। फ़िल्टर एक 0.22 माइक्रोन पीईएस फिल्टर का उपयोग स्टरलाइज़ करें।
    नोट: पित्त लवण सोडियम कोलेट और सोडियम deoxycholate के एक 1: 1 मिश्रण से मिलकर बनता है. उपयोग करने से तुरंत पहले ताजा मीडिया तैयार करें।
  3. डीएमईएम + 10% (वी/वी) एफबीएस: डुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) के 45 एमएल में भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 5 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. डीएमईएम + जेंटामाइसिन: 50 एमएल ट्यूब में, डीएमईएम के 50 एमएल और 50 मिलीग्राम/एमएल जेंटामाइसिन के 50 माइक्रोन जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: प्रत्येक प्रयोग से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ताजा विभाज्य और गर्म बनाओ.
  5. पीबीएस + 1% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100: फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 15 एमएल में ट्राइटन एक्स -100 के 150 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: प्रत्येक प्रयोग से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ताजा विभाज्य और गर्म बनाओ.
  6. TSB + कांगो लाल सूचक प्लेट: 1 L बोतल में 15 ग्राम TSB, 7.5 ग्राम चुनिंदा अगर, और 0.125 ग्राम कांगो लाल डाई ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें। डीआई पानी और आटोक्लेव के 0.5 एल जोड़ें. व्यक्तिगत बाँझ पेट्री व्यंजन (100 मिमी x 15 मिमी) में मीडिया के 10-20 एमएल डालो और जमना करते हैं.
    चेतावनी: कांगो लाल कार्सिनोजेनिक और एक प्रजनन विष है। सुनिश्चित करें कि कांगो लाल की हैंडलिंग उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करके की जाती है। अतिरिक्त जानकारी के लिए उत्पाद सुरक्षा डेटा शीट से परामर्श करें।
    नोट: लगभग 20 प्लेटें 0.5 एल कांगो लाल मीडिया से बनाई गई हैं। प्लेटों को 2-3 दिन पहले तैयार किया जा सकता है और उपयोग होने तक कमरे के तापमान पर उलटा छोड़ दिया जा सकता है। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, प्लास्टिक की आस्तीन में उल्टे प्लेटों को 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. डीएमईएम + 10% (वी / वी) एफबीएस और 5% (वी / वी) डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ): डीएमईएम के 42.5 एमएल, एफबीएस के 5 एमएल और डीएमएसओ के 2.5 एमएल को 50 एमएल ट्यूब में जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. बैक्टीरिया की तैयारी

नोट: सभी शिगेला प्रयोगशाला खेती और भंडारण प्रोटोकॉल पायने, एसएम 43 से अनुकूलित हैं।

चेतावनी: Shigella एसपीपी जोखिम समूह 2 रोगजनकों44 हैं. बीएसएल-2 वातावरण में सभी प्रयोगशाला कार्य करें, शिगेला एसपीपी की कम संक्रामक खुराक के कारण आकस्मिक जोखिम को सीमित करने के लिए किए गए अतिरिक्त सुरक्षा उपायों के साथ।

  1. जमे हुए शेयरों से शिगेला की वृद्धि
    1. क्रायोजेनिक शीशी से जमे हुए संस्कृति की एक छोटी राशि को एक बाँझ आवेदक का उपयोग करके टीएसबी + कांगो लाल अगर प्लेट में स्थानांतरित करें।
    2. लौ एक टीका लूप बाँझ और इसे ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं। प्लेट के एक चतुर्थांश में आगे और पीछे इनोकुलम लकीरें। लूप को फ्लेम करें, इसे ठंडा होने दें, फिर पहले क्वाड्रंट से प्लेट के दूसरे क्वाड्रंट पर स्ट्रीक करें। प्लेट के तीसरे और चौथे चतुर्थांश में इनोकुलम को लकीर करने के लिए दोहराएं।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक चतुर्थांश के बीच एक ताजा बाँझ आवेदक का उपयोग कर लकीर inoculum.
    3. प्लेट को पलटें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: कांगो लाल पॉजिटिव (सीआर +) फेनोटाइप45 के अवलोकन के लिए आवश्यक शिगेला विषाणु कारकों की अभिव्यक्ति के लिए ≥37 डिग्री सेल्सियस तापमान पर इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है। एविरुलेंट कॉलोनियों में एक सफेद उपस्थिति होगी और आक्रामक नहीं होगी।
    4. पैराफिन फिल्म के साथ प्लेट को सील करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रशीतित स्टोर करें।
      नोट: बैक्टीरियल कालोनियों 1-2 सप्ताह के लिए अगर प्लेटों पर व्यवहार्य रहेंगे.
  2. तरल संस्कृति में शिगेला की रातोंरात वृद्धि
    1. बाँझ 14 एमएल संस्कृति ट्यूबों में टीएसबी मीडिया के विभाज्य 3 एमएल।
    2. एक बाँझ आवेदक का उपयोग कर एक एकल, अच्छी तरह से अलग लाल (सीआर +) कॉलोनी उठाओ और तरल मीडिया में पुन: निलंबित.
    3. 250 रोटेशन प्रति मिनट (आरपीएम) पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (16-18 एच) संस्कृतियों सेते हैं.

3. HT-29 यूकेरियोटिक कोशिकाओं की तैयारी

नोट: सभी संस्करणों दो 6 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग कर एक परख के साथ संगत कर रहे हैं. HT-29 सेल लाइनों को अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC) से अधिग्रहित किया गया था। एचटी -29 रखरखाव प्रोटोकॉल एटीसीसी सिफारिशों46 से अनुकूलित कर रहे हैं. सभी मीडिया को उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पूर्व-गर्म किया जाना चाहिए। सभी HT-29 रखरखाव प्रोटोकॉल एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए. पीएच में नाटकीय परिवर्तन से बचने के लिए मीडिया में एचटी -29 कोशिकाओं के साथ मिश्रण/काम करते समय बुलबुले पैदा करने से बचें।

