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Immunology and Infection

Análisis de Infección de Células Epiteliales con Shigella

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/66426
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

El presente protocolo describe ensayos de infección para interrogar la adherencia, invasión y replicación intracelular de Shigella utilizando líneas celulares epiteliales in vitro .

Abstract

Shigella, patógeno bacteriano entérico adaptado al ser humano, causa millones de infecciones cada año, crea efectos de crecimiento a largo plazo entre los pacientes pediátricos y es una de las principales causas de muertes diarreicas en todo el mundo. La infección induce diarrea acuosa o sanguinolenta como resultado de que el patógeno transita por el tracto gastrointestinal e infecta las células epiteliales que recubren el colon. Con el asombroso aumento de la resistencia a los antibióticos y la actual falta de vacunas aprobadas, los protocolos de investigación estandarizados son fundamentales para estudiar este formidable patógeno. Aquí, se presentan metodologías para examinar la patogénesis molecular de Shigella utilizando análisis in vitro de adherencia bacteriana, invasión y replicación intracelular en células epiteliales del colon. Antes de los análisis de infección, el fenotipo de virulencia de las colonias de Shigella se verificó mediante la absorción del colorante rojo Congo en placas de agar. También se pueden considerar medios de laboratorio suplementados durante el cultivo bacteriano para imitar las condiciones in vivo. A continuación, las células bacterianas se utilizan en un protocolo estandarizado para infectar las células epiteliales del colon en placas de cultivo de tejidos en una multiplicidad establecida de infección con adaptaciones para analizar cada etapa de la infección. Para los ensayos de adherencia, las células de Shigella se incuban con niveles reducidos de medios para promover el contacto bacteriano con las células epiteliales. Tanto para los ensayos de invasión como para los de replicación intracelular, la gentamicina se aplica durante varios intervalos de tiempo para eliminar las bacterias extracelulares y permitir la evaluación de la invasión y/o la cuantificación de las tasas de replicación intracelular. Todos los protocolos de infección enumeran las bacterias adherentes, invadidas y/o intracelulares mediante la dilución en serie de lisados de células epiteliales infectadas y la siembra de unidades formadoras de colonias bacterianas en relación con los títulos de infección en placas de agar rojo Congo. En conjunto, estos protocolos permiten la caracterización independiente y las comparaciones para cada etapa de la infección por Shigella de las células epiteliales para estudiar este patógeno con éxito.

Introduction

Las enfermedades diarreicas causadas por patógenos bacterianos entéricos son una importante carga para la salud mundial. En 2016, las enfermedades diarreicas fueron responsables de 1,3 millones de muertes en todo el mundo y fueron la cuarta causa de muerte en niños menores de cinco años 1,2. El patógeno bacteriano entérico gramnegativo Shigella es el agente causal de la shigelosis, una de las principales causas de muerte diarreica en todo el mundo3. La shigelosis causa una morbilidad y mortalidad significativas cada año en niños de países de ingresos bajos y medianos 4,5, mientras que las infecciones en los países de ingresos altos están relacionadas con brotes de guarderías, transmitidos por los alimentos y por el agua 6,7,8,9. El desarrollo ineficaz de vacunas10 y el aumento de las tasas de resistencia a los antimicrobianos (RAM)11,12 han complicado el tratamiento de los brotes de Shigella a gran escala. Datos recientes de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades muestran que casi el 46% de las infecciones por Shigella en los Estados Unidos mostraron resistencia a los medicamentos en 202013,14, mientras que la Organización Mundial de la Salud ha declarado a Shigella como un patógeno prioritario de la resistencia a los antimicrobianos para el que se necesitan urgentemente nuevas terapias15.

Las infecciones por Shigella se transmiten fácilmente por vía fecal-oral tras la ingestión de alimentos o agua contaminados, o por contacto humano directo. Shigella ha evolucionado hasta convertirse en un patógeno eficiente y adaptado al ser humano, con una dosis infecciosa de 10-100 bacterias suficiente para causar la enfermedad16. Durante el tránsito del intestino delgado, Shigella está expuesta a señales ambientales, como temperatura elevada y bilis17. La detección de estas señales induce cambios transcripcionales para expresar factores de virulencia que potencian la capacidad de la bacteria para infectar el colon humano 17,18,19. Shigella no invade el epitelio colónico desde la superficie apical, sino que transita a través de la capa epitelial después de ser absorbida por células especializadas de micropliegues presentadores de antígenos (células M) dentro del epitelio asociado al folículo 20,21,22. Después de la transcitosis, las células de Shigella son fagocitadas por los macrófagos residentes. Shigella escapa rápidamente del fagosoma y desencadena la muerte celular de los macrófagos, lo que resulta en la liberación de citoquinas proinflamatorias 5,23,24. A continuación, Shigella invade las células epiteliales del colon desde el lado basolateral, lisa la vacuola macropinocítica y establece un nicho replicativo en el citoplasma 5,25. Las citocinas proinflamatorias, en particular la interleucina-8 (IL-8), reclutan leucocitos neutrófilos polimorfonucleares (PMN) en el sitio de la infección, lo que debilita las uniones estrechas epiteliales y permite la infiltración bacteriana del revestimiento epitelial para exacerbar la infección basolateral5. Las PMN destruyen el revestimiento epitelial infectado para contener la infección, lo que da lugar a los síntomas característicos de la disentería bacilar (sanguinolenta)5. Aunque los mecanismos de invasión y replicación intracelular han sido ampliamente caracterizados, nuevas investigaciones están demostrando nuevos conceptos importantes en la infección por Shigella, incluyendo la regulación de la virulencia durante el tránsito gastrointestinal (GI)17, la adherencia19, la mejora del acceso basolateral a través de la permeabilidad de barrera26 y el porte asintomático en niños desnutridos27.

La capacidad de Shigella spp. para causar enfermedades diarreicas está restringida a humanos y primates no humanos (NHP)28. Se han desarrollado modelos de infección intestinal por Shigella para pez cebra29, ratones30, cobayas31, conejos 21,32,33 y cerdos34,35. Sin embargo, ninguno de estos sistemas modelo puede replicar con precisión las características de la enfermedad observadas durante la infección humana36. Aunque se han establecido modelos NHP de shigelosis para estudiar la patogénesis de Shigella, estos sistemas modelo son costosos de implementar y requieren dosis infecciosas artificialmente altas, hasta nueve órdenes de magnitud más altas que la dosis infecciosa de los humanos 37,38,39,40,41,42. Por lo tanto, la notable adaptación de Shigella para la infección de huéspedes humanos requiere el uso de cultivos celulares derivados de humanos para recrear modelos fisiológicamente relevantes para un interrogatorio preciso de la patogénesis de Shigella.

Aquí, se describen procedimientos detallados para medir las tasas de adherencia de Shigella , invasión y replicación dentro de las células epiteliales del colon HT-29. Utilizando estos protocolos estandarizados, se pueden interrogar los mecanismos moleculares por los cuales los genes de virulencia bacteriana y las señales ambientales afectan cada paso de la infección por Shigella para comprender mejor la relación dinámica de interacción huésped-patógeno.

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Protocol

1. Preparación de reactivos y materiales

NOTA: Todos los volúmenes son consistentes con un ensayo que utiliza dos placas de 6 pocillos.

