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Bioengineering

在人类阴道芯片中模拟健康和生态失调的阴道微环境

Published: February 16, 2024 doi: 10.3791/66486
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Vascular Biology Program and Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School, 3Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences

Summary

本文介绍了一种用于创建微流体阴道芯片（Vagina Chip）培养装置的方案，该装置能够在微需氧条件下研究人类宿主与活体阴道微生物组的相互作用。该芯片可以用作研究阴道疾病的工具，以及开发和测试潜在的治疗对策。

Abstract

妇女的健康，特别是女性生殖道疾病（FRT）没有得到应有的重视，尽管不健康的生殖系统可能导致危及生命的疾病、不孕症或怀孕期间的不良后果。该领域的一个障碍是，缺乏忠实模仿FRT的生理学和病理生理学的临床前实验模型。 目前的 体外 和动物模型不能完全概括荷尔蒙变化、微需氧条件以及与阴道微生物组的相互作用。Organ-on-a-Chip（器官芯片）微流控培养技术的出现，可以模拟组织-组织界面、血管灌注、间质液流动以及人体器官主要亚基的物理微环境，有可能解决这个问题。最近，已经开发出一种人类阴道芯片，该芯片支持人类阴道微生物联盟与原代人类阴道上皮共培养，该联盟也与阴道基质接触并体验动态流体流动。该芯片复制了人类阴道对健康和生态失调微生物组的生理反应。本文描述了创建人类阴道芯片的详细协议。

Introduction

以乳酸杆菌属为主的阴道微生物组有助于维持酸性微环境，在维持女性生殖健康方面发挥着重要作用1.然而，有时构成微生物组的微生物群落的组成可能会发生变化，从而导致阴道细菌的多样性增加。这些菌群失调的变化通常导致从乳酸菌为主的状态转变为以更多样化的厌氧菌物种（例如阴道加德纳菌）为主的状态，与生殖系统的各种疾病有关，例如细菌性阴道病、萎缩性阴道炎、尿路感染、外阴阴道念珠菌病、尿道炎和绒毛膜羊膜炎 2,3,4,5 .这些疾病反过来又增加了女性患性传播疾病和盆腔炎的机会6,7,8,9。它们还对孕妇造成早产和流产的更高风险 10,11,12 并且还与不孕症有关 13,14,15,16。

尽管已经努力使用在静态二维 （2D） 培养系统中培养的阴道上皮细胞17,18 来模拟阴道生态失调，但它们并不能有效地模拟阴道微环境的生理学和复杂性19。动物模型也被用于研究阴道菌群失调;然而，它们的月经阶段和宿主-微生物组相互作用与人类有很大不同，因此，这些研究结果的生理相关性尚不清楚19,20,21。为了解决这些问题，人类阴道组织的类器官和Transwell插入模型也被用于研究FRT 19,22,23,24中的宿主-病原体相互作用。但是，由于这些是静态培养物，它们只能在短时间内（<16-24小时）支持人类细胞与活微生物的共培养，并且它们缺乏人类阴道微环境的许多其他潜在重要的物理特征，例如粘液产生和液体流动22。

器官芯片是三维 （3D） 微流体培养系统，其中包含一个或多个平行的空心微通道，这些微通道内衬有在动态流体流动下培养的活细胞。双通道芯片通过在分隔两个平行通道的多孔膜的相对两侧培养不同的细胞类型（例如，上皮细胞和基质成纤维细胞或上皮细胞和血管内皮细胞），从而实现器官级组织-组织界面的重建（图1）。两种组织都可以独立地暴露于流体流动中，并且它们还可以经历微需氧条件，以便与复杂的微生物组共培养 25,26,27,28。这种方法最近被用于开发一种人类阴道芯片，该芯片内衬由激素敏感的初级阴道上皮细胞与下面的基质成纤维细胞相界面，该芯片在上皮腔中维持低生理氧浓度，并允许与健康和生态失调的微生物组共同培养至少 3 天在体外29。研究表明，Vagina Chip 可用于研究最佳（健康）L. crispatus 联盟的定植，并检测由非最佳（非健康）含 G. vaginalis 联盟引起的炎症和损伤。在这里，我们详细描述了用于创建人类阴道芯片以及在芯片上建立健康和生态失调细菌群落的方法。

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Protocol

这项研究是按照使用人类细胞的机构指南进行的。这些细胞是通过商业方式获得的（参见 材料表）。所有步骤都应在生物安全柜 （BSC） 中无菌进行。对于此协议，仅使用过滤器（或屏障）移液器吸头。

1. 培养人阴道上皮细胞

  1. 将50mL阴道上皮培养基（VEM，参见 材料表）加热至37°C。
  2. 将 9 mL VEM 分装到 15 mL 试管中。然后，解冻一小瓶人阴道上皮细胞 （HVEC），并将其添加到含有 VEM 的试管中。
  3. 将 15 mL 管在室温 （RT） 下以 300 x g 离心 5 分钟并吸出上清液，留下沉淀。
  4. 轻轻地将沉淀重悬于 2 mL VEM 中，并将 1 mL 添加到含有 14 mL VEM 的两个 T75 烧瓶中。
  5. 将烧瓶在37°C与5%CO 2孵育。 每 2 天更换一次 VEM，直到 HVEC 大约 70% 汇合（约 5 天）。

