Summary
この記事では、微好気性条件下でのヒト宿主と生きた膣マイクロバイオームとの相互作用の研究を可能にするマイクロ流体膣オンチップ(膣チップ)培養デバイスを作成するためのプロトコルについて説明します。このチップは、膣疾患を調査するためのツールとしてだけでなく、潜在的な治療対策を開発およびテストするためのツールとして使用できます。
Abstract
女性の健康、特に女性の生殖管(FRT)の疾患は、不健康な生殖器系が生命を脅かす病気、不妊症、または妊娠中の有害な結果につながる可能性があるにもかかわらず、彼女たちにふさわしい注意を払われていません。この分野の障壁の1つは、FRTの生理学と病態生理学を忠実に模倣する前臨床の実験モデルが不足していることです。組織間界面、血管灌流、間質液の流れ、およびヒト臓器の主要なサブユニットの物理的微小環境を模倣できるOrgan-on-a-Chip(Organ Chip)マイクロ流体培養技術の出現は、この問題の解決策として役立つ可能性があります。最近、ヒト膣微生物コンソーシアムと、膣間質とも接種され、動的な流体の流れを経験する一次ヒト膣上皮との共培養をサポートするヒト膣チップが開発されました。このチップは、健康で腸内細菌叢の異常性に対するヒト膣の生理学的反応を再現します。人間の膣チップを作成するための詳細なプロトコルは、この記事で説明されています。
Introduction
酸性微小環境の維持に役立つ乳酸桿菌属が優勢な膣内細菌叢は、女性のリプロダクティブヘルスの維持に重要な役割を果たしています1。ただし、マイクロバイオームを構成する微生物群集の構成が変化し、膣内細菌の多様性が増加する場合があります。これらの嚥下障害の変化は、乳酸桿菌が優勢な状態から、より多様な嫌気性細菌種(ガードネレラ膣など)が優勢な状態への切り替えをもたらすことが多く、細菌性膣炎、萎縮性膣炎、尿路感染症、外陰膣カンジダ症、尿道炎、絨毛膜羊膜炎などの生殖器系のさまざまな疾患に関連しています2,3,4,5 .これらの疾患は、次に、女性が性感染症や骨盤内炎症性疾患にかかる可能性を高めます6,7,8,9。また、妊婦の早産や流産のリスクも高く、10,11,12 不妊症にも関与しています 13,14,15,16。
静的な2次元(2D)培養系17,18で培養された膣上皮細胞を用いて膣内細菌叢異常をモデル化する努力がなされてきたが、それらは膣微小環境19の生理学および複雑さを効果的に模倣していない。動物モデルは、膣の嚥下障害の研究にも使用されています。しかし、それらの月経期と宿主とマイクロバイオームの相互作用はヒトのそれとは大きく異なるため、これらの研究の結果の生理学的関連性は不明のままです19,20,21。これらの問題に対処するために、ヒト膣組織のオルガノイドおよびトランズウェルインサートモデルも、FRTにおける宿主と病原体の相互作用を研究するために使用されています19,22,23,24。しかし、これらは静的培養であるため、ヒト細胞と生きた微生物との共培養を短時間(<16〜24時間)しかサポートできず、粘液産生や体液流など、ヒト膣微小環境の他の多くの潜在的に重要な物理的特徴が欠けています22。
臓器チップは、動的な流体流下で培養された生細胞によって裏打ちされた1つ以上の平行な中空マイクロチャネルを含む3次元(3D)マイクロ流体培養システムです。2チャンネルチップは、2つの平行なチャネルを分離する多孔質膜の反対側で異なる細胞タイプ(上皮と間質線維芽細胞、上皮と血管内皮など)を培養することにより、臓器レベルの組織間界面の再現を可能にします(図1)。両方の組織は独立して流体流にさらされることができ、複雑なマイクロバイオームとの共培養を可能にする微好気性条件を経験することもできます25,26,27,28。このアプローチは最近、ホルモン感受性の原発性膣上皮が下にある間質線維芽細胞とインターフェースで裏打ちされたヒト膣チップを開発するために活用され、上皮内腔の生理学的酸素濃度を低く維持し、in vitroで少なくとも3日間、健康な微生物叢と細菌叢の異なる微生物叢との共培養を可能にします29。Vagina Chipを使用して、最適な(健康な)L. crispatusコンソーシアムによるコロニー形成を研究し、コンソーシアムを含む最適でない(健康でない)G. vaginalisによって引き起こされる炎症と損傷を検出できることが実証されました。ここでは、ヒト膣チップの作成方法と、チップ上に健康で細菌叢異常の細菌群集を確立するために使用される方法について詳しく説明します。
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Protocol
この研究は、ヒト細胞の使用に関する機関のガイドラインに準拠して実施されました。細胞は商業的に入手した( 資料表参照)。すべてのステップは、バイオセーフティキャビネット(BSC)で無菌的に実行する必要があります。このプロトコルには、フィルター(またはバリア)ピペットチップのみを使用してください。
1. ヒト膣上皮細胞の培養
- 50 mLの ?? 上皮培地(VEM、 材料の表を参照)を37°Cに温めます。.