  1. जमे हुए स्टॉक से HT-29 कोशिकाओं को पिघलाना
    1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एचटी -29 कोशिकाओं की शीशी पिघलना.
      नोट: सुनिश्चित करें कि संदूषण से बचने के लिए टोपी पूरी तरह से पानी से ऊपर रहती है। विगलन कम से कम 2 मिनट लेना चाहिए.
    2. संस्कृति पूरी तरह से पिघलना और 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित होने के तुरंत बाद पानी से शीशी निकालें। सुनिश्चित करें कि इस बिंदु से सभी चरणों सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं.
    3. शीशी की सभी सामग्री को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ें जिसमें डीएमईएम + 10% एफबीएस के 9 एमएल हों। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 125 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    4. एक अपशिष्ट कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला छानना और गर्म DMEM + 10% FBS के 10 एमएल में गोली resusend. पुन: निलंबित कोशिकाओं को 75 सेमी2 टिशू कल्चर फ्लास्क (टी 75) में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएल गर्म डीएमईएम + 10% एफबीएस (20 एमएल की कुल मात्रा) हो।
    5. कोशिकाओं को 90% संगम (लगभग 6-7 दिन) तक पहुंचने तक 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: संगम दृश्य सन्निकटन के माध्यम से अनुमान लगाया जाता है।
  2. सीडिंग HT-29 सेल
    1. पीबीएस के प्री-वार्म 20 एमएल और डीएमईएम के 50 एमएल + 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 10% एफबीएस और कमरे के तापमान पर 0.25% (डब्ल्यू / वी) ट्रिप्सिन-ईडीटीए के प्री-वार्म 3 एमएल।
    2. एक बार HT-29 कोशिकाएं (चरण 3.1 से) 90% संगम तक पहुंच जाती हैं, T29 फ्लास्क से HT-75 सेल कल्चर मीडिया को एक अपशिष्ट कंटेनर में हटा दें। फ्लास्क में गर्म पीबीएस के ~ 10 एमएल डालो और धीरे धोने के लिए भंवर. पीबीएस को एक अपशिष्ट कंटेनर में छान लें। गर्म पीबीएस के साथ फिर से धो लें और छान लें।
    3. 0.25% (w/v) ट्रिप्सिन-EDTA के 2-3 एमएल जोड़ें और धीरे से पूरे सतह क्षेत्र में घूमें। 4 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें और धीरे Trypsin-EDTA भंवर, नेत्रहीन सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाओं सतह से अलग.
    5. ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए तुरंत गर्म डीएमईएम + 10% एफबीएस के 6 एमएल जोड़ें। पिपेट ऊपर और नीचे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए.
    6. सभी सामग्री को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर स्पिन करें।
    7. धीरे एक अपशिष्ट कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला छानना और गर्म DMEM + 10% FBS के 6 एमएल में गोली resuspend.
    8. इसके तुरंत बाद निलंबन के बाद, संस्कृति के बीच से निलंबित एचटी -29 कोशिकाओं के 10 माइक्रोन को 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें। पीसीआर ट्यूब में ट्रिपैन ब्लू डाई के 10 माइक्रोन जोड़ें और मिश्रण करें।
    9. एचटी-29 सेल/ट्रिपैन ब्लू मिक्स के 10 माइक्रोन को डिस्पोजेबल काउंटेस सेल काउंटर चैंबर स्लाइड में जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)। जीवित कोशिकाओं की संख्या की गणना करें और सेल व्यवहार्यता की गणना करें।
      नोट: नमूने में कोशिकाओं की संख्या का दस्तावेजीकरण करते समय, "लाइव" सेल गणना के तहत संख्या पढ़ें, कुल सेल गणना नहीं। वैकल्पिक रूप से, सेल गणना एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके मैन्युअल रूप से की जा सकती है।
    10. बीज ने HT-29 कोशिकाओं को एक ताजा T75 फ्लास्क या 6-वेल प्लेट में पुनः निलंबित कर दिया।
      1. T75 फ्लास्क के लिए:
        1. पिपेट धीरे से मिश्रण करने के लिए, फिर नीचे दिए गए समीकरण के अनुसार 2.5 x 106 कोशिकाओं को एक ताजा T75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें:
          Equation 1
        2. 20 एमएल (1.25 x 105 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता) की अंतिम मात्रा में गर्म डीएमईएम + 10% एफबीएस मीडिया जोड़ें।
        3. धीरे आगे और पीछे कमाल से फ्लास्क भर में समान रूप से कोशिकाओं तितर-बितरत.
        4. कोशिकाओं को 80% संगम तक पहुंचने तक 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
          नोट: इष्टतम विकास के लिए, DMEM + 10% FBS मीडिया को हर ~ 3 दिनों में T75 फ्लास्क में बदलें। एक अपशिष्ट कंटेनर में छानना मीडिया और फ्लास्क में गर्म पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें। पीबीएस को धीरे से घुमाएं और इसे अपशिष्ट कंटेनर में छान लें। फिर फ्लास्क में ताजा, गर्म डीएमईएम + 10% एफबीएस के 20 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर पर लौटें।
      2. 6-अच्छी प्लेट के लिए:
        1. पिपेट धीरे मिश्रण करने के लिए, फिर नीचे दिए गए समीकरण के अनुसार 5.85 x 106 कोशिकाओं को एक ताजा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें:
          Equation 2
        2. 26 एमएल (2.25 x 105 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता) की अंतिम मात्रा में गर्म डीएमईएम + 10% एफबीएस मीडिया जोड़ें।
        3. धीरे मिश्रण करने के लिए पिपेट, तो 6 अच्छी तरह से प्लेटों के अलग-अलग कुओं में 2 एमएल (4.5 एक्स 105 कोशिकाओं) बांटना.
        4. धीरे ऊपर / नीचे और छोड़ दिया / सही 2-3x कमाल से अच्छी तरह से भर में कोशिकाओं को तितर-बितर.
        5. 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं 80% -95% संगम (लगभग 3-4 दिनों) तक पहुँचने.
          नोट: आक्रमण और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति परख के लिए 85% संगम की सिफारिश की जाती है, जबकि पालन परख के लिए 90% -95% संगम की सिफारिश की जाती है। कोशिकाओं को लगभग 1 x 106 कोशिकाओं/अच्छी तरह से की अंतिम एकाग्रता के साथ 48 घंटे इनक्यूबेशन के बाद ~ 85% संगम तक पहुंचना चाहिए। वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या और इनक्यूबेशन की लंबाई के लिए समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।
  3. जमे हुए HT-29 स्टॉक बनाना
    1. व्यक्तिगत क्रायोजेनिक शीशियों में डीएमईएम + 10% एफबीएस + 5% डीएमएसओ मीडिया का विभाज्य 1 एमएल।
    2. प्रत्येक शीशी के लिए कदम 3.2.7 से 1 एक्स 106 एचटी -29 कोशिकाओं जोड़ें. नीचे दिए गए सूत्र के अनुसार कोशिकाओं की मात्रा की गणना करें:
      Equation 3
    3. तरल नाइट्रोजन वाष्प भंडारण फ्रीजर में एचटी -29 कोशिकाओं को लंबे समय तक -130 डिग्री सेल्सियस से नीचे स्टोर करें।

4. पालन परख

नोट: सभी संस्करणों दो 6 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग कर एक परख के साथ संगत कर रहे हैं.

  1. उपसंस्कृति रातोंरात शिगेला संस्कृतियों के माध्यम से 1:50 ताजा मीडिया में कमजोर पड़ना।
    1. भंवर, फिर एक उपयुक्त आकार की संस्कृति ट्यूब में ताजा टीएसबी या टीएसबी + बीएस के 5 एमएल में प्रत्येक रातोंरात संस्कृति के 100 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: उचित वातन सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति फ्लास्क या ट्यूब मात्रा के <20% तक संस्कृति की मात्रा सीमित करें।
    2. 250 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं 0.7 के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी600) तक नहीं पहुंच जाती ( शिगेला विकास के मध्य-लॉग चरण); लगभग 2-2.5 एच।
      नोट: उपसंस्कृति के दौरान, डीएमईएम के विभाज्य 50 एमएल और सभी धोने के चरणों के लिए पीबीएस की पर्याप्त मात्रा और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह। मीडिया का उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने की अनुमति दें।
  2. स्थानांतरण 2 x 108 कॉलोनी बनाने इकाइयों (सीएफयू) उपसंस्कृति Shigella व्यक्तिगत 2 एमएल microcentrifuge ट्यूबों के लिए.
    नोट: 2 x 108 सीएफयू 0.7 के आयुध डिपो600 पर बैक्टीरिया कोशिकाओं के लगभग 1 एमएल से मेल खाती है। प्रत्येक व्यक्तिगत स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के अंशांकन के अनुसार CFU/mL का अनुमान लगाने के लिए OD600 रीडिंग का उपयोग करें।
  3. पीबीएस के साथ प्रत्येक Shigella नमूना 2x धो लें.
    1. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 17,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली कोशिकाएं। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, तो गर्म पीबीएस के 1 एमएल जोड़ने के लिए और गोली अच्छी तरह से निलंबित कर दिया, धीरे नमूना ऊपर और नीचे pipeting जब तक मिश्रण पूरी तरह से सजातीय (8-10x) है.
    2. दोहराएँ कदम 4.3.1 1x अतिरिक्त समय.
    3. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 17,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली कोशिकाएं, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करती हैं, और गर्म डीएमईएम के 2 एमएल में छर्रों को फिर से निलंबित करती हैं।
      नोट: पुन: निलंबित बैक्टीरिया की अंतिम एकाग्रता 1 x 108 सीएफयू /
  4. भंवर, फिर 6-अच्छी प्लेटों (चरण 3.2.10.2 से) में तैयार एचटी -29 कॉलोनिक उपकला मोनोलेयर्स के प्रत्येक कुएं में पुन: निलंबित शिगेला के 1 एमएल (1 x 108 सीएफयू) जोड़ें।
    नोट: संक्रमण आम तौर पर 100 के संक्रमण (एमओआई; उपकला कोशिकाओं के लिए बैक्टीरिया का अनुपात) की बहुलता पर किया जाता है। विभिन्न एमओआई का परीक्षण करने के लिए, वांछित एकाग्रता के लिए गर्म डीएमईएम में शिगेला को पतला करें, फिर एचटी -29 मोनोलेयर्स में पतला बैक्टीरिया के 1 एमएल जोड़ें। उदाहरण के लिए, 10 के एमओआई का परीक्षण करने के लिए, गर्म डीएमईएम के 1.35 एमएल में 1 x 108 सीएफयू/एमएल बैक्टीरिया के 150 माइक्रोन जोड़कर बैक्टीरिया 1:10 को पतला करें, फिर एचटी -29 कोशिकाओं पर 1 एमएल (1 x 107 सीएफयू) लागू करें।
  5. 3 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 6-अच्छी प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  6. इनक्यूबेशन के दौरान, जीवाणु संक्रमण अनुमापांक निर्धारित करें।
    1. पीबीएस में पुन: निलंबित शिगेला कोशिकाओं (चरण 4.3.3 से) के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करें।
    2. टीएसबी + कांगो लाल प्लेटों पर 1 x 10-5 और 1 x 10-6 कमजोर पड़ने की प्लेट 100 माइक्रोन और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
      नोट: 1 x 10-5 और 1 x 10-6 कमजोर पड़ने से 100 माइक्रोन चढ़ाना क्रमशः 1 x 10-6 और 1 x 10-7 के अंतिम कमजोर पड़ने वाले कारक से मेल खाती है।
  7. इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस के साथ मोनोलेयर्स 4-5x धो लें।
    1. प्रत्येक कुएं से मीडिया को प्रेरित करें।
      नोट: 6-अच्छी प्लेटों से मीडिया को महाप्राण करते समय, एचटी -29 कोशिकाओं के संपर्क से बचने की कोशिश करते हुए, कुओं के नीचे की तरफ एस्पिरेटर की नोक का मार्गदर्शन करें।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से गर्म पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और धीरे धो लें।
      नोट: धीरे पीबीएस के साथ 6 अच्छी तरह monolayers धोने के लिए, थाली ऊपर और नीचे और benchtop पर पक्ष के लिए पक्ष ले जाएँ. प्लेटों को एक गोलाकार गति में धोना और/या बेंचटॉप सतह से प्लेट को हटाने से प्लास्टिक से कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से हटाया जा सकता है।
    3. दोहराएँ कदम 4.7.1 और 4.7.2 4x अतिरिक्त बार.
  8. आकांक्षा द्वारा पीबीएस निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस + 1% ट्राइटन एक्स -100 के 1 एमएल जोड़कर एचटी -29 कोशिकाओं को लाइज़ करें।
  9. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 अच्छी तरह से प्लेटों सेते हैं.
  10. एक सेल खुरचनी या एक तुला विंदुक टिप का उपयोग करें अच्छी तरह से के नीचे से lysed कोशिकाओं परिमार्जन और एक ताजा 1.7 एमएल microcentrifuge ट्यूब में पूर्ण 1 एमएल हस्तांतरण.
  11. सेल से जुड़े बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करें।
    1. भंवर प्रत्येक ट्यूब (चरण 4.10 से) कम से कम 30 एस के लिए आगे lysed यूकेरियोटिक कोशिकाओं से Shigella विस्थापित करने के लिए.
    2. पीबीएस में lysates के 10 गुना धारावाहिक dilutions तैयार.
    3. टीएसबी + कांगो लाल प्लेटों पर 1 x 10-2, 1 x 10-3, और 1 x 10-4 कमजोर पड़ने की प्लेट 100 माइक्रोन और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: 1 x 10-2, 1 x 10-3, और 1 x 10-4 कमजोर पड़ने से 100 माइक्रोन चढ़ाना क्रमशः 1 x 10-3, 1 x 10-4, और 1 x 10-5 के अंतिम कमजोर पड़ने वाले कारक से मेल खाती है।

