Summary
私たちは、思春期のC57BL/6マウスに対して、男性と女性の両方で機能し、個別の青年期の曝露を可能にする加速社会的敗北ストレスモデルを開発しました。このモデルへの曝露は社会的回避を誘発しますが、敗北した雄と雌のマウスのサブセットでのみ行われます。
Abstract
思春期の社会的逆境は蔓延しており、メンタルヘルスの軌道に悪影響を与える可能性があります。思春期の男性と女性のげっ歯類における社会的ストレスのモデル化は、進行中の脳の発達と行動結果への影響を理解するために必要です。慢性的な社会的敗北ストレスパラダイム(CSDS)は、成体の雄のげっ歯類がその領域に侵入する侵入者に対して示す攻撃的な行動を活用することにより、成体のC57BL/6雄マウスの社会的ストレスをモデル化するために広く使用されています。このパラダイムの利点は、敗北したマウスを、最後の敗北セッションの24時間後の社会的行動の個人差に基づいて、回復力のあるグループと感受性の高いグループに分類できることです。このモデルを青年期のC57BL/6マウスに実装することは、成体または青年期のマウスは通常、思春期初期の雄または雌のマウスを攻撃せず、思春期は寿命が短く、脆弱性の目立たない時間的ウィンドウを含むため、困難でした。この制限は、CSDSの加速バージョンを思春期の雄と雌のマウスに使用できるように適応させることで克服されました。この4日間のストレスパラダイムは、1日2回の物理的攻撃セッションを行い、C57BL/6のオスの成体を使用して、CD-1マウスの攻撃性を刺激し、オスまたはメスの思春期マウスを容易に攻撃します。このモデルは、思春期マウスの社会的敗北ストレスの加速化(AcSD)と呼ばれた。思春期のAcSDへの曝露は、オスとメスの両方で24時間後に社会的回避を誘発しますが、敗北したマウスのサブセットでのみ発生します。この脆弱性は、回復力のあるグループと影響を受けやすいグループ間のセッション間で攻撃の数が一貫しているにもかかわらず発生します。AcSDモデルは、思春期内の離散的な期間の曝露を可能にするのに十分短く、社会的回避行動の有無に応じてマウスを分離することができ、思春期のC57BL/6雌マウスの社会的敗北ストレスを研究するために利用可能な最初のモデルです。
Introduction
慢性的な社会的敗北ストレスパラダイムは、成人の出生後日(PND)>65人の雄のげっ歯類の社会的ストレスをモデル化するために広く使用されています。このパラダイムは、侵入者がその領域に侵入したときの成体のオスのげっ歯類の自然な攻撃的な行動に基づいています。このモデルは、ラット、ハムスター、およびマウス1,2,3,4,5,6,7,8,9を含むさまざまなげっ歯類の種で使用され、侵入者のげっ歯類が常駐のげっ歯類からの物理的な攻撃性の数分間を実験する約10日間続く心理的ストレスとの組み合わせで構成されています。2匹のげっ歯類は、感覚的な接触は可能にするが物理的な接触は許さない仕切りで区切られた、居住者の自宅のケージに留まる7。マウス実験において、最も一般的に使用される常駐/侵略者マウスは、引退したブリーダーであるSwiss CD-1マウスであり、侵入者マウスに対して堅牢な縄張り行動を示す6,7。侵入マウスの場合、最も特徴付けられた系統は近親交配C57BL/6株2,4,5です。敗北したネズミは、侵略者への慣れを防ぐために、毎日新しい侵略者にさらされます。対照マウスは、毎日異なる同種で飼育されています。最後の敗北セッションから24時間後に、実験マウスを社会的相互作用試験(SIT)で試験し、新規CD-1マウスの不在下(ターゲットなし)または新規CD-1マウスの存在下(ターゲット)でオープンフィールドを探索できます。対照マウスは、タスクの非ターゲット部分よりもターゲットとの相互作用ゾーンでより多くの時間を費やします。敗北したマウスは、社会的相互作用比(攻撃者がいる相互作用ゾーンで過ごした時間/攻撃者が不在の相互作用ゾーンで過ごした時間)に従って、感受性(比率<1)または回復性(比率>1)に分類されます。この手順は、ストレスに対する反応の個人差を研究するための便利なツールを提供します。
近年まで、慢性的な社会的敗北ストレスモデルは、主に成体の雄マウスで使用されてきたが、これは、強調された雄の支配階層が雄との戦いを含むが、雌との戦いを含んでいないためである6,7。さらに、オスのげっ歯類は通常、メスを攻撃しません。それどころか、彼らは交尾行動10に従事する。これらの障害にもかかわらず、成体の雌マウスの慢性的な社会的敗北ストレスパラダイムを適応させるために、さまざまな戦略が開発されてきました。例えば、カリフォルニアのネズミの社会的敗北モデルは、この一夫一婦制の種が自分の領土を守るときの両性からの自然な攻撃性に基づいている9,11。他のアプローチは、視床下部腹内側を刺激して一貫した攻撃的行動を持たせることによってCD-1マウスの攻撃的行動を誘発することに焦点を当てている10,12、または実験的な成体雌マウスに雄の尿を適用してCD-1攻撃者からの攻撃を受けることによって13。CD-1マウスのこの高まり、一貫した攻撃性は、実験的な侵入マウスが、相互作用の長さ中に攻撃者による反復的な攻撃に対する従属の明確な行動徴候を示すために重要である6。
慢性社会的敗北モデルの青年期C57BL/6マウスへの適応
思春期は、脳、特に前頭前野のミクロおよびマクロ構造の変化と並行して展開する、実質的な心理社会的成熟を特徴とする期間です。人間とげっ歯類の両方で、思春期の特定の開始と終了に関するコンセンサスはほとんどありません14,15。さらに、思春期には、進行中の脳と認知発達の経験誘発性の混乱に対して、脆弱性の重要な窓があります16,17,18,19。思春期と青年期は同時に発生しますが、これらの用語は同義語ではありません。思春期は性的成熟の始まりを意味し、思春期は、若年期から自立を達成するための段階的な移行を特徴とするより広範な段階を表している20。マウスの思春期は離乳期(PND 21)から成年期(PND 60)まで続くことが、さまざまなグループによって示唆されている21。特に、思春期初期は離乳後1週目と2週目(PND 21-34)、思春期中期はPND 35-48期間と呼ぶことができます。これらの範囲は、例えば、ドーパミン系の発達22,23,24、発達ニューロンネットワーク17,25,26,27に対する薬物の影響に対する脆弱性、および明確な行動特性16,20,28,29,30に関する個別の発達期間を包含する。で囲まれています。
常駐マウスからの戦闘行動は、社会的敗北プロトコルに必要です。しかし、雌マウスと同様に、雄は通常、思春期初期のマウスと攻撃的な相互作用をしません。これは、おそらく彼らが彼らを脅威として認識していないためです。青年期のC57BL/6マウスにおける慢性的な社会的敗北の影響を調査するほとんどの研究は、青年期中期に行われてきた31,32,33,34,35;また、思春期の曝露の出生後の日を指定しない者もいる 36,37、または敗北の日数を成人期初期に延長する 38 または感覚的接触を許さない39;思春期マウスに関する他の研究では、異なる系統40,41が使用されています。思春期の雄マウスにおける慢性的な社会的敗北ストレスを用いたこれらの研究の特徴を表1にまとめた。