- 9 mLのVEMを15 mLチューブに分注します。.次に、ヒト膣上皮細胞(HVEC)のバイアルを解凍し、VEMを含むチューブに加えます。
- 15 mLチューブを300 x g で室温(RT)で5分間遠心分離し、上清を吸引してペレットを残します。
- ペレットを2 mLのVEMに穏やかに再懸濁し、14 mLのVEMを含む2つのT75フラスコのそれぞれに1 mLを加えます。
- フラスコを37°Cで5%CO2 とインキュベートします。HVECが約70%コンフルエントになるまで(約5日)2日ごとにVEMを交換します。
2. ヒト子宮線維芽細胞の培養
- 10 mLの15 μg/mLポリ-L-リジン溶液(PLL)を二重蒸留水(ddH2O)で調製します。2つのT75フラスコのそれぞれに5 mLのPLL溶液を加え、37°Cで1時間インキュベートします。
- 50 mLの線維芽細胞培地(FM、 材料の表を参照)を37°Cに温めます。
- PLL溶液を吸引し、各フラスコを5mLのddH2Oで洗浄します。
- 9mLのFMを15mLのチューブに分注し、ヒト子宮線維芽細胞(HUF)のバイアルを解凍します。
- FMを含む15mLチューブにHUFを追加します。
- 15 mLチューブを300 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を吸引して細胞ペレットを残します。
- ペレットを2mLのFMに穏やかに再懸濁し、14mLのFMを含む2つのT75フラスコのそれぞれに1mLを加えます。
- フラスコを5%CO2 で37°Cでインキュベートし、細胞が約70%コンフルエントになるまで、2日ごとに培地を交換します。
3.チップ活性化とチャネルコーティング
- チップ(市販品、 材料表参照)を真空デシケーターで30分間脱気します。
- 活性化試薬1(AR-1)および活性化試薬2( AR-2)(材料表を参照)を、パッケージを取り外さずに15分間室温まで平衡化させます。
- 15mLのコニカルチューブをホイルで包み、光から保護します。AR-2バイアルの壁にAR-2溶液1mLをゆっくりと加え、よく混ぜます。混合物をホイルで包んだ15mLチューブに移します。
- AR-1粉末がバイアルから完全に洗い流されるまで、AR-1バイアルにAR-1溶液を1mL刻みで繰り返し加えます。
- AR-1再構成溶液をAR-2溶液で10mLに補充します。
- この溶液を200μLを各チップのアピカルチャネル入口に加え、出口から吸引します(図1A)。基底チャネルについても繰り返します。溶液を添加している間、ピペットをチップに対して垂直に保ち、流れを妨げない密閉性を維持します。
- すべてのチップについて手順3.6を繰り返します。
- すべてのチップに気泡がないかチェックします。影響を受けるチャネルに溶液を追加して、気泡を取り除きます。
- チャネルの入口と出口を避けながら、チップ表面から余分なAR-1溶液をすべて吸引します。
- チップを150mmのシャーレに入れ、蓋をしていないシャーレをUVライトボックスに挿入します。
- UVライトボックスをBSCの背面に向け、チップを一定のUVライトの下に30分間置きます。チップの溶液の色は濃いピンクからマホガニーに変わります。
- 200 μLのAR-2溶液を入口に加え、同時に出口から吸引して、各チャネルを洗浄します。
- 200 μLの冷たいDPBS(-/-)を入口に加え、同時に出口から吸引して、各チャネルを2回洗浄します。
- 頂端チャネルコーティング(DMEM中の200 μg/mLコラーゲンIおよび30 μg/mLコラーゲンIV混合物)を調製します( 材料の表を参照)。氷の上を走り続けてください。
- 基礎チャネルコーティング(DMEM中の15 μg/mL PLLおよび200 μg/mLコラーゲンI混合物)を調製します。氷の上を走り続けてください。
- 基底チャネルインレットに200μLの基礎チャネルコーティングを加えます。コーティング液がコンセントに現れたら、P200チップでコンセントを差し込みます。入口と出口のチップ容量が等しくなるまで溶液を分注し、ピペットチップをピペットから離し、チップを入口に残します。
- 同様に、200μLのアピカルチャネルコーティングをアピカルチャネルに加えます。
- チップ表面から余分な溶液を吸引します。
- すべてのチップに気泡がないかチェックします。影響を受けるチャネルにチャネルコーティングを追加して、気泡を取り除きます。
- チップを150 mmのペトリ皿に入れ、37°Cで5%CO2で一晩インキュベートします。
4. HUFによるチップ基底チャネルの播種
- フラスコ内のHUFの成長を顕微鏡で毎日観察します。
- HUF培養物が70%〜90%コンフルエントになったら(プレーティング後~3日)、FM25 mL、Ca2 + / Mg2 + 遊離DPBS(DPBS(-/-)、トリプシン/ EDTA10 mL、およびトリプシン中和溶液15 mL(TNS、 材料の表を参照)を37°Cまで温めます。
- フラスコから培地を吸引します。5 mLのDPBS(-/-)で洗浄し、再度吸引します。.