5. आक्रमण परख

नोट: सभी संस्करणों दो 6 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग कर एक परख के साथ संगत कर रहे हैं.

  1. उपसंस्कृति रातोंरात शिगेला संस्कृतियों के माध्यम से 1:50 ताजा मीडिया में कमजोर पड़ना।
    1. भंवर, फिर एक उपयुक्त आकार की संस्कृति ट्यूब में ताजा टीएसबी या टीएसबी + बीएस के 5 एमएल में प्रत्येक रातोंरात संस्कृति के 100 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: उचित वातन सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति फ्लास्क या ट्यूब मात्रा के <20% तक संस्कृति की मात्रा सीमित करें।
    2. 250 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं 0.7 के आयुध डिपो600 ( शिगेला विकास के मध्य-लॉग चरण) तक नहीं पहुंच जातीं; लगभग 2-2.5 एच।
      नोट: उपसंस्कृति के दौरान, डीएमईएम + 50 मिलीग्राम/एमएल जेंटामाइसिन के विभाज्य 50 एमएल और सभी धोने के चरणों के लिए पीबीएस की पर्याप्त मात्रा और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह। मीडिया का उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने की अनुमति दें।
  2. स्थानांतरण 2 x 108 CFUs उपसंस्कृति Shigella व्यक्तिगत करने के लिए 2 एमएल microcentrifuge ट्यूबों.
    नोट: 2 x 108 सीएफयू 0.7 के आयुध डिपो600 पर बैक्टीरिया कोशिकाओं के लगभग 1 एमएल से मेल खाती है। प्रत्येक व्यक्तिगत स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के अंशांकन के अनुसार CFU/mL का अनुमान लगाने के लिए OD600 रीडिंग का उपयोग करें।
  3. पीबीएस के साथ Shigella नमूने 1x धो लें.
    1. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 17,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली कोशिकाएं। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, तो गर्म पीबीएस के 1 एमएल जोड़ने के लिए और गोली अच्छी तरह से निलंबित कर दिया, धीरे नमूना ऊपर और नीचे pipeting जब तक मिश्रण पूरी तरह से सजातीय (8-10x) है.
    2. 5.3.1 कदम दोहराएँ. 1x अतिरिक्त समय।
    3. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 17,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली कोशिकाएं, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करती हैं, और गर्म डीएमईएम के 2 एमएल में छर्रों को फिर से निलंबित करती हैं।
      नोट: पुन: निलंबित बैक्टीरिया की अंतिम एकाग्रता 1 x 108 सीएफयू /
  4. भंवर, फिर 6-अच्छी प्लेटों (चरण 3.2.10.2 से) में तैयार एचटी -29 कॉलोनिक एपिथेलियल मोनोलेयर्स के प्रत्येक कुएं में पुन: निलंबित शिगेला प्लस डीएमईएम के 1 एमएल (1 x 108 सीएफयू) जोड़ें।
    नोट: संक्रमण आम तौर पर 100 के संक्रमण (एमओआई; उपकला कोशिकाओं के लिए बैक्टीरिया का अनुपात) की बहुलता पर किया जाता है। विभिन्न एमओआई का परीक्षण करने के लिए, वांछित एकाग्रता के लिए डीएमईएम में शिगेला को पतला करें, फिर एचटी -29 मोनोलेयर्स में पतला बैक्टीरिया के 1 एमएल जोड़ें। उदाहरण के लिए, 10 के एमओआई का परीक्षण करने के लिए, डीएमईएम के 1.35 एमएल में 1 x 108 सीएफयू/एमएल बैक्टीरिया के 150 माइक्रोन जोड़कर बैक्टीरिया 1:10 को पतला करें, फिर एचटी -29 कोशिकाओं में 1 एमएल (1 x 107 सीएफयू) जोड़ें।
  5. एचटी -29 कोशिकाओं के साथ जीवाणु संपर्क को बढ़ावा देने के लिए, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर 6-अच्छी प्लेटों को अपकेंद्रित्र करें या तापमान सेटिंग को समायोजित किया जा सकता है तो 37 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन एचटी -29 कोशिकाओं के साथ बैक्टीरिया के संपर्क को बढ़ावा देता है, जो पालन कारकों की आवश्यकता को दरकिनार करता है और बैक्टीरिया को कोशिकाओं पर जल्दी से आक्रमण करने की अनुमति देता है।
  6. 45 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 अच्छी तरह से प्लेटें सेते हैं।
  7. इनक्यूबेशन के दौरान, जीवाणु संक्रमण अनुमापांक निर्धारित करें।
    1. पीबीएस में पुन: निलंबित शिगेला कोशिकाओं (चरण 5.3.3 से) के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करें।
    2. टीएसबी + कांगो लाल प्लेटों पर 1 x 10-5 और 1 x 10-6 कमजोर पड़ने की प्लेट 100 माइक्रोन और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
      नोट: 1 x 10-5 और 1 x 10-6 कमजोर पड़ने से 100 माइक्रोन चढ़ाना क्रमशः 1 x 10-6 और 1 x 10-7 के अंतिम कमजोर पड़ने वाले कारक से मेल खाती है।
  8. अच्छी तरह से पीबीएस के 1 एमएल के साथ संक्रमित एचटी -29 कोशिकाओं 3x धो लें।
    1. प्रत्येक कुएं से मीडिया को प्रेरित करें।
      नोट: 6-अच्छी प्लेटों से मीडिया को महाप्राण करते समय, एचटी -29 कोशिकाओं के संपर्क से बचने की कोशिश करते हुए, कुओं के नीचे की तरफ एस्पिरेटर की नोक का मार्गदर्शन करें।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से गर्म पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और धीरे धो लें।
      नोट: धीरे पीबीएस के साथ 6 अच्छी तरह monolayers धोने के लिए, थाली ऊपर और नीचे और benchtop पर पक्ष के लिए पक्ष ले जाएँ. प्लेटों को एक गोलाकार गति में धोना और/या बेंचटॉप सतह से प्लेट को हटाने से प्लास्टिक से कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से हटाया जा सकता है।
    3. दोहराएँ कदम 5.8.1 और 5.8.2 2x अतिरिक्त बार.
  9. आकांक्षा द्वारा पीबीएस निकालें, फिर प्रत्येक अच्छी तरह से 50 माइक्रोग्राम/एमएल जेंटामाइसिन के साथ पूरक गर्म डीएमईएम के 2 एमएल जोड़ें और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  10. अच्छी तरह से पीबीएस के 1 एमएल के साथ संक्रमित एचटी -29 कोशिकाओं 3x धो लें।
    1. 5.8 धोने कदम दोहराएँ.
  11. आकांक्षा द्वारा पीबीएस निकालें, फिर प्रत्येक अच्छी तरह से 50 माइक्रोग्राम/एमएल जेंटामाइसिन के साथ पूरक गर्म डीएमईएम के 2 एमएल जोड़ें और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. अच्छी तरह से पीबीएस के 1 एमएल के साथ संक्रमित एचटी -29 कोशिकाओं 3x धो लें।
    1. 5.8 धोने कदम दोहराएँ.
  13. आकांक्षा द्वारा पीबीएस निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस + 1% ट्राइटन एक्स -100 के 1 एमएल जोड़कर एचटी -29 कोशिकाओं को लाइज़ करें।
  14. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 अच्छी तरह से प्लेटों सेते हैं.
  15. एक सेल खुरचनी या एक तुला विंदुक टिप का उपयोग करें अच्छी तरह से के नीचे से lysed कोशिकाओं परिमार्जन और एक ताजा 1.7 एमएल microcentrifuge ट्यूब में पूर्ण 1 एमएल हस्तांतरण.
  16. इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करें।
    1. भंवर प्रत्येक ट्यूब (चरण 5.15 से) कम से कम 30 एस के लिए आगे lysed यूकेरियोटिक कोशिकाओं से Shigella विस्थापित करने के लिए.
    2. पीबीएस में lysates के 10 गुना धारावाहिक dilutions तैयार.
    3. टीएसबी + कांगो लाल प्लेटों पर 1 x 10-2 और 1 x 10-3 कमजोर पड़ने की प्लेट 100 माइक्रोन और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
      नोट: 1 x 10-2 और 1 x 10-3 कमजोर पड़ने से 100 माइक्रोन चढ़ाना क्रमशः 1 x 10-3 और 1 x 10-4 के अंतिम कमजोर पड़ने वाले कारक से मेल खाती है।

6. इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति परख

नोट: सभी संस्करणों दो 6 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग कर एक परख के साथ संगत कर रहे हैं.

  1. उपसंस्कृति रातोंरात शिगेला संस्कृतियों के माध्यम से 1:50 ताजा मीडिया में कमजोर पड़ना।
    1. भंवर, फिर एक उपयुक्त आकार की संस्कृति ट्यूब में ताजा टीएसबी या टीएसबी + बीएस के 5 एमएल में प्रत्येक रातोंरात संस्कृति के 100 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: उचित वातन सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति फ्लास्क या ट्यूब मात्रा के <20% तक संस्कृति की मात्रा सीमित करें।
    2. 250 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं 0.7 के आयुध डिपो600 ( शिगेला विकास के मध्य-लॉग चरण) तक नहीं पहुंच जातीं; लगभग 2-2.5 एच।
      नोट: उपसंस्कृति के दौरान, डीएमईएम + 50 मिलीग्राम/एमएल जेंटामाइसिन के विभाज्य 50 एमएल और सभी धोने के चरणों के लिए पीबीएस की पर्याप्त मात्रा और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह। मीडिया का उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने की अनुमति दें।
  2. स्थानांतरण 2 x 108 CFUs उपसंस्कृति Shigella व्यक्तिगत करने के लिए 2 एमएल microcentrifuge ट्यूबों.
    नोट: 2 x 108 सीएफयू 0.7 के आयुध डिपो600 पर बैक्टीरिया कोशिकाओं के लगभग 1 एमएल से मेल खाती है। प्रत्येक व्यक्तिगत स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के अंशांकन के अनुसार CFU/mL का अनुमान लगाने के लिए OD600 रीडिंग का उपयोग करें।
  3. पीबीएस के साथ Shigella नमूने 1x धो लें.
    1. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 17,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली कोशिकाएं। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, तो गर्म पीबीएस के 1 एमएल जोड़ने के लिए और गोली अच्छी तरह से निलंबित कर दिया, धीरे नमूना ऊपर और नीचे pipeting जब तक मिश्रण पूरी तरह से सजातीय (8-10x) है.
    2. 6.3.1 कदम दोहराएँ. 1x अतिरिक्त समय।
    3. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 17,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली कोशिकाएं, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करती हैं, और गर्म डीएमईएम के 2 एमएल में छर्रों को फिर से निलंबित करती हैं।
      नोट: पुन: निलंबित बैक्टीरिया की अंतिम एकाग्रता 1 x 108 सीएफयू /
  4. भंवर, फिर 6-अच्छी प्लेटों (चरण 3.2.10.2 से) में तैयार एचटी -29 कॉलोनिक एपिथेलियल मोनोलेयर्स के प्रत्येक कुएं में पुन: निलंबित शिगेला प्लस डीएमईएम के 1 एमएल (1 x 108 सीएफयू) जोड़ें।
    नोट: संक्रमण आम तौर पर 100 के संक्रमण (एमओआई; उपकला कोशिकाओं के लिए बैक्टीरिया का अनुपात) की बहुलता पर किया जाता है। विभिन्न एमओआई का परीक्षण करने के लिए, वांछित एकाग्रता के लिए डीएमईएम में शिगेला को पतला करें, फिर एचटी -29 मोनोलेयर्स में पतला बैक्टीरिया के 1 एमएल जोड़ें। उदाहरण के लिए, 10 के एमओआई का परीक्षण करने के लिए, डीएमईएम के 1.35 एमएल में 1 x 108 सीएफयू/एमएल बैक्टीरिया के 150 माइक्रोन जोड़कर बैक्टीरिया 1:10 को पतला करें, फिर एचटी -29 कोशिकाओं पर 1 एमएल (1 x 107 सीएफयू) लागू करें।
  5. एचटी -29 कोशिकाओं के साथ जीवाणु संपर्क को बढ़ावा देने के लिए, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर 6-अच्छी प्लेटों को अपकेंद्रित्र करें या तापमान सेटिंग को समायोजित किया जा सकता है तो 37 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन एचटी -29 कोशिकाओं के साथ बैक्टीरिया के संपर्क को बढ़ावा देता है, जो पालन कारकों की आवश्यकता को दरकिनार करता है और बैक्टीरिया को कोशिकाओं पर जल्दी से आक्रमण करने की अनुमति देता है।
  6. 45 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 अच्छी तरह से प्लेटें सेते हैं।
  7. इनक्यूबेशन के दौरान, जीवाणु संक्रमण अनुमापांक निर्धारित करें।
    1. पीबीएस में पुन: निलंबित शिगेला कोशिकाओं (चरण 6.3.3 से) के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करें।
    2. टीएसबी + कांगो लाल प्लेटों पर 1 x 10-5 और 1 x 10-6 कमजोर पड़ने की प्लेट 100 माइक्रोन और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
      नोट: 1 x 10-5 और 1 x 10-6 कमजोर पड़ने से 100 माइक्रोन चढ़ाना क्रमशः 1 x 10-6 और 1 x 10-7 के अंतिम कमजोर पड़ने वाले कारक से मेल खाती है।
  8. अच्छी तरह से पीबीएस के 1 एमएल के साथ संक्रमित एचटी -29 कोशिकाओं 3x धो लें।
    1. प्रत्येक कुएं से मीडिया को प्रेरित करें।
      नोट: 6-अच्छी प्लेटों से मीडिया को महाप्राण करते समय, एचटी -29 कोशिकाओं के संपर्क से बचने की कोशिश करते हुए, कुओं के नीचे की तरफ एस्पिरेटर की नोक का मार्गदर्शन करें।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से गर्म पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और धीरे धो लें।
      नोट: धीरे पीबीएस के साथ 6 अच्छी तरह monolayers धोने के लिए, थाली ऊपर और नीचे और benchtop पर पक्ष के लिए पक्ष ले जाएँ. प्लेटों को एक गोलाकार गति में धोना और/या बेंचटॉप सतह से प्लेट को हटाने से प्लास्टिक से कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से हटाया जा सकता है।
    3. दोहराएँ कदम 6.8.1 और 6.8.2 2x अतिरिक्त बार.
  9. आकांक्षा द्वारा पीबीएस निकालें, फिर प्रत्येक अच्छी तरह से 50 माइक्रोग्राम/एमएल जेंटामाइसिन के साथ पूरक गर्म डीएमईएम के 2 एमएल जोड़ें और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  10. अच्छी तरह से पीबीएस के 1 एमएल के साथ संक्रमित एचटी -29 कोशिकाओं 3x धो लें।
    1. 6.8 धोने कदम दोहराएँ.
  11. आकांक्षा द्वारा पीबीएस निकालें, फिर 6-अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 50 माइक्रोग्राम/एमएल जेंटामाइसिन के साथ 2 एमएल गर्म डीएमईएम जोड़ें और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति (24 घंटे तक) की अनुमति देने के लिए वांछित लंबाई के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  12. अच्छी तरह से पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं 2x धो लें.
    1. 6.8 धोने कदम दोहराएँ.
  13. आकांक्षा द्वारा पीबीएस निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस + 1% ट्राइटन एक्स -100 के 1 एमएल जोड़कर एचटी -29 कोशिकाओं को लाइज़ करें।
  14. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 अच्छी तरह से प्लेटों सेते हैं.
  15. अच्छी तरह से नीचे से lysed कोशिकाओं को परिमार्जन करने के लिए एक सेल खुरचनी या तुला विंदुक टिप का उपयोग करें और एक ताजा 1.7 एमएल microcentrifuge ट्यूब में पूर्ण 1 एमएल हस्तांतरण.
  16. इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करें।
    1. भंवर प्रत्येक ट्यूब (चरण 6.15 से) कम से कम 30 s के लिए आगे lysed यूकेरियोटिक कोशिकाओं से Shigella विस्थापित करने के लिए.
    2. पीबीएस में lysates के 10 गुना धारावाहिक dilutions तैयार.
    3. टीएसबी + कांगो लाल प्लेटों पर 1 x 10-2, 1 x 10-3, और 1 x 10-4 कमजोर पड़ने की प्लेट 100 माइक्रोन और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
      नोट: 1 x 10-2, 1 x 10-3, और 1 x 10-4 कमजोर पड़ने से 100 माइक्रोन चढ़ाना क्रमशः 1 x 10-3, 1 x 10-4, और 1 x 10-5 के अंतिम कमजोर पड़ने वाले कारक से मेल खाती है।