私たちの研究グループは、C57BL/6マウスにおける特定の青年期の曝露ウィンドウ(青年期初期を含む)を標的にすることに関心を持っています。異なる思春期の期間が短いため、慢性的な社会的敗北ストレスパラダイムの加速版の修正版が設計されました42。このモデルは、思春期マウスの社会的敗北ストレスの加速化(AcSD)と呼ばれた。以前の研究は、ラット8,26,43,44,45の青年期の社会的ストレスに対する感受性、および人間のメンタルヘルスの軌跡に対する社会的ストレスの有害な影響46,47,48,49,50,51,52に有意な性差があることを示しています。 53,54,55,56.AcSDモデルは、思春期の雌マウスにも効果的に機能し、潜在的な性特異的な結果を調査したり、神経生物学的基盤を探求したりすることができます。
表1:思春期の雄マウスにおける社会的敗北ストレスパラダイムを用いた研究。 株と種:カリフォルニアマウス: Peromyscus californicus。 C57BL/6: Mus musculus black 6近交系マウス系統。C57BL/6J: M. musculus black 6 近交系マウスモデル by Jackson 研究室提供。CD-1:スイスの近交系アルビノマウス系統の M.musculus 。ICR: M. musculus Institute of Cancer Researchは、アルビノマウスの系統を近交系しました。OF1: M. musculus Oncins France 1の近交系アルビノマウス系統。
略語: wk = week;PND = 出生後の日;res = 弾力性;sus = 感受性;unsus = 影響を受けない。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Protocol
実験手順は、カナダ動物管理協議会のガイドラインに従って行われ、マギル大学およびダグラス病院動物管理委員会によって承認されました(動物実験承認番号:2005-5084)。すべてのマウスは、温度および湿度が制御された(21-22°C;60%)コロニールームに収容され、ダグラスメンタルヘルス大学研究所のニューロフェノタイピングセンターで12時間の明暗サイクル(8:00にライトオン)されました。マウスは、実験中、餌と水 を自由に利用できました 。マウスは各実験条件にランダムに割り当てられました。実験動物は市販の供給源から入手しました( 資料表を参照)。 表2 は、各実験段階における動物の特徴をまとめたものです。合計489匹の思春期のC57BL/6Jマウス(雄259匹、雌230匹)を20の実験コホートで使用しました。
表2:各実験段階の動物被験者。 †これらの動物が重傷を負わなければ、プライミングに再利用することができます。 ‡これらの動物が重傷を負わなければ、AcSDの 期間中、ダグラス精神保健大学研究所のニューロフェノタイピングセンターでのプライミングに再利用できます。 ¶男性の実験については、 #女性の実験では、敗北が混在している場合は、プライミングに女性を使用してください。 ††AcSDには使用しないでください。略語:AcSD =加速された社会的敗北ストレス。PND = 出生後の日 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
1. 順応
注:このフェーズは最低1週間続く必要があります。
- 生後4ヶ月以上経過し、青年期のC57BL/6Jマウスの2倍の量の雄CD-1引退ブリーダーマウス( 資料表参照)を購入します(すなわち、10匹のマウスがストレスにさらされる場合は、20匹のCD-1マウスを購入します)。
注:この量のCD-1マウスを取得することは、CD-1マウスのごく一部が思春期のマウスに対して攻撃的な行動を示すため、推奨されます。 - CD-1雄マウスを、スクリーニングとプライミングの1週間前に、自宅のケージ内の新しい施設に自由に餌 と水を与え て慣れさせます。
- スクリーニングおよびプライミングセッションには、PND >65(成人)およびPND 25 ± 3(青年)(表2)でC57BL/6を使用してください。プライミングの1日あたり各年齢の4匹のC57BL / 6匹のマウスを取得します(つまり、3日間のプライミングでは、12匹のPND>65および12匹のPND 25 ± 3)これらの動物はスクリーニングとプライミングプロセスに繰り返し使用されるため、怪我のリスクを減らします。
2. CD-1のスクリーニングとプライミング
注:このフェーズの期間は、3日間のスクリーニング(雌マウスの場合は1日)と3〜4日間のプライミング(これは雌マウスの場合、CD-1マウスの攻撃的な行動に応じて増加する可能性があります)です。
- 以下で説明するように、攻撃の運用定義を使用して CD-1 の攻撃を登録します。
- 1 つの攻撃は、CD-1 マウスが C57BL/6J マウスを噛み、C57BL/6J マウスが噛み付いて離れるときと定義されます。噛み合わせは、CD-1マウスがC57BL/6Jマウスの体の任意の部分に歯を置いたときと定義されます。離れる動きは、C57BL/6JマウスがCD-1がマウスを噛み合わせる前の位置から、マウスの両後足を動かすことと定義されます。
- 別々の攻撃間に少なくとも ~2 秒の差があることを確認します。2秒<間隔で複数のバイトが発生した場合は、1回の攻撃としてカウントします。
- CD-1マウスが途切れることなく(<~2秒間隔で)連続して複数回噛む場合は、プラスチック製の定規で動物を優しく分離します。CD-1マウスが噛んで離さない場合は、動物をそっと離してください。C57BL/6Jマウスが角に引っかかったり、CD-1マウスに押さえつけられて離れられなくなったりした場合は、定規で動物をそっと離してください。これらすべてを 1 つの攻撃として数えます (分離まで)。
- スクリーニング
- すべての動物の取り扱いにはニトリル検査用手袋を使用し、香水や香料の使用は避けてください。
- スクリーニングの1日目 は、CD-1マウスのホームケージに侵入者(PND >65)として成体C57BL/6雄マウスのみを使用して実施します。新しい実験の前には、必ずCD-1マウスをスクリーニングしてください。
- 成体のオスC57BL/6マウスPND >65をCD-1オスマウスのホームケージに3分間導入します。最初のアグレッションのレイテンシと、実行されたアグレッションの数を登録します ( 補足の表 1 を参照)。
- スクリーニングの 2日目 から最終日まで、成人男性の C57BL/6 PND>65 を 1 分間導入し (CD-1 が非常に攻撃的な場合は 30 秒に制限)、青年期の C57BL/6 PND 25 ± 3 と 5 分間交換します。