- 各フラスコに4mLのトリプシン-EDTAを加え、細胞が剥離するまで37°Cで3〜5分間インキュベートします。
- 各フラスコに6 mLのTNSを加え、細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移します。
- 懸濁液をピペットでよく混合し、細胞計数のために10μLのアリコートを取ります。10 μLの細胞懸濁液を10 μLのトリパンブルーと混合し、血球計算盤を使用してカウントします。
- 細胞懸濁液を300 x g で室温で5分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを温かいFMに再懸濁して、最終濃度7.5 x 105 細胞/mLにします。
- 基礎チャネルを200μLのFMで洗浄します。
- VEM 15 mL を 37 °C に温めます。 200μLのVEMで頂端チャネルを洗浄します。
- 200 μLの完全VEMをアピカルチャネルインレットに加え、アウトレットをピペットチップで塞ぎます。入口と出口のチップ容量が等しくなるまで培地を分注し、ピペットチップをピペットから放し、チップを入口に残します。上部のチャネルをインレットとアウトレットの両方で満たし、差し込んだままにします。
- 50 μLのHUF細胞懸濁液を基底チャネル入口にゆっくりとピペットで移し、同時に出口から吸引します。気泡の形成を防ぐために、ピペットプランジャーを押したり放したりせずに、~2 μLの細胞懸濁液がピペットチップに残っている場合は、ピペットチップをインレットから取り外します。インレットとアウトレットをピペットチップで差し込みます。
- 顕微鏡で気泡を確認します。存在する場合は、基底チャネルをFMで洗浄し、手順4.11を繰り返します。
- 15 mLチューブラックでプラグを差し込んだチップを逆さまにし、5% CO2 で37°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後のチップを観察し、細胞の付着を確認します。
- 基底チャネルの出口をピペットチップで塞ぎます。ピペットプランジャーを押し下げずに、200μLのFMを基礎チャンネルインレットに追加します。チップをピペットから外し、媒体が重力流によってチャネルを通って出口ピペットチップに自由に流れるようにします。
- HUF播種チップを5%CO2で37°Cで一晩インキュベートします。
5.膣上皮細胞によるチップ頂端チャネルの播種
- VEM 50 mL を 37 °C に温めます。
- アピカルチャネルコーティング(DMEM中の200 μg/mLコラーゲンI)を調製します。氷の上を走り続けてください。
- 頂端チャネル出口をピペットチップで塞ぎます。
- 200 μLのアピカルチャネルコーティングをアピカルチャネルインレットに追加します。入口と出口のチップ容量が等しくなるまでアピカルコーティング溶液を分注し、ピペットチップをピペットから放し、チップを入口に残します。
- チップの表面から余分な溶液を吸引します。
- チップを37°Cで5%CO2 とともに1時間インキュベートします。
- 1時間後、出口から吸引しながら、200μLのVEMを頂端チャネル入口に添加して、頂端チャネルコーティングを洗浄します。
- HVECの増殖を顕微鏡で観察し、~70%-90%のコンフルエント度を確認します。
- 細胞が70%〜90%コンフルエントである場合は、フラスコあたり6 mLの完全膣上皮細胞培地と4 mLのトリプシン/ EDTAを37°Cに温めます。
- HVECフラスコから培地を吸引し、5mLのDPBS(-/-)で洗浄してから吸引します。
- 各フラスコに4mLのトリプシンを加え、細胞が剥離するまで5%CO2 で37°Cで3〜5分間インキュベートします。
- フラスコに6mLのVEMを加えてトリプシンを不活性化し、細胞懸濁液を15mLのコニカルチューブに移します。
- 懸濁液をピペットでよく混合し、細胞計数のために10μLのアリコートを取ります。10 μLの細胞懸濁液を10 μLのトリパンブルーと混合し、血球計算盤を使用してカウントします。