2. 培养人子宫成纤维细胞

  1. 在双蒸水 （ddH2O） 中制备 10 mL 15 μg/mL 聚-L-赖氨酸溶液 （PLL）。向两个T75烧瓶中的每一个中加入5mL PLL溶液，并在37°C下孵育1小时。
  2. 将50mL成纤维细胞培养基（FM，参见 材料表）加热至37°C。
  3. 吸出 PLL 溶液并用 5 mL ddH2O 洗涤每个烧瓶。
  4. 将 9 mL FM 分装到 15 mL 试管中，解冻一小瓶人子宫成纤维细胞 （HUF）。
  5. 将 HIF 添加到含有 FM 的 15 mL 试管中。
  6. 在室温下以 300 x g 离心 15 mL 管 5 分钟并吸出上清液，留下细胞沉淀。
  7. 轻轻地将沉淀重悬于 2 mL FM 中，并将 1 mL 添加到含有 14 mL FM 的两个 T75 烧瓶中。
  8. 在37°C下用5%CO2 孵育烧瓶，直到细胞达到约70%汇合，同时每2天更换一次培养基。

3. 芯片活化和通道涂层

  1. 将芯片（商业获得，见 材料表）在真空干燥器中脱气30分钟。
  2. 让活化试剂 1 （AR-1） 和活化试剂 2 （AR-2）（参见 材料表）在室温下平衡 15 分钟，而不取下其包装。
  3. 用箔纸包裹 15 mL 锥形管以保护其避光。缓慢地将 1 mL AR-2 溶液加入 AR-1 小瓶的壁中，并充分混合。将混合物转移到铝箔包裹的 15 mL 管中。
  4. 以 1 mL 的增量重复向 AR-1 小瓶中加入 AR-2 溶液，直到 AR-1 粉末从小瓶中完全洗涤。
  5. 用 AR-2 溶液将 AR-1 复溶溶液加满至 10 mL。
  6. 将 200 μL 该溶液添加到每个芯片的顶端通道入口，同时从出口吸气（图 1A）。对基底通道重复上述步骤。加入溶液时，保持移液器垂直于芯片，以保持紧密密封和畅通无阻的流动。
  7. 对所有芯片重复步骤 3.6。
  8. 检查所有芯片是否有气泡。通过向受影响的通道中添加更多溶液来去除任何气泡。
  9. 从芯片表面吸出所有多余的 AR-1 溶液，同时避开通道入口和出口。
  10. 将芯片放入 150 mm 培养皿中，然后将此未覆盖的培养皿插入紫外线灯箱中。
  11. 将紫外线灯箱面向 BSC 的背面，并将芯片置于恒定的紫外线下 30 分钟。芯片中溶液的颜色会从深粉红色变为桃花心木。
  12. 通过向入口加入 200 μL AR-2 溶液来洗涤每个通道，同时从出口吸出。
  13. 通过向入口添加 200 μL 冷 DPBS （-/-） 洗涤每个通道两次，同时从出口吸出。
  14. 制备顶端通道包被（DMEM中的200μg/ mL胶原I和30μg/ mL胶原IV混合物）（参见 材料表）。保持在冰上。
  15. 制备基底通道包被（DMEM 中的 15 μg/mL PLL 和 200 μg/mL 胶原 I 混合物）。保持在冰上。
  16. 向基底通道入口添加 200 μL 基础通道包被。当涂层溶液出现在出口处时，用 P200 尖端塞住出口。分配溶液，直到入口和出口吸头体积相等，然后从移液器中释放移液器吸头，将吸头留在入口中。
  17. 同样，向顶端通道添加 200 μL 顶端通道涂层。
  18. 从芯片表面吸出多余的溶液。
  19. 检查所有芯片是否有气泡。通过向受影响的通道添加更多通道涂层来去除任何气泡。
  20. 将芯片在37°C的150mm培养皿中用5%CO2孵育过夜。