注:成体C57BL/6雄マウスを攻撃するすべてのマウスが青年期のC57BL/6を攻撃するわけではないため、思春期マウスでスクリーニングを行うことが重要です。実際、思春期マウスを攻撃するCD-1マウスは、必ずしも成体のC57BL/6オスを攻撃するわけではありません。 - 実験が雌マウスに対する攻撃性のためのものである場合は、実験マウスに両性が含まれていても、思春期の雌マウスでスクリーニングとプライミングを行います。
- 最初の攻撃の待ち時間、攻撃回数、およびすべてのC57BL/6マウスが受けた傷を登録します( 補足表2を参照)。
- 追いかける、マウンティング行動、匂いを嗅ぐ、グルーミング、噛むなど、あらゆる種類のインタラクションを登録します。CD-1が青年期のC57BL/6マウスに近づかない場合は登録してください。この動作が2日間繰り返される場合は、CD-1をプライミングに含めないでください。
- プライミング段階では、思春期のC57BL/6を追いかける、装着する、匂いを嗅ぐ、追いかける、グルーミングする、噛むなどの行動を示すすべてのCD-1マウスを選択します。
- 選択されていないCD-1マウスは保管し、社会的相互作用テスト(SIT)に使用します。
注:縄張り行動は時間とともに増加します。したがって、選択されなかったCD-1マウスは、次の実験で思春期マウスに対して攻撃的になる可能性があります。
- CD-1の積極的な動作のプライミング
- プライミング用に選択したCD-1マウスを、プライミングの最終日まで自宅のケージに保管します。
- 成体のオスのC57BL/6JマウスPND >65をCD-1ホームケージに30秒間導入し、その後、青年期のC57BL/6 PND 25 ± 3マウスと5分間交換します。
- 最初の攻撃のレイテンシ、攻撃の数、および任意のインタラクションを登録します( 補足の表3を参照)。
- 1日2回、3〜4日間、敗北が予定されているのと同じ時間(午前9:00と午後2:00)にプライミングを実行します。
注:すべてのCD-1マウスが最初の数日間に思春期のマウスを攻撃するわけではなく、特にプライミングが雌マウスに向けられている場合はなおさらです。プライミングの日数は、CD-1マウスが示す攻撃的な行動に応じて増減する可能性があります。 - プライミング日数を減らすには、オスマウスで以前に社会的敗北実験を行ったCD-1マウスを再利用します。CD-1マウスが攻撃性の増加を示さない場合は、基準に達するまでプライミングの日数を延長します。
- CD-1マウスが極端に攻撃的な行動を示す場合(C57BL/6マウスは過度の傷害を示す)、社会的敗北時の重傷を防ぐために、プライミングの日数を減らします。
- 実験の次のフェーズでは、思春期のマウスを少なくとも10回(雄)または5回(雌)2日間連続して攻撃するCD-1マウスを選択します。
3. AcSDプロトコル
注:このフェーズは、3日間の慣れと4日間のAcSDへの曝露で構成されています。
- 慣れ
- 社会的敗北のためにラットケージをセットアップします(図1A-F)。適切なアクリルガラスの仕切りを使用して、ラットケージを2つのコンパートメントに分割します(図1B、D;材料の表を参照)。
- ケージの両側に硬質ウッドチップの敷料を追加し、寝具材料として片面に綿の正方形を追加します(図1D)。ワイヤーの上部がバインダークリップで固定されていることを確認します(図1E)。ラットケージが保護綿のないカバー蓋で覆われていることを確認してください(図1F)。
- ケージの片側にケージごとにCD-1マウスを置きます。ケージの外側にタグを付けて、各マウスを簡単に識別できるようにします。
- 選択したCD-1マウスを、AcSDプロトコルの開始の2日または3日前に社会的敗北装置(図1F)に収容します(CD-1の縄張り行動を強化するため)。
- 実験の1日前にプライミングセッションを実施します。これは、攻撃性を一定に保つために重要です。
- 敗北セッション
- 1日2回(1回目:午前9時、2回目:午後2時)を4日間、計8回実施します。アグレッサーがセッションごとに異なるようにスケジュールを立てます( 補足表4 および 補足表5を参照)。
- C57BL/6思春期マウスをケージのCD-1側に導入する前に、体重を量ります。成体のオスのC57BL/6マウス>65を30秒間、敗北ケージのCD-1側に導入し、その後、思春期のC57BL/6 PND 24-28マウスと交換して、10分間の長い敗北エピソードまたはセッションごとに最大10回の攻撃を行います。
- 各攻撃の後、プラスチック製の定規で動物を分離します。敗北するたびに、怪我がないか確認し、痛み止めクリームで治療します。負傷者数を登録します。
- 思春期のC57BL / 6Jマウスを、見知らぬ攻撃者の隣の空きコンパートメントに次のセッションまで置きます。セッションごとに異なるアグレッサーで手順を繰り返します。
- 前のセッションでペアになっていない実験マウスとアグレッサーマウスでセッションを開始します。プライミングに使用した成体C57BL/6J雄マウスの損傷を監視します( 補足表6を参照)。
- 動物福祉と人道的なエンドポイントについては、以下の推奨事項に従ってください。
- 社会的敗北については、対応する機関審査委員会の標準的な運用手順に従い、常に獣医の評価を確保してください。
- 動物の苦しみや死を避けるために、研究全体を通してマウスの健康状態を監視します。
- 穴あき仕切りが、マウスが他のコンパートメントと交差しないように正しく設定されていることを確認します。
- 動物に傷がある場合は、適切なモニタリングのために獣医ケアスタッフに通知し、傷が完全に治癒するまで毎日鎮痛クリームを塗布してください。
- 怪我が悪化した場合(傷のサイズが大きくなる)は、次のセッションで攻撃を5回に制限して回復できるようにします。重傷がないか確認してください。重傷とは、合計1cm>の傷と定義されています。
- 動物をすぐに取り除いて安楽死させ、最初の体重から体重が15%〜20%減少します。自発運動の低下/減少および身だしなみ障害;1cm>の傷を持つマウス。陰茎の切断、または前肢の腫れを伴う噛み跡。
注:一次安楽死は、イソフルラン/CO2ガスチャンバーを介して行われ、その後、子宮頸部脱臼によって行われる二次安楽死が行われます。
- コントロールマウス
- 1日2回(1回目:午前9時、2回目:午後2時)を4日間、計8回実施します。コントロールマウスがセッションごとに異なるC57BL/6J同種とケージを共有するようにスケジュールを立てる( 補足表7 および 補足表8を参照)。
注:コントロールマウスは攻撃者にさらされません。新しいCD-1マウスの導入を模倣するために、すべての敗北セッションで、コントロールマウスは、セッションごとに新しい同性および同年齢の同種(非同腹児)とペアになります。 - 社会的敗北装置(図1)のコントロールマウスは、AcSDマウスとは別の部屋に収容します。
- ケージごとに2匹のコントロールマウスをケージの両側に1つずつ配置します。マウスをケージの別の側またはまったく別のケージに収容して、マウスが臭いを認識しないようにします。セッションごとにコントロールマウスを回転させます。