- 細胞懸濁液を300 x g で室温で5分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットをVEMに再懸濁して最終濃度350万〜400万細胞/mLにします。
- FM25mLを37°Cに温めます。
- 頂端チャネル出口をピペットチップで塞ぎます。少なくとも40 μLのHVEC細胞懸濁液を頂端チャネル入口にゆっくりとピペットで移します。入口と出口のチップ容量が等しくなるまで細胞懸濁液を分注し、ピペットチップをピペットから解放し、チップを入口に残します。基礎チャネルをFMで満たし、入口と出口の両方に差し込んだままにします。
- チップの表面に余分な培地を注意深く吸引し、顕微鏡で気泡がないか確認します。存在する場合は、手順5.16を繰り返します。
- チップを大きなシャーレに入れ、5%CO2 で37°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、細胞の付着について顕微鏡でチップを観察します。
- ピペットチップを、頂端チャネルと基底チャネルの両方の入口と出口から取り外します。
- 基礎チャネル出口をピペットチップで塞ぎ、ピペットプランジャーを押し下げずに200μLのFMを基礎チャネル入口に追加します。ピペットチップをピペットから外し、媒体が重力流によってチャネルを通って出口ピペットチップに自由に流れるようにします。
- VEMを使用して、頂端チャネルに対して手順5.21を繰り返します。
- デュアルシードチップを5%CO2 で37°Cで24時間インキュベートします。
6.チップをポッドに接続し、膣上皮細胞を分化させる
- 50 mLのFMとVEMを分注して50 mLのコニカルチューブを分離し、37°Cに温めます。
- FMおよびVEM培地を無菌真空下で37°Cに5分間温めて脱気します。
- ダイナミックフローモジュール(DFM、 材料表を参照)のトレイを消毒および清掃します。ポッドをパッケージから取り出し、トレイに入れます。
- 2mLの脱気VEMを頂端入口リザーバー(右上のリザーバー; 図1B)。気泡の形成を避けるために、貯水池の壁に沿って培地を追加します。
- 脱気したFMを3mLを基礎入口リザーバー(左上のリザーバー、 図1B)に加えます。気泡の形成を避けるために、貯水池の壁に沿って培地を追加します。
- 脱気したVEM500μLをアピカルアウトレットリザーバー(右下のリザーバー、 図1B)に加えます。培地が貯水池の底面全体を覆うようにポッドを傾けます。
- 脱気したFMを500μLを基礎出口リザーバー(左下のリザーバー、 図1B)に加えます。培地が貯水池の底面全体を覆うようにポッドを傾けます。
- ポッドが入ったトレイをDFMにスライドさせ、 プライム サイクルを2回実行します。各ポッドの下側にあるポートからドロップレットが出ていないか確認します。
- 4回の「Prime」サイクル後に液滴が形成されない場合は、ポッドの出口リザーバー内のポート(図1B)に直接接触させ、それぞれの培地の200μLをピペットで動かして、培地がリザーバーとチャネルの間を流れるようにします。これを「ハンドプライミング」といいます。
- チップからピペットチップを取り外し、各チップのすべてのポートにそれぞれの培地の液滴を置きます。
- チップをポッドにスライドさせ、ポッドをトレイに置きます。
- チップの表面にあるメディアを吸引し、各トレイをDFMにスライドさせます。
- DFMで次のパラメータを次のように設定します:上と下 - 液体;アピカル(トップチャネル)流量- 15μL/h;基礎(ボトムチャネル) フロー-30μL/h;ストレッチ = 0%;周波数 = 0 Hz。
- DFMで 調整 サイクルを実行し、一晩流れます。
- 24時間後、頂端チャネルの流量設定を0μL/hに変更し、基底チャネルの流量を30μL/hの流量でさらに24時間維持します。
- 4 mM L-グルタミン、20 mMヒドロコルチゾン、1x ITES、20 nMトリヨードチロニン、100 μM O-ホスホリルエタノールアミン、180 μMアデニン、3.2 mM塩化カルシウム、2%熱不活化FBS、1%ペンストレプス、および120 mLのハムF-12培地を低グルコースDMEM( 材料の表を参照)に加えて、500 mLの分化培地(DM)を調製し、フィルター滅菌します。