  1. Medio TSB: Añadir 0,5 L de agua desionizada (DI) a 15 g de medio caldo de soja tríptico (TSB, ver Tabla de Materiales) y autoclave. Almacenar a temperatura ambiente.
  2. Medio de sales biliares (TSB + BS): Para preparar TSB que contenga 0,4% (p/v) de sales biliares, vuelva a suspender 0,06 g de sales biliares (BS, consulte la Tabla de materiales) en 15 ml de TSB esterilizada en autoclave. Esterilizar con filtro con un filtro PES de 0,22 μm.
    NOTA: Las sales biliares consisten en una mezcla 1:1 de colato de sodio y desoxicolato de sodio. Prepare los medios nuevos inmediatamente antes de usarlos.
  3. DMEM + 10% (v/v) FBS: Agregue 5 mL de suero fetal bovino (FBS) a 45 mL de Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco. Conservar a 4 °C.
  4. DMEM + gentamicina: A un tubo de 50 ml, agregue 50 ml de DMEM y 50 μl de gentamicina de 50 mg/ml (ver Tabla de materiales).
    NOTA: Preparar alícuotas frescas y calentar en un baño de agua a 37 °C antes de cada experimento.
  5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: Agregue 150 μL de Triton X-100 a 15 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    NOTA: Preparar alícuotas frescas y calentar en un baño de agua a 37 °C antes de cada experimento.
  6. Placas indicadoras TSB + Congo rojo: Agregue 15 g de TSB, 7,5 g de agar seleccionado y 0,125 g de colorante rojo Congo (ver Tabla de materiales) a una botella de 1 L. Agregue 0,5 L de agua desionizada y autoclave. Vierta 10-20 ml de medio en placas de Petri estériles individuales (100 mm x 15 mm) y deje que se solidifique.
    PRECAUCIÓN: El rojo del Congo es cancerígeno y una toxina reproductiva. Asegúrese de que la manipulación del rojo Congo se realice utilizando el equipo de protección personal adecuado. Consulte la hoja de datos de seguridad del producto para obtener información adicional.
    NOTA: Aproximadamente 20 placas están hechas de medios rojos Congo de 0,5 L. Los platos se pueden preparar con 2-3 días de anticipación y dejar invertidos a temperatura ambiente hasta su uso. Para el almacenamiento a largo plazo, coloque las placas invertidas en fundas de plástico a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
  7. DMEM + 10 % (v/v) de FBS y 5 % (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO): Agregue 42,5 ml de DMEM, 5 ml de FBS y 2,5 ml de DMSO a un tubo de 50 ml. Conservar a 4 °C.

2. Preparación de bacterias

NOTA: Todos los protocolos de cultivo y almacenamiento de Shigella en laboratorio están adaptados de Payne, S. M.43.

PRECAUCIÓN: Shigella spp. son patógenos del Grupo de Riesgo2 44. Realice todo el trabajo de laboratorio en un entorno BSL-2, con medidas de seguridad adicionales para limitar las exposiciones accidentales debido a la baja dosis infecciosa de Shigella spp.

  1. Crecimiento de Shigella a partir de existencias congeladas
    1. Transfiera una pequeña cantidad de cultivo congelado del vial criogénico a una placa de agar rojo TSB + Congo con un aplicador estéril.
    2. Esterilizar con llama un asa de inoculación y dejar que se enfríe. Raye el inóculo hacia adelante y hacia atrás a través de un cuadrante de la placa. Enciende el bucle, deja que se enfríe y luego pasa del primer cuadrante al segundo cuadrante del plato. Repita para rayar el inóculo en el tercer y cuarto cuadrante de la placa.
      NOTA: Alternativamente, aplique el inóculo de rayas con un aplicador estéril nuevo entre cada cuadrante.
    3. Invierta la placa e incube a 37 °C durante la noche.
      NOTA: Se requiere incubación a temperaturas de ≥37 °C para la expresión de los factores de virulencia de Shigella necesarios para la observación del fenotipo45 rojo Congo positivo (CR+). Las colonias avirulentas tendrán un aspecto blanco y no serán invasivas.
    4. Sellar la placa con film de parafina y conservar refrigerada a 4 °C.
      NOTA: Las colonias bacterianas permanecerán viables en placas de agar durante 1-2 semanas.
  2. Crecimiento nocturno de Shigella en cultivo líquido
    1. Alícuota 3 mL de medio TSB en tubos de cultivo estériles de 14 mL.
    2. Elija una sola colonia roja (CR+) bien aislada con un aplicador estéril y vuelva a suspenderla en medios líquidos.
    3. Incubar los cultivos durante la noche (16-18 h) a 37 °C con agitación a 250 rotaciones por minuto (rpm).

3. Preparación de células eucariotas HT-29

NOTA: Todos los volúmenes son consistentes con un ensayo que utiliza dos placas de 6 pocillos. Las líneas celulares HT-29 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Los protocolos de mantenimiento HT-29 son una adaptación de las recomendaciones46 de la ATCC. Todos los medios deben precalentarse en un baño de agua a 37 °C antes de su uso. Todos los protocolos de mantenimiento de HT-29 deben realizarse en un gabinete de bioseguridad. Absténgase de producir burbujas al mezclar/trabajar con células HT-29 en medios para evitar cambios drásticos en el pH.