- 1日2回(1回目:午前9時、2回目:午後2時)を4日間、計8回実施します。コントロールマウスがセッションごとに異なるC57BL/6J同種とケージを共有するようにスケジュールを立てる( 補足表7 および 補足表8を参照)。
図1:思春期マウスの社会的敗北ストレス加速(AcSD)装置(A)左から、バー間の間隔が0.6cmの鋼線トップのペア、ミシン目径0.6cmの透明な穴あきポリカーボネート製仕切り、ワイヤートップを固定するためのバインダークリップ、カバー蓋付きの透明なラットケージ(綿保護層なし)。(B)上:成人の慢性的な社会的敗北に対するポリカーボネート製のディバイダー(左)と青年期のAcSDの比較(右)。下:思春期マウス用のポリカーボネート製仕切りに接近。(C)アップ:成人の慢性的な社会的敗北のスチールワイヤートップ(左)と青年期のAcSD(右)の比較。下:スチールワイヤートップのクローズアップ。(D-F)社会的敗北装置の組み立て。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. ソーシャルインタラクションテスト
- 前述したように、AcSDに続いてSITを実行します57,58,59。
- ACSD の最後のセッションの 24 時間後に SIT を実行します。午前9時から午後4時の間に、赤色光の条件(黄色の光の条件下ではない)でSITを実行します。
- メインの正方形のアリーナとオーバーヘッドビデオカメラをセットアップします( 資料の表を参照)。メインアリーナは、ソーシャルインタラクションゾーン(SIZ)、コーナー、センターの3つのエリアに分かれています。これらのエリアは、アリーナ内で黒い線でマークする必要があります(黒い油性マーカーを使用してください)。各領域について、次のディメンションと条件を使用します。
- SIZがエンクロージャーを囲む14 cm x 9 cmの正方形の領域であることを確認します。角は、囲いの反対側の壁の角にある小さな正方形の領域(9 cm x 9 cm)で、SIZから最も遠い点を表しています。中心はSIZとコーナーの間の領域です。
- アリーナとエンクロージャーを洗浄剤ペルオキシダーゼ溶液で洗浄します。
- 分析のために床に各動物の識別タグを配置します。オフライン分析のためにすべての動物の行動を記録します。
- ベースライン探索を決定する最初のセッション
- アリーナの壁の1つに空の金網の囲いを置きます。実験的な(敗北または制御された)思春期のC57BL/6マウスをアリーナの中央に置きます。アリーナを2.5分間自由に探索できるようにします。マウスを取り出します。
- アリーナとエンクロージャーを洗浄剤ペルオキシダーゼ溶液で洗浄します。
- ソーシャルインタラクションのためのセカンドセッション
- 見慣れないCD-1マウスを金網の筐体の中に入れます。エンクロージャーを前のセッションと同じ場所に置きます。
- 同じ思春期のC57BL/6マウスをアリーナに再導入します。アリーナを2.5分間自由に探索できるようにします。マウスを回収します。
- アリーナとエンクロージャーを洗浄剤ペルオキシダーゼ溶液で洗浄します。
- すべての青年期のC57BL/6マウス(ストレスを受けたマウスとコントロールマウス)について、このプロセスをカウンターバランスの順序で繰り返します。
- SITに複数のCD-1マウスを使用して、取り扱いのストレスとバイアスを減らします(たとえば、30匹のC57BL/6マウスのコホートの場合、4匹のCD-1マウスを使用します)。思春期のマウスの間でそれらを相殺します。
注:このテストは、Krishnan5 およびGolden7によって最初に記述されたように、社会的標的に対する実験マウスの接近および/または回避行動を測定する。
- 解析
- テストの両方のセッション中にインタラクションゾーンとコーナーで費やした時間を記録します。
- 社会的相互作用の比率は、CD-1攻撃者がいるインタラクションゾーンで過ごした時間を、CD-1攻撃者がいないインタラクションゾーンで過ごした時間を割った値として計算します。
- 比率が 1.00 のストレス マウスを感受性<、比率が 1.00 のマウスを回復性≥分類します。
- 最初のセッション中にアリーナを探索しない動物 (つまり、指定されたエリアのいずれかで 0 秒を費やした) をすべての分析から除外して、自発運動の違いを制御します。
- ≥4 の社会的敗北セッションで 0 回の攻撃を受けたすべての動物をすべての分析から除外して、非代表性の回復力のある動物を防ぎます。
- インタラクションゾーン内で少なくとも61秒を費やさないマウス(感受性ではない)を除外して、高い社会的相互作用比率がソーシャルターゲットへの実際の関心を反映するようにします。
- 外れ値の交互作用比スコアを持つマウスを除外します。
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Representative Results
慢性社会的敗北ストレスモデルを用いて、青年期のC57BL/6雄マウス(PND 21)を用いて、合計4つの異なる実験を行った。しかし、このモデルは、青年期初期のC57BL/6マウスでの使用には重要な制限がありました。
思春期のC57BL/6マウスに必要な機器の改造
最初の制限は、社会的敗北装置に使用された機器が成体マウス用に設計されていたことであった。その大きさから、PND 21の思春期のC57BL/6マウスは、仕切りの穿孔を通過してアグレッサー側に向かうことができた。これにより、感覚的な接触の期間が中断されました。さらに、思春期のマウスは、鋼線のトップのバーを通って逃げることができました。そこで、マウスの逃げ道を防ぐための改造を行いました(図1)。ミシン目の径を1.1cmから0.6cmに変更し(図1B)、鋼線の上部をバー間の間隔が1.1cmから0.6cmの間隔のものに変更しました(図1C)。さらに、上部はクリップで固定され、ラットケージも保護綿のないプラスチックカバーで覆われていました。ウッドチップの敷料も、思春期マウスに適したレベルに設定しました(図1D-F)。
AcSDモデルでは、一貫した攻撃的な発作を確保するために、成体のオスCD-1マウスのプライミングが必要です
2つ目の、そしてより重要な制限は、CD-1マウスの思春期マウスに対する身体的攻撃性に一貫性がないことであった。慢性的な社会的敗北セッションでは、攻撃性は10分間のセッションで攻撃的な攻撃がゼロだったことから、思春期のマウスのサイズが小さいために致命的となる1回または2回の噛みつきまでさまざまでした。しかし、CD-1マウスを複数の実験に用いると、攻撃回数の一貫性が増しました。