4. 带有HUFs的播种芯片基底通道

  1. 每天在显微镜下观察烧瓶中HUFs的生长。
  2. 一旦HUF培养物达到70%-90%汇合（接种后~3天），将25mL FM，5 mL Ca2+/Mg2+ 游离DPBS（DPBS（-/-），10mL胰蛋白酶/ EDTA和15mL胰蛋白酶中和溶液（TNS，参见 材料表）加热至37°C。
  3. 从烧瓶中吸出培养基。用 5 mL DPBS （-/-） 洗涤，然后再次吸出。
  4. 向每个烧瓶中加入4mL胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育3-5分钟，直至细胞分离。
  5. 向每个烧瓶中加入 6 mL TNS，并将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。
  6. 用移液管充分混合悬浮液，并取 10 μL 等分试样进行细胞计数。将 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝混合，并使用血细胞计数器计数。
  7. 在室温下以 300 x g 离心细胞悬浮液 5 分钟，吸出上清液并将沉淀重悬于温暖的 FM 中至终浓度为 7.5 x 105 个细胞/mL。
  8. 用 200 μL FM 洗涤基底通道。
  9. 将 15 mL VEM 加热至 37 °C。 用 200 μL VEM 洗涤顶端通道。
  10. 将 200 μL 完全 VEM 加入到顶端通道入口，同时用移液器吸头堵塞出口。分配培养基，直到入口和出口吸头体积相等，然后从移液器中释放移液器吸头，将吸头留在入口中。保持顶部通道在入口和出口处都充满并插入。
  11. 缓慢吸取 50 μL HUF 细胞悬浮液到基底通道入口，同时从出口吸出。当 ~2 μL 细胞悬浮液留在移液器吸头中时，从入口处取出移液器吸头，而不按压或释放移液器柱塞以避免形成气泡。用移液器吸头堵住入口和出口。
  12. 在显微镜下检查是否有气泡。如果存在，用 FM 清洗基底通道并重复步骤 4.11。
  13. 将堵塞的芯片倒置在15mL管架上，并在37°C下用5%CO2 孵育1小时。孵育后观察芯片并检查细胞是否附着。
  14. 用移液器吸头塞住基底通道的出口。向基底通道入口加入 200 μL FM，而不向下推移液器柱塞。从移液器中释放吸头，让培养基通过重力流通过通道自由流向出口移液器吸头。
  15. 将HUF接种的芯片在37°C与5%CO2孵育过夜。

5. 接种带有阴道上皮细胞的芯片顶端通道

  1. 将 50 mL VEM 加热至 37 °C。
  2. 制备顶端通道包被（DMEM 中 200 μg/mL 胶原 I）。保持在冰上。
  3. 用移液器吸头插入顶端通道出口。
  4. 向顶端通道入口添加 200 μL 顶端通道涂层。分配顶端涂层溶液，直到入口和出口吸头体积相等，然后从移液器中释放移液器吸头，将吸头留在入口中。
  5. 从芯片表面吸出多余的溶液。
  6. 将芯片在37°C与5%CO2 孵育1小时。
  7. 1小时后，通过向顶端通道入口加入200μL VEM洗涤顶端通道涂层，同时从出口吸出。
  8. 在显微镜下检查HVEC生长的~70%-90%汇合度。
  9. 如果细胞汇合率为 70%-90%，则每瓶将 6 mL 完全阴道上皮细胞培养基和 4 mL 胰蛋白酶/EDTA 加热至 37 °C。
  10. 从 HVEC 烧瓶中吸出培养基，用 5 mL DPBS （-/-） 洗涤，然后吸出。
  11. 向每个烧瓶中加入 4 mL 胰蛋白酶，并在 37 °C 下用 5% CO2 孵育 3-5 分钟，直至细胞分离。
  12. 向烧瓶中加入 6 mL VEM 以灭活胰蛋白酶，并将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。
  13. 用移液管充分混合悬浮液，并取 10 μL 等分试样进行细胞计数。将 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝混合，并使用血细胞计数器计数。
  14. 在室温下以300× g 离心细胞悬浮液5分钟，吸出上清液并将沉淀重悬于VEM中至终浓度为3.5-4百万个细胞/ mL。
  15. 将 25 mL FM 加热至 37 °C。
  16. 用移液器吸头插入顶端通道出口。缓慢吸取至少 40 μL HVEC 细胞悬液到顶端通道入口。分配细胞悬液，直到入口和出口吸头体积相等，然后从移液器中释放移液器吸头，将吸头留在入口中。保持基部通道充满 FM，并在入口和出口处都插上。
  17. 小心地吸出芯片表面的多余介质，并在显微镜下检查是否有气泡。如果存在，请重复步骤 5.16。
  18. 将芯片放入大培养皿中，并在37°C下用5%CO2 孵育过夜。
  19. 第二天，在显微镜下观察芯片的细胞附着。
  20. 从顶端和基底通道的入口和出口处取下移液器吸头。
  21. 用移液器吸头插入基底通道出口，并将 200 μL FM 加入基底通道入口，而不向下推移液器柱塞。从移液器中释放移液器吸头，让培养基通过重力流通过通道自由流向出口移液器吸头。
  22. 使用 VEM 对顶端通道重复步骤 5.21。
  23. 将双种子芯片在37°C下用5%CO2 孵育24小时。