  1. Descongelación de células HT-29 de material congelado
    1. Descongelar el vial de células HT-29 en un baño de agua a 37 °C.
      NOTA: Asegúrese de que la tapa permanezca completamente por encima del agua para evitar la contaminación. La descongelación debe tomar menos de 2 minutos.
    2. Retire el vial del agua inmediatamente después de que el cultivo esté completamente descongelado y descontamine con etanol al 70%. Asegúrese de que todos los pasos a partir de este punto se realicen utilizando técnicas asépticas.
    3. Añadir todo el contenido del vial a un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga 9 mL de DMEM + 10% de FBS. Centrifugar a 125 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    4. Decantar el sobrenadante en un contenedor de residuos y resuspender el pellet en 10 mL de DMEM tibio + 10% FBS. Transferir las células resuspendidas a un matraz de cultivo de tejidos de 75cm2 (T75) que contenga 10 mL de DMEM caliente + 10% de FBS (volumen total de 20 mL).
    5. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2 hasta que las células alcancen el 90% de confluencia (aproximadamente 6-7 días).
      NOTA: La confluencia se estima a través de una aproximación visual.
  2. Siembra de células HT-29
    1. Precalentar 20 mL de PBS y 50 mL de DMEM + 10% FBS en un baño de agua a 37 °C y precalentar 3 mL de tripsina-EDTA al 0,25% (p/v) a temperatura ambiente.
    2. Una vez que las células HT-29 (del paso 3.1) alcancen el 90% de confluencia, decantar los medios de cultivo celular HT-29 del matraz T75 en un contenedor de residuos. Vierta ~ 10 ml de PBS tibio en el matraz y revuelva suavemente para lavar. Decantar el PBS en un contenedor de residuos. Lavar con PBS tibio de nuevo y decantar.
    3. Añadir 2-3 ml de tripsina-EDTA al 0,25% (p/v) y agitar suavemente por toda la superficie. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 min.
    4. Retire el matraz de la incubadora y agite suavemente la tripsina-EDTA, asegurándose visualmente de que todas las células se desprendan de la superficie.
    5. Agregue inmediatamente 6 ml de DMEM tibio + 10% de FBS para desactivar la tripsina. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.
    6. Transfiera todo el contenido a un tubo de centrífuga de 15 ml y gírelo a 500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    7. Decantar suavemente el sobrenadante en un contenedor de residuos y volver a suspender el gránulo en 6 ml de DMEM tibio + 10% de FBS.
    8. Inmediatamente después de la resuspensión, transfiera 10 μL de células HT-29 suspendidas desde el centro del cultivo a un tubo de PCR de 0,2 mL. Añadir 10 μL de colorante azul de tripano al tubo de PCR y mezclar.
    9. Agregue 10 μL de mezcla de celda HT-29 / azul de tripano a un portaobjetos desechable de la cámara de contador de celdas Countess (consulte la Tabla de materiales). Enumere el número de células vivas y calcule la viabilidad de las células.
      NOTA: Al documentar el número de células en la muestra, lea el número debajo del recuento de células "vivas", no el recuento total de células. Alternativamente, la enumeración de células se puede realizar manualmente utilizando un hemocitómetro.
    10. La semilla resuspendió las células HT-29 en un matraz T75 fresco o en una placa de 6 pocillos.
      1. Para matraz T75:
        1. Pipetear suavemente para mezclar, luego transferir 2,5 x 106 celdas a un matraz T75 nuevo de acuerdo con la siguiente ecuación:
          Equation 1
        2. Agregue DMEM caliente + 10% de medios FBS a un volumen final de 20 ml (concentración final de 1,25 x 105 células/ml).
        3. Disperse las células de manera uniforme a lo largo del matraz balanceándolo suavemente hacia adelante y hacia atrás.
        4. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.
          NOTA: Para un crecimiento óptimo, reemplace el medio DMEM + 10% FBS en el matraz T75 cada ~ 3 días. Decantar los medios en un contenedor de residuos y añadir 10 ml de PBS tibio al matraz. Gire el PBS suavemente y decántelo en el contenedor de desechos. A continuación, añadir 20 ml de DMEM fresco y tibio + 10% de FBS al matraz y volver a la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 .
      2. Para placa de 6 pocillos:
        1. Pipetear suavemente para mezclar, luego transferir 5.85 x 106 celdas a un tubo cónico nuevo de 50 mL de acuerdo con la siguiente ecuación:
          Equation 2
        2. Añadir DMEM caliente + 10% de medios FBS hasta un volumen final de 26 mL (concentración final de 2,25 x 105 células/mL).
        3. Pipetear suavemente para mezclar, luego dispensar 2 ml (4,5 x 105 celdas) en pocillos individuales de placas de 6 pocillos.
        4. Disperse las células de manera uniforme a través del pocillo balanceándolas suavemente hacia arriba / abajo y hacia la izquierda / derecha 2-3x.
        5. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 hasta que las células alcancen el 80%-95% de confluencia (aproximadamente 3-4 días).
          NOTA: Se recomienda una confluencia del 85% para los ensayos de invasión y replicación intracelular, mientras que se recomienda una confluencia del 90%-95% para los ensayos de adherencia. Las células deben alcanzar una confluencia de ~85% después de 48 h de incubación con una concentración final de aproximadamente 1 x 106 células/pocillo. Es posible que se requieran ajustes en el número de células sembradas y la duración de la incubación.
  3. Fabricación de existencias HT-29 congeladas
    1. Alícuota de 1 ml de DMEM + 10% de FBS + 5% de DMSO en viales criogénicos individuales.
    2. Añadir 1 x 106 células HT-29 del paso 3.2.7 a cada vial. Calcule el volumen de las celdas de acuerdo con la siguiente fórmula:
      Equation 3
    3. Almacene las celdas HT-29 a largo plazo por debajo de -130 °C en un congelador de almacenamiento de vapor de nitrógeno líquido.

4. Ensayo de adherencia

NOTA: Todos los volúmenes son consistentes con un ensayo que utiliza dos placas de 6 pocillos.

  1. Subcultivo durante la noche Cultivos de Shigella mediante dilución 1:50 en medios frescos.
    1. A continuación, agregue 100 μL de cada cultivo durante la noche a 5 mL de TSB fresco o TSB + BS en un tubo de cultivo de tamaño adecuado.
      NOTA: Limite el volumen de cultivo al <20% del volumen del matraz o tubo de cultivo para garantizar una aireación adecuada.
    2. Incubar a 37 °C con agitación a 250 rpm hasta que las células alcancen una densidad óptica (DO600) de 0,7 (fase logarítmica media del crecimiento de Shigella ); alrededor de 2-2,5 h.
      NOTA: Durante el subcultivo, alícuota 50 mL de DMEM y un volumen suficiente de PBS para todos los pasos de lavado y colóquelo en un baño de agua a 37 °C. Deje que el medio alcance los 37 °C antes de su uso.
  2. Transfiera 2 x 108 unidades formadoras de colonias (UFC) subcultivadas de Shigella a tubos de microcentrífuga individuales de 2 mL.
    NOTA: 2 x 108 UFC corresponde aproximadamente a 1 ml de células bacterianas con un diámetro exterior de600 de 0,7. Utilice lecturas de OD600 para aproximar UFC/ml de acuerdo con la calibración de cada espectrofotómetro individual.
  3. Lave cada muestra de Shigella 2 veces con PBS.
    1. Células de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, luego agregar 1 mL de PBS tibio y resuspender bien el gránulo, pipeteando suavemente la muestra hacia arriba y hacia abajo hasta que la mezcla sea completamente homogénea (8-10x).
    2. Repita el paso 4.3.1 1 vez más.
    3. Células de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos en 2 mL de DMEM tibio.
      NOTA: La concentración final de bacterias resuspendidas será de 1 x 108 UFC/mL.
  4. A continuación, agregue 1 ml (1 x 108 UFC) de Shigella resuspendida a cada pocillo de las monocapas epiteliales colónicas HT-29 preparadas en placas de 6 pocillos (del paso 3.2.10.2).
    NOTA: Las infecciones se realizan normalmente con una multiplicidad de infecciones (MOI; proporción de células bacterianas y epiteliales) de 100. Para probar diferentes MOI, diluya Shigella resuspendida en DMEM tibio a la concentración deseada, luego agregue 1 ml de bacterias diluidas a las monocapas HT-29. Por ejemplo, para probar un MOI de 10, diluya las bacterias 1:10 agregando 150 μl de bacterias 1 x 108 UFC/ml a 1,35 ml de DMEM tibio y, a continuación, aplique 1 ml (1 x 107 UFC) a las células HT-29.
  5. Incubar las placas de 6 pocillos a 37 °C con 5% de CO2 durante 3 h.
  6. Durante la incubación, determine el título de infección bacteriana.
    1. Preparar diluciones seriadas 10 veces de células Shigella resuspendidas (del paso 4.3.3) en PBS.
    2. Colocar 100 μL de las diluciones 1 x 10-5 y 1 x 10-6 en placas TSB + Congo rojo e incubar durante la noche a 37 °C.
      NOTA: El recubrimiento de 100 μL de las diluciones 1 x 10-5 y 1 x 10-6 corresponde a un factor de dilución final de 1 x 10-6 y 1 x 10-7, respectivamente.
  7. Después de la incubación, lavar las monocapas 4-5 veces con PBS.
    1. Aspire los medios de cada pocillo.
      NOTA: Al aspirar medios de placas de 6 pocillos, guíe la punta del aspirador a lo largo de la parte inferior de los pocillos, tratando de evitar el contacto con las celdas HT-29.
    2. Agregue 1 ml de PBS tibio a cada pocillo y lávelos suavemente.
      NOTA: Para lavar suavemente monocapas de 6 pocillos con PBS, mueva la placa hacia arriba y hacia abajo y de lado a lado sobre la mesa de trabajo. Lavar las placas con movimientos circulares y/o retirar la placa de la superficie de la mesa de trabajo puede provocar la eliminación mecánica de las células del plástico.
    3. Repita los pasos 4.7.1 y 4.7.2 4 veces más.
  8. Eliminar el PBS por aspiración y lisar las células HT-29 añadiendo 1 mL de PBS + 1% de Triton X-100 a cada pocillo.
  9. Incubar placas de 6 pocillos a 37 °C durante 5 min.
  10. Utilice un raspador de células o una punta de pipeta doblada para raspar las células lisadas del fondo del pocillo y transfiera 1 ml completo a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,7 ml.
  11. Determinar el número de bacterias asociadas a las células.
    1. Agitar cada tubo (a partir del paso 4.10) durante al menos 30 s para desplazar aún más a Shigella de las células eucariotas lisadas.
    2. Prepare diluciones seriadas 10 veces mayores de lisados en PBS.
    3. Colocar 100 μL de las diluciones 1 x 10-2, 1 x 10-3 y 1 x 10-4 en placas TSB + rojo Congo e incubar durante la noche a 37 °C.
      NOTA: El recubrimiento de 100 μL de las diluciones 1 x 10-2, 1 x 10-3 y 1 x 10-4 corresponde a un factor de dilución final de 1 x 10-3, 1 x 10-4 y 1 x 10-5, respectivamente.