図2B は、各慢性社会的敗北実験コホート(P0、A0、A1、およびA2)の日ごとの攻撃数を示しています。日とコホート(図2B、反復測定の二元配置分散分析: F(27, 234) = 3.83, p < 0.0001)、日主効果(F(6.288, 163.5) = 6.2, p < 0.0001)、コホート主効果(F(3, 26) = 3.8, p = 0.02)との間に交互作用が認められた。事後検査では、1日目、2日目、3日目、7日目のコホート間での差が明らかになった(Holm-Sidakの事後検査:1日目、P0対A2、 p = 0.02;A1 対 A2、 p = 0.02;2日目、A1対A2、 p = 0.04;日、3 A0 vs. A1、 p = 0.007;A1 対 A2、 p = 0.04;7日目、A0対A1、 p = 0.04)。実験P0およびA0のすべてのCD-1マウスは、過去3日間で攻撃を停止しました。実験P0とA0に用いたCD-1マウスをA1に用いたところ、攻撃に一貫性が見られ(図2B)、CD-1は以前に物理的相互作用を受けると攻撃性が高かったことが示された。
このため、ステップ2.1および2.2で説明したように、CD-1マウスは、青年期のマウスに対する攻撃性について特異的にスクリーニングされ、青年期のC57BL/6マウスに対する攻撃性については、成体のC57BL/6オスでプライミングされた。さらに、AcSDを使用して、年齢をPND21からPND25に上げ、それでも早期の思春期を対象としました。
AcSDセッション中、CD-1マウスは、 図2Dに示すように、より一貫したパターンで思春期マウスに対する攻撃の数を増加させました。慢性的な社会的敗北パラダイムとは対照的に、セッションと実験コホートとの間に有意な相互作用は見られませんでした(図2D、二元配置反復測定ANOVA:F(35, 483) = 1.33, p = 0.1)、セッションの主効果(F(5.644, 389.5) = 14.15, p < 0.0001)、コホートの主効果(F(5, 69) = 7.91, p < 0.0001);Holm-Sidakの 事後 検定では、コホート間で有意差は認められなかった。コホート間の攻撃の平均を比較すると、この影響は主に攻撃の数が有意に多かったコホートA7によって引き起こされたことが明らかになりました(データは示されていません、一元配置分散分析 F(5, 69) = 7.911, p < 0.0001;Holm-Sidak 事後 検定: A3 対 A6、 p = 0.04;A7 対 A5、 p = 0.002;A7 対 A6、 p < 0.0001;A7 対 A8、 p = 0.0001)。
思春期マウスは、ナイーブ(プライミングされていない)CD-1マウスを用いて慢性的な社会的敗北プロトコル(図2E、ウェルチ補正による不対応t検定、 t =15.40、df=17.87、 p <0.0001)に曝露された思春期マウスよりも、AcSD中にプライミングされたCD-1マウスでより多くの攻撃を受けた。この攻撃は、慢性的な社会的敗北プロトコルの間、一貫しておらず、実際、いくつかの実験マウスは全く攻撃されませんでした。
図2:慢性社会的敗北ストレスとAcSDとの間の1日あたりの発作数の比較(A)慢性社会的敗北ストレスモデルのタイムライン。(B)思春期のC57BL/6雄マウスにおける慢性的な社会的敗北ストレス中の各実験コホート(P0、P1、A1、およびA2)の1日あたりの攻撃回数(双方向反復測定ANOVA)。(C)加速社会的敗北ストレス(AcSD)モデルのタイムライン。(D)思春期のC57BL / 6雄マウスのAcSD中の各実験コホート(A3-A8)の1日あたりの攻撃回数(双方向反復測定ANOVA)。(E)平均発作回数はAcSDの方が有意に高かった(ウェルチ補正による対応のないt検定、****p < 0.0001)。±略語:CSDS = 慢性的な社会的敗北ストレス;SIT = 社会的相互作用テスト;PND = 出生後の日;P0、A0-A8 = 各実験コホートのラベル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
AcSDセッション中の攻撃パターンは、24時間後の社会的表現型に影響を与えません
社会的敗北ストレス曝露後、ほとんどの思春期の雄マウスは、SITでテストしたときに社会的回避を示さなかった(図3B、慢性社会的敗北:一元配置分散分析F(2, 43) = 14.57、p < 0.0001)。F、AcSD: Kruskal-Wallis 検定、H(2) = 72.35、p < 0.0001)。どちらのモデルでも、社会的回避型マウスと非社会的回避型敗北マウスの間で攻撃回数に有意差はありませんでした(図3D、慢性的社会的敗北:双方向反復測定ANOVA、F(9, 252) = 4.07、p = 0.21)。H.AcSD: 二元配置反復測定 ANOVA、F(7, 511) = 1.32, p = 0.24)。しかし、回復力のあるマウスの割合は、AcSDばく露後のそれよりも慢性的な社会的敗北後に高かった(図3C,G、70%対55.26%、二項検定(片側)、p = 0.0047)。
図3:慢性的な社会的敗北ストレスとAcSDパラダイム後の社会的相互作用テスト(SIT)スコアの比較(A)慢性的な社会的敗北ストレスモデルのタイムライン。(B)青年期の慢性的な社会的敗北ストレス後のSITスコアの分布(一元配置分散分析)。(C)青年期の慢性的な社会的敗北ストレス後の回復力/感受性の割合。(D)慢性的な社会的敗北ストレス中に受けた表現型別の攻撃の数、回復力と感受性の間に有意差は見られませんでした(双方向反復測定ANOVA)。(E)加速社会的敗北ストレス(AcSD)モデルのタイムライン。(F)青年期のAcSD後のSITスコアの分布(Kruskal-Wallis)。この数値は57から修正されています。(G)青年期のAcSD後の回復力のある/感受性の割合。この数値は57から修正されています。(H)AcSD中に受けた表現型別の攻撃の数。レジリエント(回復力)と感受性(二元配置反復測定ANOVA)の間に違いはありません。この数値は59から修正されています。**p < 0.001、****p < 0.0001.すべてのデータは平均±SEMとして表示されます。略語:PND = 出生後の日;Con = コントロール;Res = 弾力性;Sus = 感受性。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
AcSDは、思春期のC57BL/6雌マウスに使用可能