6. 将芯片连接到豆荚并分化阴道上皮细胞

  1. 将 50 mL FM 和 VEM 分装到分离 50 mL 锥形管中，并加热至 37 °C。
  2. 将FM和VEM培养基在无菌真空下加热至37°C脱气5分钟。
  3. 对动态流量模块（DFM，请参阅 材料表）的托盘进行消毒和清洁。从包装中取出豆荚，然后将它们放入托盘中。
  4. 将 2 mL 脱气的 VEM 添加到顶端入口储液器（右上角储液器; 图1B）。沿储液罐壁添加培养基，以避免形成气泡。
  5. 将 3 mL 脱气 FM 添加到基础入口储液器（左上角储液器， 图 1B）。沿储液罐壁添加培养基，以避免形成气泡。
  6. 将 500 μL 脱气的 VEM 添加到顶端出口储液器中（右下角储液器， 图 1B）。倾斜豆荚，使介质覆盖储液罐的整个底面。
  7. 将 500 μL 脱气 FM 添加到基础出口储液器（左下角储液器， 图 1B）中。倾斜豆荚，使介质覆盖储液罐的整个底面。
  8. 将包含 Pod 的托盘滑入 DFM 并运行 Prime 循环两次。检查每个吊舱底部的端口是否有液滴流出。
  9. 如果在 4 个“Prime”循环后仍未形成液滴，则直接接触 pod 出口储液器内的端口（图 1B）并移取 200 μL 的相应培养基，以使培养基在储液罐和通道之间流动。这被称为“手动启动”。
  10. 从芯片中取出移液器吸头，并在每个芯片的所有端口上放置一滴相应的培养基。
  11. 将薯片滑入豆荚中，然后将豆荚放在托盘上。
  12. 吸出芯片表面上的任何介质，然后将每个托盘滑入 DFM。
  13. 在 DFM 上将以下参数设置为：顶部和底部 - 液体;顶端（顶部通道）流量 - 15 μL/h;基础（底部通道）流量 - 30 μL/h;拉伸 = 0%;频率 = 0 Hz。
  14. 在 DFM 上运行 调节 循环，并允许流量过夜。
  15. 24小时后，将顶端通道的流速设置更改为0μL / h，并将基底通道保持为30μL / h流速，再过24小时。
  16. 通过将 4 mM L-谷氨酰胺、20 mM 氢化可的松、1x ITES、20 nM 三碘甲状腺原氨酸、100 μM O-磷酰乙醇胺、180 μM 腺嘌呤、3.2 mM 氯化钙、2% 热灭活 FBS、1% Pen-链球菌和 120 mL 火腿 F-12 培养基添加到低葡萄糖 DMEM（参见 材料表）中来制备 500 mL 分化培养基 （DM），并过滤灭菌。
  17. 将 50 mL DM 加热至 37 °C。
  18. 将 20 μL 10 μM 雌二醇（参见 材料表）加入 50 mL DM 中，充分混合，并在无菌真空下脱气 5 分钟。
  19. 在水浴中将 50 mL VEM 加热至 37 °C，并在无菌真空下脱气 5 分钟。
  20. 从DFM中取出托盘，将它们放入BSC中，然后从舱中吸出培养基，避开储液罐中的端口（图1A）。然后，将 2 mL VEM 加入到顶通道入口储液槽中，将 3 mL DM 加入基底通道入口储液罐中。
  21. 将托盘返回到 DFM，并将顶端通道流量设置为 15 μL/h，将基础通道流量设置为 30 μL/h。
  22. 让DFM流动4-7小时。然后，通过将心尖通道流量设置为 0 μL/h 来停止其流动。让基础通道以 30 μL/h 的速度继续流动。
  23. 按照步骤 6.16-6.19 每 48 小时更换介质。
  24. 按照步骤6.20-6.21，每天在顶端通道间歇性地流动介质4-7小时，持续5天。
  25. 通过加入1.26mM氯化钙，0.49mM氯化镁六水合物，0.406mM硫酸镁，5.33mM氯化钾，137.93mM氯化钠，0.441mM磷酸二氢钾和5.55mM D-葡萄糖到dd H2O中，制备具有低缓冲能力的Hanks平衡盐溶液（参见 材料表）;pH值4.8。
  26. 通过将 4 mM L-谷氨酰胺、20 mM 氢化可的松、1x ITES、20 nM 三碘甲状腺原氨酸、100 μM O-磷酰乙醇胺、180 μM 腺嘌呤、3.2 mM 氯化钙、2% 热灭活 FBS 和 120 mL 火腿 F-12 培养基添加到低葡萄糖 DMEM 中来制备 500 mL 无链球菌 DM，并过滤灭菌。
  27. 在第 6 天，按照步骤 6.16-6.19 用 （HBSS （LB/G）） 替换顶端通道培养基，用无 Pen-Strep-DM 替换基础通道培养基。
  28. 在继续进行细菌接种之前，将DFM上的流量设置为15μL / h（顶端通道）和30μL / h（基底通道）24小时。