- DM 50 mL を 37 °C に温めます。
- 50 mLのDMに20 μLの10 μMエストラジオール( 材料表を参照)を加え、よく混合し、滅菌真空下で5分間脱気します。
- VEM 50 mL をウォーターバスで 37 °C に温め、滅菌真空下で 5 分間脱気します。
- トレイをDFMから取り外し、BSCに入れ、ポッドから媒体を吸引して、リザーバーのポートを避けます(図1A)。次に、2 mLのVEMを頂端チャネルインレットリザーバーに、3 mLのDMを基底チャネルインレットリザーバーに加えます。
- トレイをDFMに戻し、アピカルチャネルフローを15μL/hに、基底チャネルフローを30μL/hに設定します。
- DFMを4〜7時間流します。次に、頂端チャネルの流れを0μL / hに設定して停止します。基礎チャネルの流れを30μL/hで継続させます。
- 48時間ごとに、手順6.16〜6.19に従ってメディアを交換します。
- ステップ6.20〜6.21に従って、毎日4〜7時間、さらに5日間、頂端チャネルに断続的に培地を流します。
- 1.26 mM塩化カルシウム、0.49 mM塩化マグネシウム六水和物、0.406 mM硫酸マグネシウム、5.33 mM塩化カリウム、137.93 mM塩化ナトリウム、0.441 mMリン酸カリウム一塩基性、および5.55 mM D-グルコースをdd H2Oに添加することにより、グルコース(HBSS(LB / + G))培地で緩衝能の低いハンクス平衡塩溶液を調製します( 材料の表を参照)。pH 4.8。
- 4 mM L-グルタミン、20 mMヒドロコルチゾン、1x ITES、20 nMトリヨードチロニン、100 μM O-ホスホリルエタノールアミン、180 μMアデニン、3.2 mM塩化カルシウム、2%熱不活化FBS、および120 mLのハムF-12培地を低グルコースDMEMに添加して、ペン連鎖球菌を含まないDMを500 mL調製し、フィルター滅菌します。
- 6日目に、頂端チャネル培地を(HBSS(LB / + G))に交換し、基底チャネル培地をPen連鎖球菌を含まないDMに交換します 手順6.16-6.19。
- DFMの流量を、頂端チャネルの場合は15μL/h、基底チャネルの場合は30μL/hに24時間設定してから、細菌接種を進めます。
7. 分化チップの細菌接種
注意: 微生物の取り扱いに関する規制に準拠しているラボおよびBSCで次の手順を実行してください。
- 接種に含める各細菌株のCFU/mLを計算します。各細菌株の必要量を混合して、合計で最大 ~5 x 106 CFU/mL にします。
- 混合物を7,000 x g で4°Cで7分間遠心分離し、上清を慎重に除去します。ペレットを(HBSS(LB / + G))に再懸濁します。.これが細菌接種物になります。
- チップをポッドから取り外します。基底チャネルの出口をピペットチップで塞ぎ、ピペットプランジャーを押し下げずに、200 μLのPen連鎖球菌を含まないDMを基底チャネル入口に加えます。ピペットチップをピペットから外し、媒体が重力流によってチャネルを通って出口に自由に流れるようにします。
- 37 μLの細菌接種物を、出口から吸引しながら、頂端チャネル入口に加えます。ピペットチップに約2μLが残ったら、チップを引き出し、アピカルチャンネルの入口と出口をピペットチップで塞ぎます。
- コントロール(接種されていない)チップについては、37μLの(HBSS(LB / + G))で手順7.4を繰り返します。
- チップの表面にあるメディアを吸引します。チップを150 mmのシャーレに入れ、5%CO2 で37°Cで24時間インキュベートします。
- ポッド(チップなし)をトレイに置き、5%CO2 で37°Cのインキュベーターに24時間置きます。
- 50 mL(HBSS(LB / + G))および50 mLのペン連鎖球菌を含まないDMを37°Cに温めます。.