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Representative Results

अनुपालन, आक्रमण, और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति परख की तुलना एस फ्लेक्सनेरी 2457T जंगली प्रकार (WT) से S. flexneri ΔVF (ΔVF) से की गई, जो शिगेला विषाणु को नकारात्मक रूप से विनियमित करने के लिए एक उत्परिवर्ती परिकल्पना है। चूंकि शिगेला विषाणु 17,18,47को विनियमित करने के लिए एक संकेत के रूप में पित्त लवण का उपयोग करता है, इसलिए टीएसबी मीडिया में बैक्टीरियल उपसंस्कृति के बाद प्रयोग किए गए थे और साथ ही टीएसबी 0.4% (डब्ल्यू / वी) पित्त लवण18 के साथ पूरक थे। उपसंस्कृति कदम के दौरान पित्त लवण जोखिम कोलोनिक संक्रमण 17,18,47 से पहले छोटी आंतों के पारगमन को दोहराने के लिए एक पूर्व उपचार के रूप में कार्य करता है। चित्रा 1 एचटी -29 कॉलोनिक उपकला कोशिकाओं का पालन करने के लिए एस फ्लेक्सनेरी की क्षमता पर ΔVF उत्परिवर्तन के प्रभाव का विश्लेषण करता है। प्रतिशत पालन y-अक्ष पर प्लॉट किया गया है और इनपुट बैक्टीरिया की संख्या के लिए मानकीकृत HT-29 lysis के बाद बरामद बैक्टीरिया के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। जैसा कि अपेक्षित था, दोनों एस फ्लेक्सनेरी डब्ल्यूटी और ΔVF उपभेदों के पालन में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी जब पित्त लवण पूरकता के बिना टीएसबी की तुलना में पित्त लवण पूरकता के साथ उपसंस्कृति18. हालांकि, प्रत्येक उपसंस्कृति स्थिति के भीतर डब्ल्यूटी और ΔVF उत्परिवर्ती उपभेदों के बीच एचटी -29 कोशिकाओं के पालन में कोई अंतर नहीं था। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि ΔVF उत्परिवर्तन का पित्त लवण पूर्व-उपचार के साथ या बिना HT-29 उपकला कोशिकाओं का पालन करने के लिए S. flexneri की क्षमता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है।

चित्रा 2 में, एस फ्लेक्सनेरी की क्षमता पर ΔVF उत्परिवर्तन का प्रभाव (चित्रा 2ए) पर आक्रमण करने और एचटी -29 कॉलोनिक उपकला कोशिकाओं के अंदर (चित्रा 2 बी) को दोहराने के लिए पित्त लवण पूर्व उपचार के साथ विश्लेषण किया गया था। प्रतिशत वसूली वाई-अक्ष पर प्लॉट की जाती है और इनपुट बैक्टीरिया की संख्या के लिए मानकीकृत एचटी -29 सेल लाइसिस के बाद बरामद जीवाणु कोशिकाओं के अनुपात का प्रतिनिधित्व करती है। चित्रा 2 ए में, डब्ल्यूटी एस फ्लेक्सनेरी 2457 टी की क्षमता में पित्त लवण48 के पूर्व-जोखिम के बाद एचटी -29 कोशिकाओं पर आक्रमण करने की क्षमता में अपेक्षित उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी, जबकि एस फ्लेक्सनेरी ΔVF उत्परिवर्ती ने डब्ल्यूटी तनाव की तुलना में पित्त लवण पूर्व-जोखिम के बाद आक्रमण में एक छोटी वृद्धि प्रदर्शित की। ΔVF उत्परिवर्ती ने TSB में WT उपसंस्कृति की तुलना में HT-29 कोशिकाओं की आक्रमण दरों में वृद्धि की थी, लेकिन WT के समान आक्रमण दर थी जब TSB में उपसंस्कृति पित्त लवण(चित्रा 2A)के साथ पूरक थी। इन परिणामों से पता चलता है कि ΔVF उत्परिवर्तन HT-29 कोशिकाओं पर आक्रमण करने के लिए S. flexneri की क्षमता को बढ़ाता है, जो पित्त लवण के पूर्व-जोखिम के प्रभाव को कम करता है, भले ही ΔVF उत्परिवर्ती की आक्रमण क्षमता पित्त लवण उपसंस्कृति के बाद और बढ़ गई।

कुल मिलाकर, 90 मिनट इनक्यूबेशन(चित्रा 2ए)की तुलना में रातोंरात इनक्यूबेशन(चित्रा 2बी)के बाद 10 गुना अधिक बैक्टीरिया बरामद किए गए थे, जो क्रमशः इंट्रासेल्युलर विकास बनाम आक्रमण की निगरानी में अंतर को दर्शाता है। जब संक्रमित एचटी -29 कोशिकाओं को बैक्टीरिया (चित्रा 2बी)के इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति की अनुमति देने के लिए 18 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था, तो डब्ल्यूटी और ΔVF दोनों उपभेदों के लिए पित्त लवण पूर्व-उपचार का प्रभाव कम हो गया। हालांकि, इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति के दौरान पित्त लवण पूर्व-उपचार का कम प्रभाव ΔVF उत्परिवर्ती के लिए अधिक नाटकीय था। चूंकि पित्त लवण के पूर्व-संपर्क में आने पर दोनों उपभेदों की इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति में वृद्धि समान परिस्थितियों में आक्रमण दर में वृद्धि से छोटी थी, इसलिए हम अनुमान लगाते हैं कि पित्त लवण का एस फ्लेक्सनेरी रोगजनन में शुरुआती चरणों पर अधिक प्रभाव पड़ता है। ΔVF उत्परिवर्ती ने दोनों उपसंस्कृति स्थितियों के बाद WT(चित्रा 2B) की तुलना में HT-29 कोशिकाओं के अंदर रातोंरात प्रतिकृति से प्रतिशत वसूली में वृद्धि प्रदर्शित की। हालांकि, ΔVF उत्परिवर्ती की प्रतिशत वसूली पित्त लवण पूर्व-जोखिम की परवाह किए बिना समान थी। इन डेटा रुझानों से पता चलता है कि ΔVF उत्परिवर्ती WT की तुलना में HT-29 कोशिकाओं के अंदर अधिक कुशलता से प्रतिकृति करता है, और पित्त लवण पूर्व-एक्सपोजर ΔVF उत्परिवर्ती की इंट्रासेल्युलर रूप से दोहराने की क्षमता को प्रभावित नहीं करता है, जैसा कि WT (चित्र 2B) के लिए देखा गया है। चूंकि पित्त लवण पूर्व-जोखिम की स्थिति में उत्परिवर्ती और डब्ल्यूटी उपभेदों के बीच का अंतर 90 मिनट आक्रमण परख के दौरान नहीं देखा गया था, इसलिए हम अनुमान लगाते हैं कि हटाए गए वीएफ जीन द्वारा एन्कोड किया गया उत्पाद एचटी -29 कोशिकाओं के अंदर एस फ्लेक्सनेरी प्रतिकृति को भी विनियमित कर सकता है। संयुक्त, दोनों विश्लेषणों से पता चलता है कि ΔVF उत्परिवर्ती WT के सापेक्ष अधिक विषैला है, जो बताता है कि VF जीन उत्पाद S. flexneri विषाणु का एक नकारात्मक नियामक है।