PND 25 C57BL/6の雄マウスと雌マウスは生殖成熟に達していないため、プライミングされたCD-1マウスは、思春期の雄マウスに対して行ったのと同様に、思春期の雌マウスに対しても攻撃的な攻撃を示す可能性があります。ただし、プライミングフェーズは、一貫した数の攻撃に到達するために拡張する必要がありました(図4A)。 図4Bに示すように、実験間で日とコホートとの間に交互作用は見られませんでした(図4B、二元配置反復測定ANOVA: F(35,707) = 1.38、 p = 0.07)、セッションの主効果(F(6.286、634.9) = 16.1、 p < 0.0001)、コホートの主効果(F(5、101) = 11.34、 p < 0.0001;Holm-Sidak 事後 テスト: セッション 2 C4 対 C8、 p = 0.03;セッション 6 C7 対 C4、 p = 0.02;C7 対 C5、 p = 0.02;セッション 7 C8 対 C3、 p = 0.02;C8 vs C4, p = 0.045)。AcSDに曝露された思春期のC57BL/6雌マウスの大部分は、思春期の雄マウスと同様に、社会的回避に対して回復力がありました(図4C、Brown-ForsytheのANOVA: F(2,113.4) = 27.2、 p < 0.0001)。回復力のあるマウスと感受性マウスの間では、攻撃回数に有意差は認められなかった(図4E、二元配置反復測定ANOVA、セッション×表現型の相互作用: F(7, 714) = 0.73, p = 0.64、セッション F(6.375, 650.3) = 7.02, p < 0.0001, 表現型F(1, 102) = 0.4, p = 0.53の主効果なし)。
図4:思春期の雌マウスにおけるAcSD(A)実験のタイムライン。(B)AcSD中の実験による1日あたりの攻撃回数(双方向反復測定ANOVA)。(C)雌マウスの思春期のAcSD後のSITスコアの分布(Brown-ForsytheのANOVA)。(D)思春期のAcSD後の回復力/感受性の割合(右)。(E)AcSD中に受けた表現型別の攻撃の数。回復力のあるマウスと感受性マウスとの間に有意差は見られませんでした(二元配置反復測定ANOVA)。すべてのデータは平均±SEMで示されています。略語:SIT =社会的相互作用テスト;PND = 出生後の日;C3-C8 = 各実験コホートのラベル。Con = コントロール;Res = 弾力性;Sus = 感受性。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足表1:成人とのスクリーニング1日目のスコアリングシートテンプレート。 略語: CD-1 = スクリーニングされたCD-1マウスのID、Exp = 実験ID、3分 = C57BL/6成体マウスのスクリーニングセッションの期間、BL6 ID = スクリーニングに使用されたC57BL/6成体マウスのID、Lat 1 ADULTS = CD-1からC57BL/6成体マウスへの最初の攻撃の遅延、#攻撃性= CD-1によって実行された攻撃の数。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2: 成人と青年を対象としたスクリーニング用のスコアリングシートテンプレート。略語: Exp = 実験 ID、1 分 = C57BL/6 成体マウスのスクリーニング セッションの期間、BL6 ID = スクリーニングに使用した C57BL/6 成体マウスの ID、Lat 1 ADULTS = CD-1 から C57BL/6 成体マウスへの最初の攻撃の遅延、# 攻撃性 = CD-1 によって実行された攻撃の数、5 分 = C57BL/6 青年マウスのスクリーニング セッションの期間、 BL6 Ad = スクリーニングに使用したC57BL/6青年マウスのID、Lat 1 Adolescents = CD-1からC57BL/6青年マウスに対する最初の攻撃の待ち時間、CD-1 = スクリーニングしたCD-1マウスのID。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表3: プライミングフェーズのスコアリングシートテンプレート。略語: CD-1 = プライミングに使用した CD-1 マウスの ID、Exp = 実験 ID、30 秒 = C57BL/6 成体マウスのプライミング セッションの期間、BL6 ID = プライミングに使用した C57BL/6 成体マウスの ID、Lat 1 ADULTS = CD-1 から C57BL/6 成体マウスへの最初の攻撃の遅延、# aggressions = CD-1 によって実行された攻撃の数、 最小:3 =C57BL/6青年マウスのプライミングセッションの期間、BL6 Ad = プライミングに使用されたC57BL/6青年マウスのID、Lat 1青年=CD-1からC57BL/6青年マウスへの最初の攻撃の遅延、#mountings = C57BL/6青年マウスが受信したマウントの数。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表4: 社会的敗北スケジューリングのためのスコアリングシートテンプレート(20匹の思春期マウス)。略語:CD1 = CD-1マウスのID、E =実験、H =湿度、1st =セッション1、2nd =セッション2、BL6成体=プライミングに使用したC57BL/6成体マウスのID、重量=C57BL/6青年マウスの重量、#攻撃= CD-1によって実行された攻撃の数、#wounds = C57BL/6青年マウスが受けた傷の数。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表5: ソーシャル敗北スケジューリングの例。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表6: 成体C57BL/6雄マウスの傷害モニタリング用テンプレートです。略語: 1st - # wounds = セッション1でC57BL/6成体マウスが受けた傷の数、2nd - # wounds = セッション2でC57BL/6成体マウスが受けた傷の数、BL6 = プライミングに使用したC57BL/6成体マウスのID。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表7: 対照群スケジューリングテンプレート(10匹の思春期マウス)。スクランブルのルール:同じ同種のことを繰り返さないでください。マウスは、同じ日にボックスの同じ面を繰り返すことはできません。マウスは、自宅のケージとは異なるケージのマウスでスクランブルする必要があります。ホームケージには番号が付けられています。マウス番号は、ホームケージ番号に応じて与えられます。敗北グループとコントロールグループは、ホームケージからランダムに取り出されます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表8: コントロール・グループのスケジューリングの例。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
CD-1マウスにおける一貫した攻撃的な行動
スクリーニング段階では、CD-1が示すすべての行動(追いかける、装着する行動、匂いを嗅ぐ、グルーミング、噛む)に注意し、AcSD用のCD-1マウスを選択する際には、これらの記録を綿密に追跡することが非常に重要です。思春期マウスと相互作用するCD-1マウスは、それを攻撃することなく、プライミング中に思春期マウスに対して攻撃性を発達させる可能性があります。対照的に、成体マウスを攻撃するが、思春期マウスには近づかないCD-1マウスは、おそらく思春期マウスに対して攻撃性を発達させないでしょう。