- 20 μLの10 μMエストラジオールを50 mLのPen-StrepフリーDMに加え、よく混合し、滅菌真空下で5分間脱気します。(HBSS(LB / + G))を真空下で5分間脱気します。
- リザーバーの入口と出口のポートを避けながら、ポッド内のメディアを注意深く吸引します。
- 3 mLの脱気(HBSS(LB / + G))を頂端入口ポッドリザーバーに加え、500 μLの脱気(HBSS(LB / + G))を頂端出口ポッドリザーバーに加えます。
- 3 mLの脱気ペン連鎖球菌フリーDMを基底インレットポッドリザーバーに、500 μLの脱気抗生物質フリーDMを基底アウトレットポッドリザーバーに加えます。
- ポッド(チップなし)が入ったトレイをDFMにスライドさせ、プライムサイクルを2回実行します。ポッドの下側にある各ポートから液滴が出ていないか確認します。
注:4回の「Prime」サイクル後に液滴が形成されない場合は、ポッドの出口リザーバー内のポートに直接接触させ(図1B)、それぞれの培地の200μLをピペットで動かして、リザーバーとチャネルの間を培地が流れるようにします。 - チップからピペットチップを取り外し、それぞれのメディアの液滴をすべてのチャネルインレットとアウトレットに置きます。
- チップをポッドにスライドさせ、ポッドをトレイに置きます。
- 頂端および基底出口ポッドリザーバー内の培地とチップの表面の培地を吸引します。次に、トレイを DFM にスライドさせます。
- DFMで次のパラメータを設定します:上部と下部 - 液体;アピカル(トップ)フロー - 40 μL/h;基礎(底)流量- 40μL/h;ストレッチ - 0%。周波数- 0Hz。 レギュレーション サイクルを実行します。
- 4時間後に流れを止め、廃液、すなわち頂端および基底出口の貯留層内の媒体を収集します。
- 排水量を測定して記録します。
- チップをDFMに戻し、頂端流量を0μL/hに、基礎流量を30μL/hに設定します。フローを開始して、夜間に実行します。
- 収集した廃液をさまざまな計画分析のために分注し、適切な温度で保管します。
注:CFU測定の場合は、グリセロールを最終濃度16%まで添加し、すぐに-80°Cで保存してください。 - 基礎出口リザーバーでのみ培地を吸引し、DFMで頂端および基礎流量を40μL/hに設定します。フローを4時間開始し、手順7.18〜7.21を繰り返します。これは48時間の排水収集になります。
- 手順7.22を72時間、または実験が終了するまで繰り返します。
- 実験の最後に、手順 7.18 から 7.19 に従って廃液を収集します。
- TrypLE expressに1 mg/mLのコラゲナーゼIVを加えて消化溶液を調製します。消化液10mLを37°Cに温めます。
- 基底チャネルの出口ポートをピペットチップで塞ぎます。100 μLの消化液を基底チャネルに加えます。よく混ぜ、ピペットを使用して、「チューブB」とラベル付けされたチューブ内のチャネルからすべての溶液を収集します。
- アピカルチャンネルの出口ポートをピペットチップで塞ぎます。100 μLの消化液を頂端チャネルに加えます。よく混ぜ、ピペットを使用して、チャンネルからすべての溶液を「チューブA」とラベル付けされたチューブに集めます。
- さらに100 μLの消化液を頂端チャネル入口と基底チャネル入口の両方に加え、出口をピペットチップで塞ぎます。チップとチューブAおよびBを37°Cで1〜1.5時間インキュベートします。
- すでに入口と出口に配置されているプラグチップを使用して、消化内容物をチャネル内でよく混合します。頂端チャネルと基底チャネルの内容物をそれぞれチューブAとBに収集します。これらはチップの頂端と基礎の消化物です。
- 血球計算盤を使用してチューブAの細胞をカウントします。また、手順7.21に従って、CFU測定用のチップダイジェストからアリコートを取り除きます。
8. チップ廃液と消化物の分析
- 廃液および消化物からの細菌の計数のために、廃液または消化物を滅菌DPBS(-/-)で段階希釈し、適切な培地プレート上のプレートにプレートし、37°Cで24〜48時間インキュベートし、プレート上のコロニーをカウントします。
- pHの測定は、回収後すぐに72時間の廃液を10μL採取し、pHストリップを用いて廃液のpHを測定します。
- サイトカインの分析のために、Luminexベースのアッセイ、ELISA、または他の適用可能な技術29,30を用いて特定のサイトカインを検出するために流出物を使用する。
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Representative Results
人間の膣は、線維芽細胞に富むコラーゲン間質を覆う層状上皮によって裏打ちされています。これをモデル化するために、2チャンネルのマイクロ流体臓器チップデバイス内で、一般的な多孔質膜の反対側にある初代ヒト膣上皮と線維芽細胞を培養することにより、組織界面を作成しました。膣上皮の形成は、明視野顕微鏡イメージングを用いてモニターされ、複数の細胞層を徐々に形成する連続した細胞シートの形成が明らかになる(図2A)。以前の報告では、この形態は、断面29で見た場合、完全に層状になった上皮の発達と相関していることが確認されました。ただし、上皮層が斑状で不連続に見える場合(図2B)、膣チップは実験での使用に適していない可能性があります。
図3は、Vagina Chipの生成の概略図を示しています。Vagina Chipの機能を検証するために、チップに L. crispatus と G. vaginalis を接種し、それぞれ健康な膣環境と細菌叢異常の膣環境をモデル化しました。 G. vaginalis は、主に細菌性膣炎に関与する細菌です。健康な細菌と腸内細菌叢の細菌が膣チップに生着しているかどうかを確認するために、チャネルの廃液と消化された細胞層を選択的な細菌増殖培地( L. crispatus の場合はDe Man-Rogosa-Sharpe(MRS)寒天、 G. vaginalisの場合はBrucella血液寒天培地( BBA)を参照)にプレーティングし、元の接種物を使用して同様の培養と比較することにより、さまざまな細菌集団を接種した膣チップの細菌量を定量化しました。 L. crispatus と G. vaginalis のコロニーは、めっきから48時間以内に検出され(図2C)、健康な細菌と細菌叢異常菌の両方が膣チップに生着したことが確認されました。ただし、接種物を含むプレートでは細菌のコロニーが観察されるが、必要なインキュベーション後に廃液または消化物を含むプレートでは観察されない場合は、細菌が生着しなかったと結論付けることができます。
健康な膣環境は酸性であり、腸内細菌叢障害は膣のpH31の上昇をもたらします。したがって、膣チップの頂端上皮チャネルの流出物のpHも分析した。 L. crispatus を接種したVagina ChipsのpHは、接種していない対照チップのpHと同様であり、 G. vaginalis と共培養すると、pHが有意に上昇しました(図2D)。感染していない膣チップのpHが高いことが観察された場合は、問題があることを示しており、これらのチップを実験に使用しないでください。