Figure 1
चित्रा 1: पित्त लवण पूर्व-एक्सपोजर ने एचटी -29 कोशिकाओं के लिए एस फ्लेक्सनेरी का पालन प्रेरित किया। एस फ्लेक्सनेरी 2457T WT और ΔVF उत्परिवर्ती कोशिकाओं को TSB या TSB में 0.4% (w/v) पित्त लवण (TSB + BS) मीडिया के साथ पूरक किया गया था। बैक्टीरिया को तब एचटी -29 कोशिकाओं पर 100 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर लागू किया गया था और पालन की जांच के लिए 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। इनक्यूबेशन के बाद, संक्रमित एचटी -29 कोशिकाओं को धोया गया और lysed किया गया, और बरामद बैक्टीरिया के सीरियल dilutions एमएल (सीएफयू / एमएल) प्रति कॉलोनी बनाने इकाइयों की गणना करने के लिए चढ़ाया गया. प्रतिशत पालन स्थापित करने के लिए इनपुट बैक्टीरिया टाइटर्स के सापेक्ष पक्षपाती बैक्टीरिया की संख्या को प्लॉट किया जाता है। डेटा तीन तकनीकी प्रतिकृतियों (व्यक्तिगत डॉट्स) के साथ एक जैविक प्रतिकृति के प्रतिनिधि हैं। त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की मानक त्रुटि को इंगित करती हैं। सांख्यिकीय महत्व एक छात्र के टी-टेस्ट (* पी < 0.05; *** पी < 0.001) द्वारा निर्धारित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पित्त लवण पूर्व जोखिम डब्ल्यूटी एस flexneri आक्रमण और intracellular प्रतिकृति में वृद्धि. एस फ्लेक्सनेरी 2457T WT और ΔVF उत्परिवर्ती कोशिकाओं को पित्त लवण (TSB + BS) मीडिया के साथ पूरक TSB या TSB में उपसंवर्धित किया गया था। बैक्टीरिया को तब 100 के एमओआई पर एचटी -29 कोशिकाओं पर लागू किया गया था, कोशिकाओं पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, और 45 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया था, और बाह्य बैक्टीरिया को विशेष रूप से इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया को पुनर्प्राप्त करने के लिए डीएमईएम में जेंटामाइसिन के अतिरिक्त द्वारा lysed किया गया था। 90 मिनट (ए, बैक्टीरियल आक्रमण) या 18 घंटे (बी, इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति) ऊष्मायन के बाद, संक्रमित एचटी -29 कोशिकाओं को धोया गया और lysed किया गया, और बरामद बैक्टीरिया के धारावाहिक dilutions प्रति एमएल (सीएफयू / एमएल) प्रति कॉलोनी बनाने इकाइयों की गणना करने के लिए चढ़ाया गया. प्रतिशत वसूली स्थापित करने के लिए इनपुट बैक्टीरियल टाइटर्स के सापेक्ष इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया की संख्या प्लॉट की जाती है। डेटा एक जैविक प्रतिकृति के प्रतिनिधि हैं, प्रत्येक में तीन तकनीकी प्रतिकृतियां (व्यक्तिगत डॉट्स) हैं। त्रुटि पट्टियाँ SEM इंगित करती हैं। सांख्यिकीय महत्व एक छात्र के टी-टेस्ट (* पी < 0.05) द्वारा निर्धारित किया गया था। कृपया पैनल (A) और (B) के बीच y-अक्ष पैमानों में अंतर पर ध्यान दें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल शिगेला पालन, आक्रमण, और आंतों के उपकला कोशिकाओं के इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति का अध्ययन करने के लिए तीन मानकीकृत परखों के एक सेट का वर्णन करता है। हालांकि इन विधियों केवल शास्त्रीय gentamicin assays मेजबान कोशिकाओं 49,50,51 के भीतर विभिन्न जीवाणु रोगजनकों के आक्रमण और intracellular प्रतिकृति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया के संशोधित संस्करण हैं, विशेष विचार शिगेला का अध्ययन करते समय लागू किया जाना चाहिए.

शिगेला संकाय एनारोबेस हैं, जो वातन43 के साथ समृद्ध माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर बेहतर रूप से बढ़ते हैं। शिगेला संक्रमण पर विभिन्न पर्यावरणीय संकेतों या चयापचयों के प्रभावों से पूछताछ करने के लिए इन परखों का प्रदर्शन करते समय, शिगेला को रातोंरात समृद्ध मीडिया में विकसित करने की सिफारिश की जाती है, फिर संक्रमण से पहले मध्य-लॉग चरण में परिभाषित या पूरक मीडिया में उपसंस्कृति। अधिकतम विषाणु जीन अभिव्यक्ति विकास52,53 के लघुगणक चरण के दौरान होता है. इस प्रकार, रातोंरात शिगेला संस्कृतियों को उप-संवर्धन करना और बैक्टीरिया के विकास को घातीय चरण (ओडी600 ~ 0.7) की अनुमति देना शिगेला विषाणु का ठीक से आकलन करने के लिए आवश्यक कदम हैं। इसके अलावा, विषाणु जीन अभिव्यक्ति तापमान पर निर्भर है। मेजबान संक्रमण के दौरान केवल अभिव्यक्ति के लिए विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए, विषाणु जीन मेजबान शारीरिक तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) पर प्रेरित होते हैं और कम तापमान (जैसे, 30 डिग्री सेल्सियस)54पर सख्ती से दमित होते हैं। विषाणु जीन की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए, बैक्टीरियल सबकल्चरिंग और संक्रमण 37 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करने के लिए उचित देखभाल के साथ कि तापमान 37 डिग्री सेल्सियस से नीचे नहीं जाता है। एक बड़ा, 220 किलोबेस विषाणु प्लाज्मिड, जो आक्रमण और उपकला कोशिका संक्रमण के लिए आवश्यक आणविक मशीनरी को एन्कोड करता है, सभी शिगेला एसपीपी5 के लिए एक आवश्यक विषाणु निर्धारक है। 37 डिग्री सेल्सियस पर बार-बार गुजरने और लंबे समय तक वृद्धि विषाणु प्लास्मिड अस्थिरता को बढ़ावा देती है, जिसके परिणामस्वरूप प्लास्मिड हानि होती है और शिगेला कोशिकाओं को55 प्रदान किया जाता है। विषाणु प्लास्मिड रखरखाव और महत्वपूर्ण विषाणु जीन की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए, ताजा टीएसबी + कांगो लाल संकेतक प्लेटों पर हर दो सप्ताह में फ्रीजर स्टॉक से सीधे बैक्टीरिया को बहाल करने की सिफारिश की जाती है। कांगो लाल अगर जंगली प्रकार विषाणुजनित (लाल, सीआर +) कालोनियों और avirulent (सफेद, सीआर-) कालोनियों है कि विषाणु प्लाज्मिड45 खो दिया है के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि विषाणु प्लास्मिड अस्थिरता बार-बार देखी जाती है, तो शिगेला की रातोंरात संस्कृतियों को विषाणु प्लास्मिड हानि को रोकने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जा सकता है, इसके बाद विषाणु जीन अभिव्यक्ति43 को बढ़ावा देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सबकल्चरिंग किया जा सकता है। अंत में, यदि म्यूटेंट और / या पूरक उपभेदों के साथ विश्लेषण किया जाता है, जिसमें इन जीवाणु उपभेदों में एंटीबायोटिक मार्कर मौजूद हैं, तो बैक्टीरिया रातोंरात और उप-संवर्धन चरणों के दौरान उचित एंटीबायोटिक चयन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