7.差异化芯片的细菌接种

注意：在符合微生物处理法规的实验室和平衡计分卡中执行以下步骤。

  1. 计算要包含在接种物中的每种细菌菌株的 CFU/mL。混合每种细菌菌株的所需量，总量高达 ~5 x 106 CFU/mL。
  2. 将混合物在4°C下以7,000× g 离心7分钟，并小心地除去上清液。将颗粒重悬于（HBSS（LB / + G））中。这将是细菌接种物。
  3. 从豆荚中分离芯片。用移液器吸头塞住基底通道的出口，并将 200 μL 无 Pen-Strep-DM 加入基底通道入口，而不向下推移液器柱塞。从移液器中释放移液器吸头，让培养基通过重力流通过通道自由流向出口。
  4. 将 37 μL 细菌接种物加入顶端通道入口，同时从出口吸出。当移液器吸头中剩余约 2 μL 时，将吸头拉出并用移液器吸头插入顶端通道入口和出口。
  5. 对于对照（未接种）芯片，用 37 μL （HBSS （LB/G）） 重复步骤 7.4。
  6. 吸出芯片表面上的任何介质。将芯片置于150mm培养皿中，并在37°C下用5%CO2 孵育24小时。
  7. 将豆荚（无切屑）放在托盘上，并将它们置于37°C的培养箱中，用5%CO2 放置24小时。
  8. 将 50 mL （HBSS （LB/+G）） 和 50 mL 无 Pen-链球菌 DM 加热至 37 °C。
  9. 将 20 μL 10 μM 雌二醇加入 50 mL 无 Pen-Strep-DM 中，充分混合，并在无菌真空下脱气 5 分钟。在真空下将（HBSS（LB / + G））脱气5分钟。
  10. 小心地吸出豆荚中的介质，同时避开储液罐入口和出口。
  11. 向顶端入口舱储液罐中加入 3 mL 脱气 （HBSS （LB/+G）），向顶端出口舱储液罐中加入 500 μL 脱气 （HBSS （LB/+G））。
  12. 将 3 mL 脱气的无 Pen-Strep DM 加入基底入口豆荚储液槽中，将 500 μL 脱气的无抗生素 DM 加入基底出口豆荚储液罐中。
  13. 将装有 pods（不带芯片）的托盘滑入 DFM 并运行 Prime 循环两次。检查是否有液滴从吊舱底部的每个端口流出。
    注意：如果在 4 个“Prime”循环后仍未形成液滴，请直接接触 pod 出口储液罐内的端口（图 1B）并移取 200 μL 相应的培养基，以使培养基在储液罐和通道之间流动。
  14. 从芯片中取出移液器吸头，并在所有通道入口和出口上放置一滴相应的介质。
  15. 将薯片滑入豆荚中，然后将豆荚放入托盘中。
  16. 吸出顶端和基部出口舱储液器中的介质以及芯片表面的任何介质。然后，将托盘滑入 DFM。
  17. 在 DFM 上设置以下参数：顶部和底部 - 液体;顶端（顶部）流量 - 40 μL/h;基础（底部）流速 - 40 μL/h;拉伸 - 0%;频率 - 0 Hz。运行 调节 循环。
  18. 4小时后停止流动并收集流出物，即顶端和基部出口储液罐中的介质。
  19. 测量和记录流出物量。
  20. 将芯片放回 DFM 中，并将顶端流速设置为 0 μL/h，基础流速设置为 30 μL/h。启动流以在夜间运行。
  21. 将收集的流出物分装用于各种计划的测定，并将它们储存在适当的温度下。
    注意：对于CFU测量，加入甘油至终浓度为16%，并立即储存在-80°C。
  22. 仅在基础出口储液罐中吸出培养基，并在 DFM 中将顶端和基础流速设置为 40 μL/h。开始流动 4 小时，然后重复步骤 7.18-7.21。这将是 48 小时的污水收集。
  23. 重复步骤7.22 72小时或直到实验结束。
  24. 在实验的终点，按照步骤7.18-7.19收集流出物。
  25. 通过在 TrypLE express 中加入 1 mg/mL 胶原酶 IV 来制备消化溶液。将10 mL消化溶液加热至37°C。
  26. 用移液器吸头塞住基底通道的出口。向基底通道中加入 100 μL 消化溶液。充分混合，并使用移液管将通道中的所有溶液收集到标记为“管 B”的管中。
  27. 用移液器吸头塞住顶端通道的出口。向顶端通道加入 100 μL 消化溶液。充分混合，并使用移液管将通道中的所有溶液收集到标记为“管 A”的管中。
  28. 将另外 100 μL 消化溶液添加到顶端和基底通道入口处，同时用移液器吸头堵塞出口。将芯片和管A和B在37°C孵育1-1.5小时。
  29. 使用已放置在入口和出口中的堵塞吸头在通道内充分混合消解内容物。分别收集到管 A 和 B 的顶端和基底通道的内容物。这些是芯片顶端和基底消化。
  30. 使用血细胞计数器对管 A 中的细胞进行计数。此外，按照步骤 7.21 从芯片消解中取出等分试样进行 CFU 测量。

8. 木屑流出物和消化物的分析

  1. 为了从流出物和消化物中计数细菌，在无菌DPBS（-/-）中连续稀释流出物或消化物，并在合适的培养基板上铺板，在37°C孵育24-48小时，并计数板上的菌落。
  2. 对于pH的测量，在收集后立即从72小时流出物中取出10μL，并使用pH条测量流出物的pH值。
  3. 对于细胞因子的分析，使用流出物使用基于 Luminex 的测定法、ELISA 或任何其他适用技术检测特定细胞因子29,30。