CD-1プライミングフェーズは、思春期のマウスに対して攻撃的な行動を発達させることを可能にします。したがって、行動の正確なレジスタを持つことは、マウスの選択にとって重要です。さらに、CD-1マウスが以前に敗北を経験している場合でも、新しい実験の前には常にCD-1マウスをスクリーニングすることが不可欠です。一部のCD-1マウスは、一定期間自宅のケージに邪魔されずに放置すると、思春期のマウスの攻撃を停止でき、他のマウスは隔離されて飼育されているため、縄張り意識が増加する可能性があります。
CD-1マウスのプライミングには、プロトコルは3日間を推奨しています。ナイーブCD-1マウスを用いる場合、CD-1マウスが青年マウスを積極的に攻撃しなければ、プライミングを延長することができる。思春期マウスで社会的敗北を経験したCD-1マウスの場合、このプライミングフェーズの期間を短縮することができます。
スクリーニングとプライミングの段階は、AcSDセッションを成功させるために重要です。例えば、適切にプライミングされたCD-1マウスは、攻撃性の低いCD-1マウスよりも早く攻撃して10回の攻撃制限に達するため、短い敗北エピソードが可能になります。
AcSDでは、攻撃が非常に激しい場合(すなわち、CD-1マウスがC57BL/6Jマウスを離さない場合)に動物を分離することが重要です。そうしないと、思春期のマウスが負傷し、攻撃を制限する必要があります。感染を避けるためには、怪我の治療も非常に重要です。動物が軟膏をなめ取り、その過程で髪の毛を失い、怪我を露出させるため、怪我の治療に油性軟膏を使用しないことをお勧めします。
思春期のC57BL/6オスおよびメスマウスに使用するAcSDのトラブルシューティング
慢性的な社会的敗北ストレスモデルは、C57BL/6マウスの雄と雌の両方で、青年期初期に使用するための重要な制限を示しました。このセクションでは、青年期のAcSDモデルの開発のために行われた変更について説明します。
機器:機器の完全なリストは 、材料の表に記載されています。青年期初期のC57BL/6青年マウス(PND 21-30)は、実験室で以前に使用した装置60に対して小さすぎた。アクリルガラスの仕切りのミシン目の直径は、C57BL/6マウスがアグレッサーが存在するコンパートメントから他のコンパートメントに渡るのに十分な大きさです。これを防ぐために、小径のミシン目を持つアクリルガラスの仕切りが作られました。さらに、スチールワイヤーの上部は、マウスがケージから逃げるのを防ぐためにクリップで固定する必要がありました。使用されるカバー蓋は、通常、換気ケージに使用されます。この場合、これらのカバー蓋は、適切な換気を可能にし、マウスがケージから逃げるのを防ぐために、保護綿なしで使用されました。使用されるウッドチップ敷料の量は、思春期のマウスがフードとカバーの蓋に置かれたウォーターディスペンサーに到達できるようにする必要があることを考慮することが重要です。ただし、大量のウッドチップは濡れる可能性があります。
CD-1マウスの選択:慢性モデルでは、実験開始前にCD-1マウスの攻撃的な行動についてスクリーニングされます。CD-1マウスは、3日間のスクリーニング後に選択され、その攻撃的な行動が評価されます。スクリーニング後、攻撃の待ち時間が 30 秒未満で、一貫した攻撃を示す動物が次のフェーズに選択されます。しかし、慢性的な社会的敗北実験では、CD-1マウスは10日間にわたって一貫した数の攻撃を維持しませんでした(図2B)。したがって、侵入マウスに対する攻撃性の欠如のために、いくつかのCD-1マウスを実験から排除しなければなりませんでした。実際、侵入マウスを攻撃したCD-1マウスはごく一部であったが、これらのマウスの一部は非常に攻撃的であり、時には雄のC57BL/6 PND 21マウスに重傷を負わせることもあった。そこで、CD-1マウスのスクリーニングは、思春期マウスに対して攻撃的なマウスを選択するように変更され、身体的攻撃性が高まった。
身体的攻撃の一貫性:一貫した物理的攻撃は、侵入者6の迅速かつ強力な敗北を得ることにつながります。実験者と実験者との間の手順を標準化するために、攻撃の運用上の定義が使用され、攻撃性の正確な定量的測定を可能にした57。
プライミングの攻撃性:慢性的な社会的敗北実験中、攻撃の数は大きく異なり、実験の最後の数日間で減少しました(図2B)。思春期のC57BL/6雄マウスに対するCD-1マウスの攻撃的行動を増加させるために、CD-1マウスは、自宅のケージに導入されたマウスに関係なく、積極的に攻撃的になるように準備された。この挙動は、成体C57BL/6雄マウスを青年期マウスの1分間前に導入し、成体を回収した後、CD-1マウスが青年期マウスを攻撃するように促すことによって達成されました。
モデルの持続時間:PND 21の青年期のC57BL/6マウスは非常に小さく、CD-1マウスは1回の攻撃で重傷を負う可能性があります。したがって、思春期初期を対象とし、まだ社会的敗北のセッションが繰り返されているため、古典的な10日間の慢性的な社会的敗北ストレスに代わるモデルが選択されました。加速的社会的敗北ストレス(AcSD)42 は、1日2回の身体的攻撃のセッション、午前中に1回、午後に1回、合計4日間(8セッション)のセッションで構成されています。AcSDモデルでは、思春期マウスの年齢をPND 21からPND 25に増やすことができましたが、それでも思春期初期のみを対象としていました。
青年期におけるAcSDの限界
AcSDモデルにはいくつかの制限があります。成人の慢性的な社会的敗北モデルと比較して、AcSDは思春期のC57BL/6マウスの2倍の数のCD-1マウスのスクリーニングを必要とします。プライミングフェーズの期間は、CD-1マウスの攻撃的な行動によって異なります。そのため、AcSDのスケジュールは予想して計画する必要があり、これらすべての変数を考慮する必要があります。ほとんどの思春期マウスは、AcSD曝露後に社会的回避に対する回復力を示すため、感受性マウスの代表数を得るためには、実験コホートは少なくとも雄で20匹、雌で30匹の動物で構成する必要があります。
思春期マウスのAcSDは、実験コホート間で一貫した結果をもたらします
慢性的な社会的敗北とAcSDプロトコルの両方による社会的ストレスにさらされた後、ほとんどの思春期の雄マウスは社会的回避に対する回復力を示しました。しかし、慢性的な社会的敗北モデルでは、CD-1による攻撃回数の変動性を交絡変数として無視することはできなかった。対照的に、AcSD実験では、CD-1マウスは、セッション間で一貫した数の攻撃を得るために、各敗北セッションの前にプライミングされます(図2D、E)。全体として、AcSDに曝露されたマウスのすべての実験コホートは、セッション間で同様の数の攻撃を示しています(図2D)。しかし、これは慢性社会的敗北モデルに曝露されたマウスコホートには当てはまりません(図2B)。