5. Ensayo de invasión

NOTA: Todos los volúmenes son consistentes con un ensayo que utiliza dos placas de 6 pocillos.

  1. Subcultivo durante la noche Cultivos de Shigella mediante dilución 1:50 en medios frescos.
    1. A continuación, agregue 100 μL de cada cultivo durante la noche a 5 mL de TSB fresco o TSB + BS en un tubo de cultivo de tamaño adecuado.
      NOTA: Limite el volumen de cultivo al <20% del volumen del matraz o tubo de cultivo para garantizar una aireación adecuada.
    2. Incubar a 37 °C con agitación a 250 rpm hasta que las células alcancen un OD600 de 0,7 (fase logarítmica media del crecimiento de Shigella ); alrededor de 2-2,5 h.
      NOTA: Durante el subcultivo, alícuota 50 mL de DMEM + 50 mg/mL de gentamicina y un volumen suficiente de PBS para todos los pasos de lavado y colóquelo en un baño de agua a 37 °C. Deje que el medio alcance los 37 °C antes de su uso.
  2. Transfiera 2 x 108 UFC subcultivadas Shigella a tubos de microcentrífuga individuales de 2 mL.
    NOTA: 2 x 108 UFC corresponde aproximadamente a 1 ml de células bacterianas con un diámetro exterior de600 de 0,7. Utilice lecturas de OD600 para aproximar UFC/ml de acuerdo con la calibración de cada espectrofotómetro individual.
  3. Lave las muestras de Shigella 1 vez con PBS.
    1. Células de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, luego agregar 1 mL de PBS tibio y resuspender bien el gránulo, pipeteando suavemente la muestra hacia arriba y hacia abajo hasta que la mezcla sea completamente homogénea (8-10x).
    2. Repita el paso 5.3.1. 1 vez más tiempo.
    3. Células de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos en 2 mL de DMEM tibio.
      NOTA: La concentración final de bacterias resuspendidas será de 1 x 108 UFC/mL.
  4. Vórtice, luego agregue 1 mL (1 x 108 UFC) de Shigella resuspendida más 1 mL de DMEM a cada pocillo de las monocapas epiteliales colónicas HT-29 preparadas en placas de 6 pocillos (del paso 3.2.10.2).
    NOTA: Las infecciones se realizan normalmente con una multiplicidad de infecciones (MOI; proporción de células bacterianas y epiteliales) de 100. Para probar diferentes MOI, diluya Shigella resuspendida en DMEM a la concentración deseada, luego agregue 1 ml de bacterias diluidas a las monocapas HT-29. Por ejemplo, para probar un MOI de 10, diluya las bacterias 1:10 agregando 150 μL de bacterias 1 x 108 UFC/ml a 1,35 ml de DMEM, luego agregue 1 ml (1 x 107 UFC) a las células HT-29.
  5. Para promover el contacto bacteriano con las células HT-29, centrifugue las placas de 6 pocillos a 2.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente o 37 °C si se puede ajustar el ajuste de temperatura.
    NOTA: La centrifugación promueve el contacto bacteriano con las células HT-29, lo que evita la necesidad de factores de adherencia y permite que las bacterias invadan rápidamente las células.
  6. Incubar placas de 6 pocillos a 37 °C con 5% de CO2 durante 45 min.
  7. Durante la incubación, determine el título de infección bacteriana.
    1. Preparar diluciones seriadas 10 veces de células Shigella resuspendidas (del paso 5.3.3) en PBS.
    2. Colocar 100 μL de las diluciones 1 x 10-5 y 1 x 10-6 en placas TSB + Congo rojo e incubar durante la noche a 37 °C.
      NOTA: El recubrimiento de 100 μL de las diluciones 1 x 10-5 y 1 x 10-6 corresponde a un factor de dilución final de 1 x 10-6 y 1 x 10-7, respectivamente.
  8. Lave bien las células HT-29 infectadas 3 veces con 1 ml de PBS.
    1. Aspire los medios de cada pocillo.
      NOTA: Al aspirar medios de placas de 6 pocillos, guíe la punta del aspirador a lo largo de la parte inferior de los pocillos, tratando de evitar el contacto con las celdas HT-29.
    2. Agregue 1 ml de PBS tibio a cada pocillo y lávelos suavemente.
      NOTA: Para lavar suavemente monocapas de 6 pocillos con PBS, mueva la placa hacia arriba y hacia abajo y de lado a lado sobre la mesa de trabajo. Lavar las placas con movimientos circulares y/o retirar la placa de la superficie de la mesa de trabajo puede provocar la eliminación mecánica de las células del plástico.
    3. Repita los pasos 5.8.1 y 5.8.2 2 veces más.
  9. Eliminar el PBS por aspiración, añadir 2 ml de DMEM tibio suplementado con 50 μg/ml de gentamicina a cada pocillo e incubar durante 30 min a 37 °C con 5% de CO2.
  10. Lave bien las células HT-29 infectadas 3 veces con 1 ml de PBS.
    1. Repita el paso de lavado 5.8.
  11. Eliminar el PBS por aspiración, añadir 2 ml de DMEM tibio suplementado con 50 μg/ml de gentamicina a cada pocillo e incubar durante 60 min a 37 °C con 5% de CO2.
  12. Lave bien las células HT-29 infectadas 3 veces con 1 ml de PBS.
    1. Repita el paso de lavado 5.8.
  13. Eliminar el PBS por aspiración y lisar las células HT-29 añadiendo 1 mL de PBS + 1% de Triton X-100 a cada pocillo.
  14. Incubar placas de 6 pocillos a 37 °C durante 5 min.
  15. Utilice un raspador de células o una punta de pipeta doblada para raspar las células lisadas del fondo del pocillo y transfiera 1 ml completo a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,7 ml.
  16. Determinar el número de bacterias intracelulares.
    1. Agitar cada tubo (a partir del paso 5.15) durante al menos 30 s para desplazar aún más a Shigella de las células eucariotas lisadas.
    2. Prepare diluciones seriadas 10 veces mayores de lisados en PBS.
    3. Colocar 100 μL de las diluciones 1 x 10-2 y 1 x 10-3 en placas TSB + Congo rojo e incubar durante la noche a 37 °C.
      NOTA: El recubrimiento de 100 μL de las diluciones 1 x 10-2 y 1 x 10-3 corresponde a un factor de dilución final de 1 x 10-3 y 1 x 10-4, respectivamente.