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Representative Results

人类阴道内衬有分层的上皮，该上皮覆盖着富含成纤维细胞的胶原基质。为了对此进行建模，通过在双通道微流控器官芯片装置内培养普通多孔膜相对两侧的原代人阴道上皮细胞和成纤维细胞来创建组织界面。使用明场显微成像监测阴道上皮的形成，该成像揭示了连续细胞片的形成，该细胞片逐渐形成多个细胞层（图2A）。先前的报告证实，当从横截面29 观察时，这种形态与完全分层的上皮细胞的发育相关。但是，如果上皮层看起来斑片状且不连续（图2B），则阴道芯片可能不适合在实验中使用。

图 3 显示了 Vagina Chip 生成的示意图。为了验证阴道芯片的功能性，这些芯片分别接种了 L. crispatus 和 G. vaginalis ，以模拟健康和生态失调的阴道环境。 G. vaginalis 是主要参与细菌性阴道病的细菌。为了检查健康和菌群失调的细菌是否植入阴道芯片上，通过在选择性细菌生长培养基上接种通道流出物和消化细胞层（De Man-Rogosa-Sharpe （MRS） 琼 脂和布鲁 氏菌血琼脂 （BBA） 用于 阴道凝胶）来量化接种不同细菌群体的阴道芯片中的细菌载量（参见 材料表），并将它们与使用原始接种物的类似培养物进行比较。在接种后 48 小时内检测到 L. crispatus 和 G. vaginalis 的菌落（图 2C），证实健康和生态失调细菌都移植在阴道芯片中。然而，如果在含有接种物的平板上观察到细菌菌落，但在所需的孵育后在含有流出物或消化物的平板上未观察到细菌菌落，则可以得出结论，细菌没有植入。

健康的阴道环境是酸性的，生态失调会导致阴道 pH值 31 升高。因此，还分析了Vagina Chip的顶上皮通道流出物的pH值。接种 L. crispatus 的阴道芯片的 pH 值与未接种的对照芯片的 pH 值相似，当与 G. vaginalis 共同培养时，它们的 pH 值显着升高（图 2D）。如果观察到未感染的阴道芯片的 pH 值高，则表明存在问题，这些芯片不应用于实验。

阴道组织的炎症状态对阴道微生物组的组成也很敏感，生态失调的微生物组会刺激炎症。在接种 L. crispatus 或 G. vaginalis 后 3 天分析阴道芯片顶端通道中的促炎细胞因子后，同样发现 G. vaginalis 的促炎反应高于未感染的 Chips 和接种 L. crispatus 的 Chips（图 2E）).综上所述，这些结果表明，阴道芯片在健康和生态失调状态下都非常模仿人体阴道微环境。

Figure 1
图 1：双通道芯片及其 pod。 （A） 描绘其通道和端口的双通道 PDMS 芯片图像。（B） 一个豆荚的图像，描绘了顶端和基部通道的水库和端口。（C） 示意图，显示感染微生物的阴道芯片的横截面图。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2：Vagina Chip 模拟健康和生态失调的人类阴道微环境。 （A） 坚固的阴道芯片顶端通道中的阴道上皮细胞。比例尺在顶部图像中表示芯片的 1 mm，在底部图像中表示 500 μm。（B） 阴道芯片不足的顶端通道中的阴道上皮细胞。比例尺在顶部图像中表示芯片的 1 mm，在底部图像中表示 500 μm。（C） L. crispatus （LC） 和 G. vaginalis （GV） 在阴道芯片中的植入。（D） 与未感染（对照）阴道芯片相比，与 L. crispatus （LC） 和 G. vaginalis （GV） 孵育 72 小时后阴道芯片的 pH 值。（E） 与未感染（对照）阴道芯片相比，阴道芯片在孵育 72 小时后对 L. crispatus （LC） 和 G. vaginalis （GV） 的促炎反应。（中美）图表描绘了 4-6 个芯片的平均 ± SD;*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001 与对照组相比 阴道芯片;每个 （●） 代表来自 1 个芯片的数据。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3：用于生成 Vagina Chip 的协议示意图。 接种细胞和生成阴道芯片所涉及的步骤的示意图。HVECs - 人阴道上皮细胞;HUFs - 人子宫成纤维细胞;VEM - 阴道上皮介质;FM - 成纤维细胞培养基;DM - 分化培养基;PS - 青霉素链霉素。 请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

过去人类阴道的体外模型不能忠实地复制阴道组织结构、液体流动和宿主-病原体相互作用19,22。动物模型还受到微生物组物种间变异以及发情或月经周期差异的限制19,22。这份手稿描述了一种协议，用于创建人类阴道的器官芯片模型，该模型可以有效地模仿人类对健康和生态失调微生物群落的反应。