成体C57BL/6雌マウスにおける慢性的な社会的敗北ストレスの使用は、他の種および系統9,13,45,61でこのモデルを使用する他のマウスと比較して困難であった。思春期のC57BL/6雌マウスでのAcSD実験では、プライミングフェーズを延長し、CD-1マウスの攻撃的な行動を確保しました(図4A)。ただし、女性の実験コホート間での攻撃回数にはばらつきが見られます(図4B)。それにもかかわらず、これらの実験では、すべてのCD-1マウスが雌に対して攻撃的な行動を示しました。攻撃の数を増やすために、オスのマウスによるプライミングを1分間に延長することができます。雄と同様に、思春期のC57BL/6雌マウスのうち、社会的回避に対して回復力のあるマウスの割合は、感受性を示すマウスよりも高かった(図4C、D)。さらに、攻撃回数は回復力のあるマウスと感受性の高いマウスの間で差がなかった(図4E)ことから、表現型が攻撃から独立していることが示されています。AcSDは、思春期のC57BL/6雌マウスに使用でき、同じCD-1マウスを使用して雌雄で同時に実験を行うことができます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、カナダ健康研究所(CF助成金番号:MOP-74709;PJT 190045)、国立薬物乱用研究所(CF助成金番号:R01DA037911)、カナダ自然科学工学研究評議会(CF助成金番号:2982226)。Andrea Pantoja-Urbanは、メキシコのThe National Council for Humanities, Science and Technologies/Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías(CONAHCYT)とFRQNT-留学生のためのメリット奨学金プログラム(PBEEE)の支援を受けました。サミュエル・リチャーは、マギル大学の神経科学統合プログラムからの奨学金によって支援されました。フィギュアのイラストは、BioRender.com のテンプレートを使用して作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 adolescent mice | In house breeding | Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute. | |
| C57BL/6 adult mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 027 | Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages. |
| C57BL/6J adolescent mice | Jackson Labs | Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664 | Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages. |
| CD-1 mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 022 | Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout. |
| Cleaning solution | Virox Animal Health | DIN 02537222 | Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer. |
| Clear perforated acrylic glass divider | Manufactured by Douglas Hospital, custom order | 0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice. | |
| Clear rectangular rat cages | Allentown | 24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h). | |
| Cotton squares for bedding | Inotiv Envigo | T.6060 iso-BLOX | 2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus. |
| Hard woodchip bedding | Inotiv Envigo | Teklad 7090, 7115 | Sani-chip bedding. |
| Large binder clips to secure the steel-wire tops | STAPLES | Item #: 132429, Model #: 24178-CA | 51 mm |
| Medium binder clips to secure the steel-wire tops | Item #: 132367, Model #: 24172-CA | 32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips | |
| Pain relief cream | Polysporin | Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride | |
| Paired Steel-wire tops | 24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill | ||
| Removable wire-mesh enclosure | Johnston industrial plastics | 11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate | |
| Social interaction open-field arena | PEXIGLAS | 45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas) | |
| Stopwatch | For timing defeat sessions | ||
| Video camera with infrared lights | Swann | SRDVR-44580V | Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853 |
| Video tracking software | Topscan | 2.0 Clever Systems Inc. |
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