6. Ensayo de replicación intracelular

NOTA: Todos los volúmenes son consistentes con un ensayo que utiliza dos placas de 6 pocillos.

  1. Subcultivo durante la noche Cultivos de Shigella mediante dilución 1:50 en medios frescos.
    1. A continuación, agregue 100 μL de cada cultivo durante la noche a 5 mL de TSB fresco o TSB + BS en un tubo de cultivo de tamaño adecuado.
      NOTA: Limite el volumen de cultivo al <20% del volumen del matraz o tubo de cultivo para garantizar una aireación adecuada.
    2. Incubar a 37 °C con agitación a 250 rpm hasta que las células alcancen un OD600 de 0,7 (fase logarítmica media del crecimiento de Shigella ); alrededor de 2-2,5 h.
      NOTA: Durante el subcultivo, alícuota 50 mL de DMEM + 50 mg/mL de gentamicina y un volumen suficiente de PBS para todos los pasos de lavado y colóquelo en un baño de agua a 37 °C. Deje que el medio alcance los 37 °C antes de su uso.
  2. Transfiera 2 x 108 UFC subcultivadas Shigella a tubos de microcentrífuga individuales de 2 mL.
    NOTA: 2 x 108 UFC corresponde aproximadamente a 1 ml de células bacterianas con un diámetro exterior de600 de 0,7. Utilice lecturas de OD600 para aproximar UFC/ml de acuerdo con la calibración de cada espectrofotómetro individual.
  3. Lave las muestras de Shigella 1 vez con PBS.
    1. Células de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, luego agregar 1 mL de PBS tibio y resuspender bien el gránulo, pipeteando suavemente la muestra hacia arriba y hacia abajo hasta que la mezcla sea completamente homogénea (8-10x).
    2. Repita el paso 6.3.1. 1 vez más tiempo.
    3. Células de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos en 2 mL de DMEM tibio.
      NOTA: La concentración final de bacterias resuspendidas será de 1 x 108 UFC/mL.
  4. Vórtice, luego agregue 1 mL (1 x 108 UFC) de Shigella resuspendida más 1 mL de DMEM a cada pocillo de monocapas epiteliales colónicas HT-29 preparadas en placas de 6 pocillos (del paso 3.2.10.2).
    NOTA: Las infecciones se realizan normalmente con una multiplicidad de infecciones (MOI; proporción de células bacterianas y epiteliales) de 100. Para probar diferentes MOI, diluya Shigella resuspendida en DMEM a la concentración deseada, luego agregue 1 ml de bacterias diluidas a las monocapas HT-29. Por ejemplo, para probar un MOI de 10, diluya las bacterias 1:10 agregando 150 μl de bacterias 1 x 108 UFC/ml a 1,35 ml de DMEM, luego aplique 1 ml (1 x 107 UFC) a las células HT-29.
  5. Para promover el contacto bacteriano con las células HT-29, centrifugue las placas de 6 pocillos a 2.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente o 37 °C si se puede ajustar el ajuste de temperatura.
    NOTA: La centrifugación promueve el contacto bacteriano con las células HT-29, lo que evita la necesidad de factores de adherencia y permite que las bacterias invadan rápidamente las células.
  6. Incubar placas de 6 pocillos a 37 °C con 5% de CO2 durante 45 min.
  7. Durante la incubación, determine el título de infección bacteriana.
    1. Prepare diluciones seriadas 10 veces de células Shigella resuspendidas (del paso 6.3.3) en PBS.
    2. Colocar 100 μL de las diluciones 1 x 10-5 y 1 x 10-6 en placas TSB + Congo rojo e incubar durante la noche a 37 °C.
      NOTA: El recubrimiento de 100 μL de las diluciones 1 x 10-5 y 1 x 10-6 corresponde a un factor de dilución final de 1 x 10-6 y 1 x 10-7, respectivamente.
  8. Lave bien las células HT-29 infectadas 3 veces con 1 ml de PBS.
    1. Aspire los medios de cada pocillo.
      NOTA: Al aspirar medios de placas de 6 pocillos, guíe la punta del aspirador a lo largo de la parte inferior de los pocillos, tratando de evitar el contacto con las celdas HT-29.
    2. Agregue 1 ml de PBS tibio a cada pocillo y lávelos suavemente.
      NOTA: Para lavar suavemente monocapas de 6 pocillos con PBS, mueva la placa hacia arriba y hacia abajo y de lado a lado sobre la mesa de trabajo. Lavar las placas con movimientos circulares y/o retirar la placa de la superficie de la mesa de trabajo puede provocar la eliminación mecánica de las células del plástico.
    3. Repita los pasos 6.8.1 y 6.8.2 2 veces más.
  9. Eliminar el PBS por aspiración, añadir 2 ml de DMEM tibio suplementado con 50 μg/ml de gentamicina a cada pocillo e incubar durante 30 min a 37 °C con 5% de CO2.
  10. Lave bien las células HT-29 infectadas 3 veces con 1 ml de PBS.
    1. Repita el paso de lavado 6.8.
  11. Eliminar el PBS por aspiración, luego añadir 2 ml de DMEM tibio con 50 μg/ml de gentamicina a cada pocillo de las placas de 6 pocillos e incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante el tiempo deseado para permitir la replicación intracelular (hasta 24 h).
  12. Lave bien las células 2 veces con 1 ml de PBS.
    1. Repita el paso de lavado 6.8.
  13. Eliminar el PBS por aspiración y lisar las células HT-29 añadiendo 1 mL de PBS + 1% de Triton X-100 a cada pocillo.
  14. Incubar placas de 6 pocillos a 37 °C durante 5 min.
  15. Utilice un raspador de células o una punta de pipeta doblada para raspar las células lisadas del fondo del pocillo y transfiera el 1 ml completo a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,7 ml.
  16. Determinar el número de bacterias intracelulares.
    1. Agite cada tubo (a partir del paso 6.15) durante al menos 30 s para desplazar aún más Shigella de las células eucariotas lisadas.
    2. Prepare diluciones seriadas 10 veces mayores de lisados en PBS.
    3. Colocar 100 μL de las diluciones 1 x 10-2, 1 x 10-3 y 1 x 10-4 en placas TSB + Congo Red e incubar durante la noche a 37 °C.
      NOTA: El recubrimiento de 100 μL de las diluciones 1 x 10-2, 1 x 10-3 y 1 x 10-4 corresponde a un factor de dilución final de 1 x 10-3, 1 x 10-4 y 1 x 10-5, respectivamente.