膣組織の炎症状態は、膣マイクロバイオームの組成にも敏感であり、腸内細菌叢の異常が炎症を刺激します。L. crispatus または G. vaginalis のいずれかを接種してから 3 日後に Vagina チップの頂端チャネルの炎症誘発性サイトカインを分析したところ、炎症誘発性反応は、感染していないチップや L. crispatus を接種したチップと比較して、G. vaginalis の方が同様に高いことがわかりました (図 2E).まとめると、これらの結果は、膣チップが健康な状態と腸内細菌叢の異なる状態の両方で人間の膣微小環境を密接に模倣していることを示しています。
図1:2チャンネルチップとそのポッド(A)チャンネルとポートを示す2チャンネルPDMSチップの画像。(B)頂端および基底チャネルの貯水池とポートを描いたポッドの画像。(C)微生物に感染した膣チップの断面図を示す模式図。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:Vagina Chipは、健康で細菌叢障害のあるヒトの膣微小環境を模倣している(A)堅牢なVagina Chipの頂端チャネルにある膣上皮細胞。スケールバーは、上の画像でチップの1mm、下の画像で500μmを表します。(B)不十分な膣チップの頂端チャネル内の膣上皮細胞。スケールバーは、上の画像でチップの1mm、下の画像で500μmを表します。(C)膣チップへのL.crispatus(LC)およびG.vaginalis(GV)の生着。(D)L. crispatus(LC)およびG. vaginalis(GV)と72時間インキュベーションした後の膣チップのpHを、非感染(対照)膣チップと比較した。(E)非感染(対照)膣チップと比較して、72時間のインキュベーション後のL.crispatus(LC)およびG.vaginalis(GV)に対する膣チップの炎症誘発性反応。(C-E)グラフは、4〜6チップの平均±SDを示しています。対照膣チップと比較して、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001;各(●)は1チップのデータを表します。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:Vagina Chipを生成するためのプロトコルの概略図。 細胞の播種と膣チップの生成に関連するステップの概略図。HVECs - ヒト膣上皮細胞;HUFs - ヒト子宮線維芽細胞;VEM - 膣上皮培地;FM - 線維芽細胞培地;DM - 分化媒体;PS - ペニシリンストレプトマイシン。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ヒト膣の過去のin vitroモデルは、膣組織の構造、体液の流れ、および宿主と病原体の相互作用を忠実に再現していません19,22。動物モデルは、マイクロバイオームの種間変動や発情周期または月経周期の違いによっても制限されます19,22。この原稿では、健康で嚥下障害のある微生物群集に対する人間の反応を効果的に模倣できる、ヒト膣の臓器チップモデルを作成するためのプロトコルについて説明します。
このプロトコルは、市販されている2チャンネルの臓器チップデバイス( 材料の表を参照)で平行なマイクロチャネルを分離する共有多孔質膜の反対側に膣上皮細胞と線維芽細胞を播種することを含む。多孔質膜は、成長因子やその他の形態の細胞間コミュニケーションの移動を可能にします。しかし、コラーゲンのコーティングと細胞単層の存在により、チャネル間の培地の混合が妨げられます。頂端チャネルに膣上皮細胞単層が形成されると、分化因子が基底チャネルを流れる培地に導入され、基底チャネルは間質空間を通過し、それによって膣上皮細胞の分化を促進して層状上皮を形成します。播種時の膣上皮細胞の密度は、分化期の終わりにおける膣チップの健康の重要な決定要因です。したがって、膣上皮細胞の密度は、分化を開始する前に評価されるべきであり、単層が確立されるまで開始されるべきではない。分化因子への曝露は、膣上皮細胞の所望の密度が得られるまで、および細菌接種前に継続することができる。さらに、増殖速度は、異なるドナー(または商業供給源)からの初代膣上皮細胞によって異なる場合があり、生成された膣チップの品質に影響を与える可能性があることに注意する必要があります。すべてのマイクロ流体臓器チップ研究では、チップ培養全体のチャネルに形成される可能性のある気泡が培地の流れを妨げ、最終的に栄養素の利用可能性が低下し、細胞の生存率が失われる可能性があるため、除去することが最も重要です。
このプロトコルでは、膣チップを使用して、健康な膣の状態または細菌性膣炎のいずれかを模倣する細菌群集をチップ上に確立する方法についても説明します。膣チップは、他の膣の病気や障害の研究にも使用できます。ただし、これらの研究を実施する際には、各疾患の特徴と結果を臨床所見と相関させるための最良の手段を理解するように注意する必要があります。要約すると、ヒト膣チップは、FRTに関連する多数の疾患や状態を研究するための新しい道を開き、潜在的な治療法を調査するための貴重なツールになる可能性があります。
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Disclosures
Donald Ingberは、Emulateの創設者、取締役、科学諮問委員会の議長、および株主です。他の著者は、競合する利害関係はないと宣言しています。
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Steriflip | Millipore | SCGP00525 | To degas media |
| 2 channel chip | Emulate | BRK-S1-WER-24 | Part of the two-channel Chip kit |
| 200 μL barrier tips (or filter tips) | Thomas Scientific, SHARP | 1159M40 | Tips used for chip seeding |
| Activation Reagent 1 (or ER-1 powder) | Emulate | Chip S1 Basic Research kit-24PK | Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C |
| Activation Reagent 2 (or ER-2 solution) | Emulate | Chip S1 Basic Research kit-24PK | Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C |
| Adenine | Sigma Aldrich | A2786 | Component of the Differentiation media |