该方案涉及将阴道上皮细胞和成纤维细胞接种在共享多孔膜的相对两侧，该多孔膜在市售的双通道器官芯片装置中分离平行微通道（参见 材料表）。多孔膜允许生长因子迁移和其他形式的细胞间通讯。然而，胶原涂层和细胞单层的存在阻止了通道之间的培养基混合。在顶通道中形成阴道上皮细胞单层后，分化因子被引入到流经基底通道的培养基中，该培养基穿过间质间隙，从而促进阴道上皮细胞的分化，形成分层的上皮细胞。接种时阴道上皮细胞的密度是分化阶段结束时阴道芯片健康状况的关键决定因素。因此，在开始分化之前应评估阴道上皮细胞的密度，在建立单层分化之前不应开始分化。可以继续暴露于分化因子，直到获得所需的阴道上皮细胞密度并且细菌接种之前。此外，应该注意的是，来自不同供体（或商业来源）的原代阴道上皮细胞的生长速率可能会有所不同，这可能会影响生成的阴道芯片的质量。在所有微流控器官芯片研究中，去除整个芯片培养过程中通道中可能形成的任何气泡至关重要，因为它们会干扰培养基流动，并最终导致营养物质可用性降低和细胞活力丧失。

该协议还描述了如何使用阴道芯片在芯片上建立细菌群落，这些细菌群落模仿健康的阴道状态或细菌性阴道病。阴道芯片也可用于研究其他阴道疾病或病症;然而，在进行这些研究时，应注意了解每种疾病的特征以及将结果与临床发现相关联的最佳方法。总之，人类阴道芯片为研究与FRT相关的大量疾病和病症开辟了新的途径，它可以成为研究潜在疗法的宝贵工具。

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Disclosures

Donald Ingber 是 Emulate 的创始人、董事会成员、科学顾问委员会主席和股权持有人。其他作者声明他们没有竞争利益。

Acknowledgments

这项研究得到了比尔和梅琳达·盖茨基金会（INV-035977）和哈佛大学Wyss生物启发工程研究所的资助。我们还要感谢 Wyss Institute 的 Gwenn E. Merry 编辑这份手稿。 图 1 中的图表是使用 BioRender 创建的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Steriflip Millipore  SCGP00525 To degas media
2 channel chip Emulate BRK-S1-WER-24 Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips) Thomas Scientific, SHARP 1159M40 Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)  Emulate Chip S1 Basic Research kit-24PK Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C  
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)  Emulate Chip S1 Basic Research kit-24PK Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine Sigma Aldrich  A2786 Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates VWR International Inc.  89405-032 with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-) ScienCell 303 For washing cells
Calcium Chloride Sigma Aldrich  C5670 Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)  Sigma Aldrich  499609 Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I  Corning 354236 For the coating solution for HVEC
Collagen IV  Sigma Aldrich  C7521 For the coating solution for HVEC
Collagenase IV Gibco 17104019 For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium  ScienCell 2301 Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium Lifeline LL-0068 Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)  Sigma Aldrich  158968 Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)  Thermofisher 12320-032 Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë) Emulate Zoë-CM1 Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12 Thermofisher 11765-054 Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS  Thermofisher  10438018 Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts ScienCell 7040 HUF
Human vaginal epithelial cells Lifeline FC-0083 HVEC
Hydrocortisone Sigma Aldrich  H0396 Component of the Differentiation media
ITES Lonza 17-839Z Component of the Differentiation media
L-glutamine Thermofisher 25030081 Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich  M2393 Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich  M1880 Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates VWR International Inc.  89407-214 For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine Sigma Aldrich  P0503 Component of the Differentiation media
Pen/Strep Thermofisher  15070063 Component of the Differentiation media
pH strips Fischer-Scientific 13-640-520 For measurement of pH 
Pods (1/chip)  Emulate BRK-S1-WER-24 Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine ScienCell 403 For the coating solution for HUFs
Potassium chloride  Sigma Aldrich  P3911 Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich  P0662 Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol  MP Biomedicals  113055034 For freezing bacterial samples
Triiodothyronine Sigma Aldrich   T6397 Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)  Sigma Aldrich  T8154 For counting live/dead cells
TrypLE Express Thermofisher  12605010 For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)  ScienCell 113 For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%) ScienCell 103 For cell dissociation 
β-estradiol  Sigma Aldrich  E2257 Hormone for differentiation media