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Representative Results

Se realizaron ensayos de adherencia, invasión y replicación intracelular comparando el tipo salvaje (WT) de S. flexneri 2457T con el ΔVF (ΔVF) de S. flexneri, un mutante que se supone que regula negativamente la virulencia de Shigella. Dado que Shigella utiliza sales biliares como señal para regular la virulencia 17,18,47, los experimentos se realizaron después de un subcultivo bacteriano en medios TSB, así como TSB suplementada con sales biliares al 0,4% (p/v) 18. La exposición a las sales biliares durante la etapa de subcultivo actúa como un pretratamiento para replicar el tránsito del intestino delgado antes de la infección colónica 17,18,47. En la Figura 1 se analiza el efecto de la mutación ΔVF sobre la capacidad de S. flexneri para adherirse a las células epiteliales colónicas HT-29. El porcentaje de adherencia se representa en el eje Y y representa la proporción de bacterias recuperadas después de la lisis HT-29 estandarizada con respecto al número de bacterias de entrada. Como era de esperar, tanto las cepas de S. flexneri WT como ΔVF tuvieron un aumento significativo en la adherencia cuando se subcultivaron con suplementación con sales biliares en comparación con TSB sin suplementación con sales biliares18. Sin embargo, no hubo diferencias en la adherencia a las células HT-29 entre las cepas mutantes WT y ΔVF dentro de cada condición de subcultivo. Estos datos indican que la mutación ΔVF no tiene ningún efecto sobre la capacidad de S. flexneri para adherirse a las células epiteliales HT-29 con o sin el tratamiento previo de las sales biliares.

En la Figura 2, se analizó el efecto de la mutación ΔVF sobre la capacidad de S. flexneri para invadir (Figura 2A) y replicarse (Figura 2B) dentro de las células epiteliales colónicas HT-29 con o sin sales biliares pre-tratamiento. El porcentaje de recuperación se representa en el eje Y y representa la proporción de células bacterianas recuperadas después de la lisis celular HT-29 estandarizada con respecto al número de bacterias de entrada. En la Figura 2A, se esperaba un aumento significativo en la capacidad de WT S. flexneri 2457T para invadir las células HT-29 después de la preexposición a las sales biliares48, mientras que el mutante S. flexneri ΔVF mostró un aumento menor en la invasión después de la preexposición a las sales biliares en comparación con la cepa WT. El mutante ΔVF tuvo mayores tasas de invasión de células HT-29 en comparación con el WT subcultivado en TSB, pero tuvo tasas de invasión similares a las de WT cuando se subcultivó en TSB suplementado con sales biliares (Figura 2A). Estos resultados sugieren que la mutación ΔVF mejora la capacidad de S. flexneri para invadir las células HT-29, lo que disminuye el efecto de las sales biliares antes de la exposición, a pesar de que la capacidad de invasión del mutante ΔVF aumentó aún más después del subcultivo de sales biliares.

En general, se recuperaron 10 veces más bacterias después de la incubación nocturna (Figura 2B) en comparación con la incubación de 90 minutos (Figura 2A), lo que demuestra las diferencias en el monitoreo del crecimiento intracelular frente a la invasión, respectivamente. Cuando las células HT-29 infectadas se incubaron durante 18 h para permitir la replicación intracelular de la bacteria (Figura 2B), el impacto del pretratamiento con sales biliares disminuyó tanto para las cepas WT como para ΔVF . Sin embargo, el efecto reducido del pretratamiento de las sales biliares durante la replicación intracelular fue más dramático para el mutante ΔVF . Dado que el aumento en la replicación intracelular de ambas cepas cuando se preexpusieron a las sales biliares fue menor que el aumento en las tasas de invasión en las mismas condiciones, planteamos la hipótesis de que las sales biliares tienen un mayor impacto en los primeros pasos en la patogénesis de S. flexneri . El mutante ΔVF mostró un aumento en el porcentaje de recuperación de la replicación nocturna dentro de las células HT-29 en comparación con WT (Figura 2B) después de ambas condiciones de subcultivo. Sin embargo, el porcentaje de recuperaciones del mutante ΔVF fue similar independientemente de las sales biliares antes de la exposición. Estas tendencias de datos sugieren que el mutante ΔVF se replica de manera más eficiente dentro de las células HT-29 en comparación con WT, y que la preexposición a las sales biliares no afecta la capacidad del mutante ΔVF para replicarse intracelularmente, como se observó para WT (Figura 2B). Dado que la diferencia entre las cepas mutantes y WT en la condición previa a la exposición a las sales biliares no se observó durante el ensayo de invasión de 90 minutos, planteamos la hipótesis de que el producto codificado por el gen VF delecionado también puede regular la replicación de S. flexneri dentro de las células HT-29. Combinados, ambos análisis demuestran que el mutante ΔVF es más virulento en relación con WT, lo que sugiere que el producto del gen VF es un regulador negativo de la virulencia de S. flexneri .

Figure 1
Figura 1: Adherencia inducida por sales biliares antes de la exposición de S. flexneri a las células HT-29. Las células mutantes WT y ΔVF de S. flexneri 2457T se subcultivaron en TSB o TSB suplementadas con medios de sales biliares (TSB+BS) al 0,4% (p/v). A continuación, las bacterias se aplicaron a las células HT-29 a una multiplicidad de infección (MOI) de 100 y se incubaron durante 3 h para examinar la adherencia. Después de la incubación, las células HT-29 infectadas se lavaron y lisaron, y se sembraron diluciones seriadas de bacterias recuperadas para enumerar las unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml). El número de bacterias adherentes se representa en relación con los títulos de bacterias de entrada para establecer el porcentaje de adherencia. Los datos son representativos de una réplica biológica con tres réplicas técnicas (puntos individuales). Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student (*p < 0,05; ***p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Las sales biliares antes de la exposición aumentaron la invasión de WT S. flexneri y la replicación intracelular. Las células mutantes WT y ΔVF de S. flexneri 2457T se subcultivaron en TSB o TSB suplementadas con medios de sales biliares (TSB+BS). A continuación, las bacterias se aplicaron a las células HT-29 a un MOI de 100, se centrifugaron en las células y se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 45 min. Las células se lavaron con PBS y las bacterias extracelulares se lisaron mediante la adición de gentamicina al DMEM para recuperar exclusivamente las bacterias intracelulares. Después de 90 min (A, invasión bacteriana) o 18 h (B, replicación intracelular), las células HT-29 infectadas se lavaron y lisaron, y se sembraron diluciones seriadas de bacterias recuperadas para enumerar las unidades formadoras de colonias por mL (UFC/mL). El número de bacterias intracelulares se representa en relación con los títulos de bacterias de entrada para establecer el porcentaje de recuperación. Los datos son representativos de una réplica biológica, cada una con tres réplicas técnicas (puntos individuales). Las barras de error indican SEM. La significación estadística se determinó mediante una prueba t de Student (*p < 0,05). Tenga en cuenta las diferencias en las escalas del eje Y entre los paneles (A) y (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe un conjunto de tres ensayos estandarizados para estudiar la adherencia a Shigella, la invasión y la replicación intracelular de las células epiteliales intestinales. Aunque estos métodos no son más que versiones modificadas de los ensayos clásicos de gentamicina utilizados para estudiar la invasión y replicación intracelular de diversos patógenos bacterianos dentro de las células huésped 49,50,51, se deben aplicar consideraciones especiales cuando se estudia Shigella.