| Brucella blood agar plates | VWR International Inc. | 89405-032 | with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis |
| Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-) | ScienCell | 303 | For washing cells |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Component of the Differentiation media |
| Calcium chloride (anhyd.) | Sigma Aldrich | 499609 | Component of HBSS (LB/+G) |
| Collagen I | Corning | 354236 | For the coating solution for HVEC |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C7521 | For the coating solution for HVEC |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | For the dissociation of cells from the Vagina Chips |
| Complete fibroblast medium | ScienCell | 2301 | Media for the culture of HUF |
| Complete vaginal epithelium medium | Lifeline | LL-0068 | Media for the culture of HVEC |
| D-Glucose (dextrose) | Sigma Aldrich | 158968 | Component of HBSS (LB/+G) |
| DMEM (Low Glucose) | Thermofisher | 12320-032 | Component of the Differentiation media |
| Dynamic Flow Module (or Zoë) | Emulate | Zoë-CM1 | Regulates the flow rate of the chips |
| Ham's F12 | Thermofisher | 11765-054 | Component of the Differentiation media |
| Heat inactivated FBS | Thermofisher | 10438018 | Component of the Differentiation media |
| Human uterine fibroblasts | ScienCell | 7040 | HUF |
| Human vaginal epithelial cells | Lifeline | FC-0083 | HVEC |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0396 | Component of the Differentiation media |
| ITES | Lonza | 17-839Z | Component of the Differentiation media |
| L-glutamine | Thermofisher | 25030081 | Component of the Differentiation media |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2393 | Component of HBSS (LB/+G) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | M1880 | Component of HBSS (LB/+G) |
| MRS agar plates | VWR International Inc. | 89407-214 | For enumeration of Lactobacillus |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma Aldrich | P0503 | Component of the Differentiation media |
| Pen/Strep | Thermofisher | 15070063 | Component of the Differentiation media |
| pH strips | Fischer-Scientific | 13-640-520 | For measurement of pH |
| Pods (1/chip) | Emulate | BRK-S1-WER-24 | Part of the two-channel Chip kit |
| Poly-L-lysine | ScienCell | 403 | For the coating solution for HUFs |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911 | Component of HBSS (LB/+G) |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | Component of HBSS (LB/+G) |
| Sterile 80% glycerol | MP Biomedicals | 113055034 | For freezing bacterial samples |
| Triiodothyronine | Sigma Aldrich | T6397 | Component of the Differentiation media |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma Aldrich | T8154 | For counting live/dead cells |
| TrypLE Express | Thermofisher | 12605010 | For the dissociation of cells from the Vagina Chips |
| Trypsin Neutralizing Solution (TNS) | ScienCell | 113 | For neutralization of Trypsin |
| Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%) | ScienCell | 103 | For cell dissociation |
| β-estradiol | Sigma Aldrich | E2257 | Hormone for differentiation media |
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