इन विट्रो में शिगेला रोगजनन के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए HT-29 उपकला मोनोलेयर के उपयोग के कई फायदे हैं। चूंकि शिगेला एक मानव-अनुकूलित रोगज़नक़ है, इसलिए छोटे पशु मॉडल मनुष्यों में मनाए गए शिगेलोसिस के विशिष्ट रोगजनन को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करतेहैं 36. इस प्रकार, मानव-व्युत्पन्न सेल लाइनों के संक्रमण के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग इस रोगज़नक़ और इसके मूल मेजबान के बीच आणविक परस्पर क्रिया को चिह्नित करने के लिए जीवाणु रोगजनन के व्यक्तिगत चरणों की मात्रात्मक पूछताछ को सक्षम बनाता है। ऐतिहासिक रूप से, हेला कोशिकाओं का उपयोग मुख्य रूप से इन विट्रो 25,56,57में मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जाता था। हालांकि, हेला कोशिकाएं एक अमर गर्भाशय ग्रीवा कैंसर सेल लाइन हैं, जो एंटरिक बैक्टीरियल रोगजनकों के लिए गैर-देशी मेजबान कोशिकाएं हैं। इस प्रकार, आंत्र रोगजनन के इन विट्रो अध्ययन में कोलोनिक एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइनों (जैसे, एचटी -29, काको -2, और टी 84) के उपयोग में स्थानांतरित हो गए हैं, जो आंतों के उपकला आकृति विज्ञान को अधिक ईमानदारी से पुन: व्यवस्थित करते हैं, और ट्रांसवेल्स पर उगाए जा सकते हैं विभेदित शिखर और बेसोलेटरल सतहों 58,59,60 के साथ उपकला मोनोलेयर के रूप में. यद्यपि प्रत्येक सेल लाइन की अपनी व्यक्तिगत ताकत और कमजोरियां होती हैं, एचटी-29 कोशिकाओं का उपयोग आंतों के एंटरोसाइट्स के लिए फेनोटाइपिक समानता और सेल सतह रिसेप्टर्स और प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स 58,59,61की मजबूत अभिव्यक्ति के कारण यहां वर्णित परख में किया जाता है। हालांकि, इन चर्चा किए गए मॉडलों में से प्रत्येक कैंसर-व्युत्पन्न सेल लाइनें हैं जो विवो58 में कोलोनिक एपिथेलियम की प्राकृतिक शारीरिक स्थिति का सटीक प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। मानव ऊतक संस्कृति तकनीकों में हालिया प्रगति ने मानव आंतों की स्टेम कोशिकाओं की खेती को सक्षम किया है, ऊतक बायोप्सी से प्राप्त, ऑर्गेनोइड या एकल दो-आयामी सेल मोनोलेयर्स में जो मानव जठरांत्र (जीआई) पथ 62,63,64 में मौजूद विभिन्न सेल प्रकारों को पुन: व्यवस्थित करते हैं. आंतों के ऑर्गेनोइड को एंटरोसाइट्स, बलगम पैदा करने वाली गॉब्लेट कोशिकाओं, एम कोशिकाओं और अन्य ऊतक-विशिष्ट सेल प्रकारों को शामिल करने के लिए विभेदित किया जा सकता है। हाल के अध्ययनों ने एंटरिक रोगजनकों के अध्ययन के लिए इन ऑर्गेनॉइड मॉडल के उपयोग को मान्य किया है, जिसमें विभिन्न शिगेला एसपीपी, साल्मोनेला एंटरिका और एस्चेरिचिया कोलाई पैथोवर 62,63,64शामिल हैं। हालांकि ऑर्गेनोइड मानव जीआई उपकला के अधिक सटीक मॉडल हैं और यहां तक कि वैश्विक आबादी65 का प्रतिनिधित्व करने के लिए विभिन्न पोषक तत्वों की स्थिति में सुसंस्कृत किया जा सकता है, उनकी सापेक्ष जटिलता के लिए महत्वपूर्ण प्रशिक्षण और तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप पारंपरिक कैंसर सेल लाइनों की तुलना में उच्च लागत और लंबे समय तक संवर्धन समयहोता है।

यह प्रोटोकॉल मध्यम-थ्रूपुट विधियों का वर्णन करता है, जिससे परीक्षण के लिए उपलब्ध कुल 12 मोनोलेयर्स के लिए दो 6-अच्छी प्लेटों का उपयोग किया जाता है। हालांकि, प्रयोगों को आसानी से अतिरिक्त तकनीकी प्रतिकृतियों को समायोजित करने के लिए वरीयता प्राप्त मोनोलेयर्स की संख्या बढ़ाने के लिए बढ़ाया जा सकता है, या अतिरिक्त शिगेला म्यूटेंट और पर्यावरण संकेतों का परीक्षण किया जा सकता है। अधिक कुओं (जैसे, 12 अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह से प्लेटों) के साथ टिशू कल्चर प्लेटों भी छोटे व्यास के साथ कुओं के लिए खाते में उचित समायोजन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. चरण 3.2 में उल्लिखित HT-29 विकास स्थितियों के तहत, HT-29 टाइटर्स HT-29 सेल संस्कृति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त शेष कोशिकाओं के साथ, एक T75 फ्लास्क से खेती के बाद लगभग छह 6-अच्छी प्लेटों को बोने के लिए पर्याप्त हैं। इसके अलावा, एचटी -29 मोनोलेयर्स की बीजारोपण और बैक्टीरिया चरणों को टीका लगाने की तैयारी बैक्टीरिया के पालन, आक्रमण और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति परख के बीच समान है। इस प्रकार, एक ही शिगेला उपभेदों या उपसंस्कृति की स्थिति का परीक्षण करने वाले परख आसानी से समानांतर में प्रदर्शन किया जा सकता है ताकि शिगेला संक्रमण के विभिन्न चरणों में प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति की भूमिका की जांच की जा सके।

पालन (चरण 4), आक्रमण (चरण 5), और इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया (चरण 6) के लिए रिकवरी टाइटर्स को लाइसिस के बाद संक्रमित एचटी -29 कोशिकाओं के धारावाहिक कमजोर पड़ने से निर्धारित किया जाता है, जो शिगेला संक्रमण के प्रत्येक चरण की दक्षता के मात्रात्मक मूल्यांकन को सक्षम बनाता है। शास्त्रीय परख 49,50,51के आधार पर आक्रमण और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति परख में सेंट्रीफ्यूजेशन कदम, तत्काल आक्रमण के लिए मेजबान कोशिकाओं के साथ जीवाणु संपर्क को बढ़ावा देते हैं और आक्रमण दरों को बढ़ाते हैं। इस प्रकार, centrifugation "छोड़ देता है" पालन कदम, जो बाद में Shigella संक्रमण 17,18,19,66 का एक महत्वपूर्ण पहलू होने की खोज की गई थी. यह ध्यान रखना आवश्यक है कि अपकेंद्रित्र कदम ट्रांसवेल्स पर वरीयता प्राप्त ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाओं के साथ नहीं किया जा सकता है। पालन परख के लिए, हालांकि, पालन को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा मजबूर नहीं किया जाता है, और लसीका से पहले संक्रमित एचटी -29 कोशिकाओं में कोई जेंटामाइसिन नहीं जोड़ा जाता है, इस प्रकार पक्षपाती जीवाणु कोशिकाओं की गणना की अनुमति मिलती है। टिशू कल्चर मीडिया की मात्रा एचटी -29 कोशिकाओं के साथ बैक्टीरिया के अधिक कुशल संपर्क को सक्षम करने के लिए 1 एमएल (आक्रमण और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति परख के लिए 2 एमएल के विपरीत) तक कम हो जाती है। इसके अलावा, पालन की दर के आधार पर, कुछ आक्रमण और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति 3 घंटे इनक्यूबेशन के दौरान हो सकती है, लेकिन राशि आमतौर पर नगण्य होती है (उदाहरण के लिए, मेजबान सेल लसीका के बाद बरामद जीवाणु आबादी का केवल 0.05%)। फिर भी, 3 घंटे इनक्यूबेशन के दौरान पालन बनाम इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया के लिए ठीक से खाते के लिए, समानांतर परख करने की सिफारिश की जाती है, जहां, कथित प्रोटोकॉल के अलावा, एक दूसरी प्लेट को इनक्यूबेशन डीएमईएम के 2 एमएल में 50 माइक्रोग्राम/एमएल जेंटामाइसिन के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। प्रोटोकॉल में उल्लेख के रूप में HT-29 सेल lysis के बाद, intracellular बैक्टीरिया ऊपर उल्लेख के रूप में गणना की जा सकती है, और हमला किया है कि बैक्टीरिया की संख्या का प्रतिनिधित्व करेंगे. इस मान को तब उचित रूप से पालन करने और आक्रमण किए गए बैक्टीरिया को निर्धारित करने के लिए जेंटामाइसिन उपचार के बिना प्लेट से गणना किए गए बैक्टीरिया से घटाया जा सकता है। आक्रमण के बाद एचटी -29 कोशिकाओं के अंदर शिगेला की इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति में अधिक अंतर्दृष्टि देने के लिए समानांतर विश्लेषण भी किए जा सकते हैं, उदाहरण के लिए, इंट्रासेल्युलर विकास घटता करने के लिए कई समय बिंदुओं का उपयोग करना। अंत में, 18 घंटे जेंटामाइसिन इनक्यूबेशन के बाद इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया की गणना के साथ, संस्कृति सुपरनेटेंट को संक्रमित एचटी -29 कोशिकाओं के साइटोकिन स्राव के लिए एकत्र और विश्लेषण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, आईएल -8 उपकला कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक केमोकाइन है जो बड़े पैमाने पर संक्रमण की साइट पर पीएमएन की भर्ती के लिए कार्य करता है। संक्रमित एचटी -29 कोशिकाओं की संस्कृति मीडिया में स्रावित आईएल -8 की मात्रा का विश्लेषण आईएल -8 एलिसा परख67 के साथ किया जा सकता है।