Las Shigella son anaerobios facultativos, que crecen de manera óptima a 37 °C en medio rico con aireación43. Al realizar estos ensayos para interrogar los efectos de diferentes señales ambientales o metabolitos en las infecciones por Shigella, se recomienda cultivar Shigella en medios ricos durante la noche, luego subcultivar en medios definidos o complementados hasta la fase media del registro antes de la infección. La máxima expresión génica de virulencia ocurre durante la fase logarítmica del crecimiento52,53. Por lo tanto, el subcultivo de cultivos de Shigella durante la noche y permitir el crecimiento bacteriano a la fase exponencial (OD600 ~ 0,7) son pasos necesarios para evaluar adecuadamente la virulencia de Shigella. Además, la expresión génica de la virulencia depende de la temperatura. Para garantizar la especificidad de la expresión solo durante la infección del huésped, los genes de virulencia se inducen a temperaturas fisiológicas del huésped (37 °C) y se reprimen estrictamente a temperaturas más bajas (p. ej., 30 °C)54. Para garantizar la expresión de los genes de virulencia, el subcultivo bacteriano y las infecciones deben llevarse a cabo a 37 °C, con los cuidados adecuados para garantizar que la temperatura no descienda por debajo de los 37 °C. Un plásmido de virulencia grande de 220 kilobases, que codifica la maquinaria molecular necesaria para la invasión y la infección de las células epiteliales, es un determinante de virulencia esencial para todas las especies de Shigella 5. El paso repetido y el crecimiento prolongado a 37 °C promueven la inestabilidad de los plásmidos de virulencia, lo que resulta en la pérdida de plásmidos y hace que las células de Shigella sean avirulentas55. Para garantizar el mantenimiento del plásmido de virulencia y la expresión de genes de virulencia cruciales, se recomienda volver a rayar las bacterias directamente de las existencias del congelador cada dos semanas en placas indicadoras frescas de TSB + Congo rojo. El agar rojo Congo se puede utilizar para diferenciar entre colonias virulentas de tipo salvaje (rojo, CR+) y colonias avirulentas (blancas, CR-) que han perdido el plásmido de virulencia45. Si se observa repetidamente inestabilidad del plásmido de virulencia, los cultivos nocturnos de Shigella pueden incubarse a 30 °C para evitar la pérdida de plásmidos de virulencia, seguido de un subcultivo a 37 °C para promover la expresión génica de virulencia43. Por último, si se realizan análisis con cepas mutantes y/o complementarias, en las que hay marcadores antibióticos presentes en estas cepas bacterianas, se recomienda utilizar la selección antibiótica adecuada durante las etapas de pernoctación y subcultivo bacteriano.

El uso de monocapas epiteliales HT-29 tiene muchas ventajas para estudiar in vitro los mecanismos moleculares de la patogénesis de Shigella. Dado que Shigella es un patógeno adaptado al ser humano, los modelos de animales pequeños no reflejan con precisión la patogénesis característica de la shigelosis observada en los seres humanos36. Por lo tanto, el uso de protocolos estandarizados para la infección de líneas celulares derivadas de humanos permite la interrogación cuantitativa de los pasos individuales de la patogénesis bacteriana para caracterizar la interacción molecular entre este patógeno y su huésped nativo. Históricamente, las células HeLa se utilizaron predominantemente para estudiar las interacciones huésped-patógeno in vitro 25,56,57. Sin embargo, las células HeLa son una línea celular de cáncer de cuello uterino inmortalizada, que son células huésped no nativas de patógenos bacterianos entéricos. Por lo tanto, los estudios in vitro de la patogénesis entérica han cambiado al uso de líneas celulares de adenocarcinoma de colon (p. ej., HT-29, Caco-2 y T84), que recapitulan más fielmente la morfología epitelial intestinal y pueden cultivarse en transpocillos como monocapas epiteliales con superficies apicales y basolaterales diferenciadas 58,59,60. Aunque cada línea celular tiene sus fortalezas y debilidades individuales, las células HT-29 se utilizan en los ensayos descritos aquí debido a las similitudes fenotípicas con los enterocitos intestinales y la expresión robusta de los receptores de la superficie celular y las citocinas proinflamatorias 58,59,61. Sin embargo, cada uno de estos modelos discutidos son líneas celulares derivadas del cáncer con fenotipos metabólicos y de crecimiento aberrantes que no representan con precisión el estado fisiológico natural del epitelio colónico in vivo58. Los avances recientes en las técnicas de cultivo de tejidos humanos han permitido el cultivo de células madre intestinales humanas, obtenidas a partir de biopsias de tejidos, en organoides o monocapas celulares bidimensionales individuales que recapitulan los diversos tipos de células presentes en el tracto gastrointestinal (GI) humano 62,63,64. Los organoides intestinales se pueden diferenciar para incluir enterocitos, células caliciformes productoras de moco, células M y otros tipos de células específicas de tejidos. Estudios recientes han validado el uso de estos modelos organoides para el estudio de patógenos entéricos, incluyendo varios patógenos de Shigella spp., Salmonella enterica y Escherichia coli 62,63,64. Aunque los organoides son modelos más precisos del epitelio gastrointestinal humano e incluso pueden cultivarse en diversas condiciones de nutrientes para representar a la población mundial65, su complejidad relativa requiere una formación y conocimientos técnicos significativos, lo que se traduce en costes más elevados y tiempos de cultivo más largos en comparación con las líneas celulares cancerosas tradicionales58.

Este protocolo describe métodos de rendimiento medio, en los que se utilizan dos placas de 6 pocillos para un total de 12 monocapas disponibles para pruebas. Sin embargo, los experimentos se pueden escalar fácilmente para aumentar el número de monocapas sembradas con el fin de acomodar réplicas técnicas adicionales, o probar mutantes Shigella adicionales y señales ambientales. Las placas de cultivo de tejidos con más pocillos (p. ej., placas de 12 o 24 pocillos) también se pueden usar con los ajustes adecuados para tener en cuenta los pocillos con diámetros más pequeños. Bajo las condiciones de crecimiento de HT-29 descritas en el paso 3.2, los títulos de HT-29 son suficientes para sembrar alrededor de seis placas de 6 pocillos después del cultivo de un matraz T75, con suficientes células restantes para mantener el cultivo celular de HT-29. Además, la siembra de monocapas de HT-29 y la preparación de los pasos de inoculación de bacterias son idénticos entre los ensayos de adherencia bacteriana, invasión y replicación intracelular. Por lo tanto, los ensayos que prueban las mismas cepas de Shigella o las mismas condiciones de subcultivo se pueden realizar fácilmente en paralelo para examinar simultáneamente el papel de cada condición experimental en varios pasos de la infección por Shigella .