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References

  1. Smith, S. B., Ravel, J. The vaginal microbiota, host defence and reproductive physiology. J Physiol. 595 (2), 451-463 (2017).
  2. Van De Wijgert, J., Jespers, V. The global health impact of vaginal dysbiosis. Res Microbiol. 168 (9-10), 859-864 (2017).
  3. Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: Cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
  4. Goldenberg, R. L., Hauth, J. C., Andrews, W. W. Intrauterine infection and preterm delivery. N Engl J Med. 342 (20), 1500-1507 (2000).
  5. Han, Y., Liu, Z., Chen, T. Role of vaginal microbiota dysbiosis in gynecological diseases and the potential interventions. Front Microbiol. 12, 643422 (2021).
  6. Leitich, H., Kiss, H. Asymptomatic bacterial vaginosis and intermediate flora as risk factors for adverse pregnancy outcome. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 21 (3), 375-390 (2007).
  7. Torcia, M. G. Interplay among vaginal microbiome, immune response and sexually transmitted viral infections. Int J Mol Sci. 20 (2), 266 (2019).
  8. Van Oostrum, N., De Sutter, P., Meys, J., Verstraelen, H. Risks associated with bacterial vaginosis in infertility patients: A systematic review and meta-analysis. Hum Reprod. 28 (7), 1809-1815 (2013).
  9. Lewis, F. M. T., Bernstein, K. T., Aral, S. O. Vaginal microbiome and its relationship to behavior, sexual health, and sexually transmitted diseases. Obstet Gynecol. 129 (4), 643-654 (2017).
  10. Hong, X., et al. The association between vaginal microbiota and female infertility: A systematic review and meta-analysis. Arch Gynecol Obstet. 302 (3), 569-578 (2020).
  11. Peelen, M. J., et al. The influence of the vaginal microbiota on preterm birth: A systematic review and recommendations for a minimum dataset for future research. Placenta. 79, 30-39 (2019).
  12. Smith, P. P., et al. Outcomes in prevention and management of miscarriage trials: A systematic review. BJOG. 126 (2), 176-189 (2019).
  13. Harp, D. F., Chowdhury, I. Trichomoniasis: Evaluation to execution. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 157 (1), 3-9 (2011).
  14. Pastorek, J. G., Cotch, M. F., Martin, D. H., Eschenbach, D. A. Clinical and microbiological correlates of vaginal trichomoniasis during pregnancy. The vaginal infections and prematurity study group. Clin Infect Dis. 23 (5), 1075-1080 (1996).
  15. Petrin, D., Delgaty, K., Bhatt, R., Garber, G. Clinical and microbiological aspects of trichomonas vaginalis. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 300-317 (1998).
  16. Edwards, T., Burke, P., Smalley, H., Hobbs, G. Trichomonas vaginalis: Clinical relevance, pathogenicity and diagnosis. Crit Rev Microbiol. 42 (3), 406-417 (2016).
  17. Eade, C. R., et al. Identification and characterization of bacterial vaginosis-associated pathogens using a comprehensive cervical-vaginal epithelial coculture assay. PLoS One. 7 (11), e50106 (2012).
  18. Fichorova, R. N., Yamamoto, H. S., Delaney, M. L., Onderdonk, A. B., Doncel, G. F. Novel vaginal microflora colonization model providing new insight into microbicide mechanism of action. mBio. 2 (6), e00168 (2011).
  19. Herbst-Kralovetz, M. M., Pyles, R. B., Ratner, A. J., Sycuro, L. K., Mitchell, C. New systems for studying intercellular interactions in bacterial vaginosis. J Infect Dis. 214, S6-S13 (2016).
  20. Johnson, A. P., et al. A study of the susceptibility of three species of primate to vaginal colonization with gardnerella vaginalis. Br J Exp Pathol. 65 (3), 389-396 (1984).
  21. Yildirim, S., et al. Primate vaginal microbiomes exhibit species specificity without universal lactobacillus dominance. ISME J. 8 (12), 2431-2444 (2014).
  22. Edwards, V. L., et al. Three-dimensional models of the cervicovaginal epithelia to study host-microbiome interactions and sexually transmitted infections. Pathog Dis. 80 (1), 026 (2022).
  23. Zhu, Y., et al. Ex vivo 2D and 3D HSV-2 infection model using human normal vaginal epithelial cells. Oncotarget. 8 (9), 15267-15282 (2017).
  24. Barrila, J., et al. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age. Infect Immun. 86 (11), e00282 (2018).
  25. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).
  26. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nat Biomed Eng. 3 (7), 520-531 (2019).
  27. Valiei, A., Aminian-Dehkordi, J., Mofrad, M. R. K. Gut-on-a-chip models for dissecting the gut microbiology and physiology. APL Bioeng. 7 (1), 011502 (2023).
  28. Izadifar, Z., et al. Mucus production, host-microbiome interactions, hormone sensitivity, and innate immune responses modeled in human endo- and ecto-cervix chips. bioRxiv. , (2023).
  29. Mahajan, G., et al. Vaginal microbiome-host interactions modeled in a human vagina-on-a-chip. Microbiome. 10 (1), 201 (2022).
  30. Masson, L., et al. Inflammatory cytokine biomarkers to identify women with asymptomatic sexually transmitted infections and bacterial vaginosis who are at high risk of HIV infection. Sex Transm Infect. 92 (3), 186-193 (2016).
  31. Amsel, R., et al. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med. 74 (1), 14-22 (1983).

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Gulati, A., Jorgenson, A., Junaid, A., Ingber, D. E. Modeling Healthy and Dysbiotic Vaginal Microenvironments in a Human Vagina-on-a-Chip. J. Vis. Exp. (204), e66486, doi:10.3791/66486 (2024).

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