पित्त लवण मानव जीआई प्रणाली के माध्यम से पारगमन के दौरान शिगेला के लिए एक महत्वपूर्ण विषाणु संकेत साबित हुआ है, और इन प्रोटोकॉल में बैक्टीरिया के विकास मीडिया को पूरक करने के लिए विशिष्ट जीआई स्थितियों को दोहराने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्वाभाविक रूप से, पित्त लवण को पाचन में सहायता के लिए ग्रहणी या छोटी आंत के ऊपरी हिस्से में पेश किया जाता है; और टर्मिनल इलियम या छोटी आंत के अंत में, 95% पित्त लवण हटा दिए जाते हैं और पित्ताशय की थैली68 में अंतिम जमा के लिए परिसंचरण में वापस पुनर्नवीनीकरण किया जाता है। पित्त लवण में आमतौर पर छोटी आंत में 0.2% -2.0% (डब्ल्यू / वी) के बीच एकाग्रता होती है और स्वाभाविक रूप से जीवाणुनाशक होते हैं। हालांकि, शिगेला, अधिकांश आंत्र बैक्टीरिया के साथ, पित्त लवण का विरोध करते हैं और संक्रमण को बढ़ाने के लिए संकेतों का उपयोगकरते हैं 47. कई अध्ययनों ने दस्तावेज किया है कि पित्त लवण का जोखिम, कभी-कभी ग्लूकोज जैसे अन्य छोटे आंतों के संकेतों के संयोजन में, संक्रमण से पहले शिगेला के अस्तित्व और विषाणु विनियमन को प्रभावित करता है। शिगेला पित्त लवण का विरोध करने के लिए दिखाया गया है, जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन, और फार्म और शर्तों है कि 17,69 छोटी आंतों पारगमनपुन: पेश में एक बायोफिल्म तितर-बितर. अध्ययनों से पता चला है कि इन परिवर्तनों के परिणामस्वरूप एक हाइपरविरुलेंट फेनोटाइप होता है, जिसमें शिगेला 17,18,19,48,66द्वारा बाद के कॉलोनिक संक्रमण पर पालन और आक्रमण प्रेरित होता है। इस प्रकार, ऊपर उल्लिखित शर्तें दस्तावेज हैं कि पालन, आक्रमण, या इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति परख करने से पहले छोटे आंतों के पारगमन की नकल करने के लिए पित्त लवण में शिगेला को कैसे उपसंस्कृति किया जाए। निर्दिष्ट टीएसबी फॉर्मूलेशन में विशिष्ट लुरिया शोरबा (एलबी)17के सापेक्ष ग्लूकोज जोड़ा गया है। इस प्रकार, यदि एलबी का उपयोग किया जाता है, तो छोटी आंत17 में ग्लूकोज संकेतों पर उचित रूप से विचार करने के लिए ग्लूकोज (0.5% -2.0% [डब्ल्यू / इसके अलावा, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, सभी शिगेला उपसंस्कृतियों को पित्त लवण को हटाने और संक्रमण विश्लेषण के लिए बृहदान्त्र में संक्रमण की नकल करने के लिए धोया जाता है।

परंपरागत रूप से, और जैसा कि ऊपर दिए गए परिणामों में हाइलाइट किया गया है (चित्र 1 और चित्र 2), शिगेला संक्रमण में किसी विशेष जीन की भूमिका निर्धारित करने के लिए संक्रमण परख मूल्यवान हैं। हालांकि, विभिन्न म्यूटेंट के फेनोटाइप को बैक्टीरियल कल्चर मीडिया के उचित पूरक के बिना वास्तव में सराहना नहीं की जा सकती है। जैसा कि पूर्व शोध से पता चला है, पित्त लवण महत्वपूर्ण रूप से एस फ्लेक्सनेरी जीन अभिव्यक्ति को बदल देते हैं, जिसमें केंद्रीय चयापचय, प्रतिलेखन कारक, चीनी ट्रांसपोर्टर्स, दवा प्रतिरोध, और विषाणु जीन या तो गुणसूत्र या विषाणु प्लास्मिड17 पर एन्कोड किए गए जीन शामिल हैं। ये जीन इस बात की अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं कि शिगेला जीन अभिव्यक्ति को बदलने और बृहदान्त्र के अंतिम संक्रमण के लिए तैयार करने के संकेत के रूप में पित्त लवण का उपयोग कैसे करता है, और बाद में उत्परिवर्ती विश्लेषण इस प्रकार उचित पूरक जीवाणु विकास मीडिया में किए जाने की आवश्यकता होती है। जैसा कि चित्र 1 और चित्र 2 में ऊपर देखा गया है, ΔVF उत्परिवर्तन ने पालन को प्रभावित नहीं किया लेकिन आक्रमण और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति को प्रभावित किया। चूंकि उत्परिवर्तन ने आक्रमण और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति को बढ़ाया, इसलिए वर्तमान में यह निर्धारित करने के लिए प्रयोग चल रहे हैं कि जीन उत्पाद संक्रमण को कैसे नियंत्रित करता है। उत्परिवर्ती विश्लेषण एक उदाहरण के रूप में कार्य करते हैं कि शिगेला रोगजनन में नई समझ का अध्ययन कैसे किया जा सकता है, खासकर उन स्थितियों में जो मानव जीआई पथ को बेहतर ढंग से दोहराते हैं। विभिन्न म्यूटेंट के फेनोटाइप को मान्य करने के लिए उचित पूरक विश्लेषण की सिफारिश की जाती है।

संयोजन में, ये प्रक्रियाएं मात्रात्मक प्रयोगों का वर्णन करती हैं जो संक्रमण के दौरान मानव जीआई पथ के प्राकृतिक वातावरण की सर्वोत्तम नकल करके एचटी -29 कॉलोनिक उपकला कोशिकाओं के अंदर शिगेला पालन, आक्रमण और प्रतिकृति के आणविक तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करेंगी। भविष्य के अध्ययन म्यूटेंट और प्रयोगात्मक स्थितियों पर विस्तार कर सकते हैं ताकि शिगेला मानव मेजबानों के लिए कैसे तैयार करता है और प्रभावी ढंग से संक्रमित करता है, इसकी बेहतर समझ हासिल कर सकता है। दशकों के शोध के बावजूद, शिगेला संक्रमण के बारे में पता लगाने के लिए अभी भी बहुत कुछ है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखकों के समर्थन में मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल का बाल रोग विभाग, अनुसंधान अंतरिम सहायता अनुदान (ISF) पुरस्कार 2022A009041 पर कार्यकारी समिति, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी एंड इंफेक्शियस डिजीज ग्रांट R21AI146405, और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज हार्वर्ड (NORCH) 2P30DK040561-26 में पोषण मोटापा अनुसंधान केंद्र प्रदान करते हैं। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशन के निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PES filter Millipore-Sigma SCGP00525 Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes Corning 352059 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes Corning 430829 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates Corning 3516 Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts Sigma-Aldrich B8756 1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye Sigma-Aldrich C6277 A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283 To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 10569-010 DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135 Heat-inactivated, sterile
Gentamicin Sigma-Aldrich G3632 Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line ATCC HTB-38 Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film Bemis PM999 Laboratory sealing film
Petri dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 1x concentration; pH 7.4
Select agar Invitrogen 30391023 A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks Corning 430641U Tissue culture flasks
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stain Invitrogen T10282 A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB) Sigma-Aldrich T8907 Bacterial growth media

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References

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<em>उपकला सेल संक्रमण शिगेला</em> के साथ विश्लेषण
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Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (204), e66426, doi:10.3791/66426 (2024).

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