Los títulos de recuperación de las bacterias adherentes (paso 4), invadidas (paso 5) e intracelulares (paso 6) se determinan mediante la siembra de diluciones seriadas de células HT-29 infectadas después de la lisis, lo que permite una evaluación cuantitativa de la eficiencia de cada etapa de la infección por Shigella. Los pasos de centrifugación en los ensayos de invasión y replicación intracelular, basados en ensayos clásicos 49,50,51, promueven el contacto bacteriano con las células huésped para una invasión inmediata y mejoran las tasas de invasión. Así, la centrifugación "omite" el paso de adherencia, que más tarde se descubrió que era un aspecto importante de la infección por Shigella 17,18,19,66. Es esencial tener en cuenta que el paso de centrifugación no se puede realizar con células epiteliales polarizadas sembradas en pocillos trans. Sin embargo, para el ensayo de adherencia, la adherencia no es forzada por centrifugación, y no se agrega gentamicina a las células HT-29 infectadas antes de la lisis, lo que permite la enumeración de las células bacterianas adherentes. El volumen de los medios de cultivo de tejidos se reduce a 1 mL (en comparación con los 2 mL de los ensayos de invasión y replicación intracelular) para permitir un contacto más eficiente de las bacterias con las células HT-29. Además, dependiendo de la tasa de adherencia, puede ocurrir cierta invasión y replicación intracelular durante las 3 h de incubación, pero la cantidad suele ser insignificante (por ejemplo, solo el 0,05% de la población bacteriana recuperada después de la lisis de la célula huésped). Sin embargo, para tener en cuenta adecuadamente las bacterias adherentes frente a las intracelulares durante las 3 h de incubación, se recomienda realizar ensayos paralelos, en los que, además del protocolo establecido, se incuba una segunda placa con 50 μg/ml de gentamicina en 2 ml de DMEM por pocillo durante 45 min en total (15 min de incubación, lavado, DMEM fresco + gentamicina durante 30 min) para lisar completamente las bacterias extracelulares. Después de la lisis celular HT-29 como se indica en el protocolo, las bacterias intracelulares se pueden enumerar como se indicó anteriormente, y representarán el número de bacterias que invadieron. Este valor se puede restar de las bacterias enumeradas en la placa sin tratamiento con gentamicina para determinar adecuadamente las bacterias adherentes e invadidas. También se pueden realizar análisis paralelos para obtener más información sobre la replicación intracelular de Shigella dentro de las células HT-29 después de la invasión, por ejemplo, utilizando múltiples puntos de tiempo para realizar curvas de crecimiento intracelular. Finalmente, junto con la enumeración de bacterias intracelulares después de una incubación de gentamicina de 18 h, los sobrenadantes de cultivo se pueden recolectar y analizar para detectar la secreción de citocinas de células HT-29 infectadas. Por ejemplo, la IL-8 es una quimiocina secretada por las células epiteliales que funciona en gran medida para reclutar PMN en el sitio de la infección. La cantidad de IL-8 secretada en los medios de cultivo de células HT-29 infectadas puede analizarse con un ensayo ELISA de IL-867.

Las sales biliares han demostrado ser una señal de virulencia importante para Shigella durante el tránsito a través del sistema gastrointestinal humano, y se pueden usar para complementar los medios de crecimiento bacteriano en estos protocolos para replicar las condiciones gastrointestinales típicas. Naturalmente, las sales biliares se introducen en el duodeno o en la parte superior del intestino delgado para ayudar en la digestión; y en el íleon terminal o extremo del intestino delgado, el 95% de las sales biliares se eliminan y se reciclan de nuevo en circulación para su depósito final en la vesícula biliar68. Las sales biliares suelen tener una concentración entre el 0,2% y el 2,0% (p/v) en el intestino delgado y son bactericidas por naturaleza. Sin embargo, Shigella, junto con la mayoría de las bacterias entéricas, resiste las sales biliares y utiliza las señales para aumentar la infección47. Varios estudios han documentado cómo la exposición a las sales biliares, a veces junto con otras señales del intestino delgado como la glucosa, afecta la supervivencia de Shigella y la regulación de la virulencia antes de la infección. Se ha demostrado que Shigella resiste las sales biliares, altera la expresión génica y forma y dispersa una biopelícula en condiciones que reproducen el tránsito del intestino delgado17,69. Los estudios han demostrado que estos cambios dan lugar a un fenotipo hipervirulento, en el que la adherencia y la invasión son inducidas tras la posterior infección colónica por Shigella 17,18,19,48,66. Por lo tanto, las condiciones descritas anteriormente documentan cómo subcultivar Shigella en sales biliares para imitar el tránsito del intestino delgado antes de realizar los ensayos de adherencia, invasión o replicación intracelular. La formulación TSB especificada contiene glucosa añadida en relación con el caldo típico de Luria (LB)17. Por lo tanto, si se utiliza LB, es importante complementar también el medio con glucosa (0,5%-2,0% [p/v]) para considerar adecuadamente las señales de glucosa en el intestino delgado17. Además, como se mencionó anteriormente, todos los subcultivos de Shigella se lavan para eliminar las sales biliares e imitar la transición al colon para los análisis de infecciones.

Tradicionalmente, y como se destaca en los resultados anteriores (Figura 1 y Figura 2), los ensayos de infección son valiosos para determinar el papel de un gen particular en la infección por Shigella . Sin embargo, es posible que el fenotipo de varios mutantes no se aprecie realmente sin la suplementación adecuada de los medios de cultivo bacterianos. Como han demostrado investigaciones anteriores, las sales biliares alteran significativamente la expresión génica de S. flexneri , incluidos los genes del metabolismo central, los factores de transcripción, los transportadores de azúcar, la resistencia a los medicamentos y los genes de virulencia codificados en el cromosoma o en el plásmido de virulencia17. Estos genes proporcionan información sobre cómo Shigella utiliza las sales biliares como una señal para alterar la expresión génica y prepararse para una eventual infección del colon, por lo que los análisis mutacionales posteriores deben realizarse en los medios de crecimiento bacteriano suplementados apropiados antes de examinar los efectos sobre la virulencia en los ensayos de adherencia, invasión y replicación intracelular. Como se ha visto anteriormente en la Figura 1 y la Figura 2, la mutación ΔFV no afectó a la adherencia, pero sí a la invasión y a la replicación intracelular. Dado que la mutación mejoró la invasión y la replicación intracelular, actualmente se están llevando a cabo experimentos para determinar cómo el producto génico regula la infección. Los análisis de mutantes sirven como ejemplo de cómo se pueden estudiar nuevos conocimientos sobre la patogénesis de Shigella , especialmente en condiciones que replican mejor el tracto gastrointestinal humano. Se recomienda realizar análisis de complementación adecuados para validar los fenotipos de varios mutantes.

En combinación, estos procedimientos describen experimentos cuantitativos que proporcionarán información importante sobre los mecanismos moleculares de la adhesión, invasión y replicación de Shigella dentro de las células epiteliales colónicas HT-29 al imitar mejor el entorno natural del tracto gastrointestinal humano durante la infección. Los estudios futuros pueden ampliar los mutantes y las condiciones experimentales para obtener una mejor comprensión de cómo Shigella se prepara e infecta eficazmente a los huéspedes humanos. A pesar de décadas de investigación, todavía hay mucho más por descubrir sobre la infección por Shigella.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgments

El apoyo a los autores incluye el Departamento de Pediatría del Hospital General de Massachusetts, el premio 2022A009041 del Comité Ejecutivo de Financiación de Apoyo Provisional a la Investigación (ISF), la subvención del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas R21AI146405 y la subvención del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales del Centro de Investigación de la Obesidad y la Nutrición de Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PES filter Millipore-Sigma SCGP00525 Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes Corning 352059 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes Corning 430829 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates Corning 3516 Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts Sigma-Aldrich B8756 1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye Sigma-Aldrich C6277 A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283 To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 10569-010 DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135 Heat-inactivated, sterile
Gentamicin Sigma-Aldrich G3632 Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line ATCC HTB-38 Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film Bemis PM999 Laboratory sealing film
Petri dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 1x concentration; pH 7.4
Select agar Invitrogen 30391023 A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks Corning 430641U Tissue culture flasks
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stain Invitrogen T10282 A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB) Sigma-Aldrich T8907 Bacterial growth media

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