Summary
Denne artikel præsenterer en guide til prøvetagning af seks betydningsfulde og forskelligartede organer hos voksne Xenopus , der hurtigt og let kan tilgås: hjerteventrikel, leverlap, bugspytkirtel, fedtlegemer, parrede nyrer og hud.
Abstract
Xenopus har været en kraftfuld modelorganisme til at forstå hvirveldyrs udvikling og sygdom i over hundrede år. Mens eksperimentel analyse og dissektionsteknikker af embryonet er veldokumenterede, er beskrivelser af voksne Xenopus-strukturer og -organer, sammen med teknikker til at arbejde med voksne, ikke blevet opdateret for at tage hensyn til kravene til sådanne moderne tilgange som kvantitativ proteomik og enkeltcellet transkriptomik. De celletype- og gencentrerede perspektiver kræver kontrasterende observationer i embryonale stadier til dem i voksent væv. Larvens organer gennemgår betydelige ændringer i deres overordnede struktur, morfologi og anatomiske placering langs overgangen fra larve til voksen, især under massiv metamorfose-ombygning. Det er afgørende at etablere robuste standarder for organidentifikation og dissektion for at sikre, at datasæt, der er resultatet af undersøgelser udført på forskellige laboratorier, kan være konsistente. Den nuværende protokol identificerer seks af organerne i den voksne Xenopus og demonstrerer metoder til dissektion og prøvetagning af hjerteventriklen, leveren, fedtlegemet, bugspytkirtlen, parret nyre og hud hos den voksne Xenopus. Afhængig af konserveringsmetoderne kan de dissekerede organer bruges til kvantitativ proteomik, enkeltcelle/kerne transkriptomik, in situ hybridisering, immunhistokemi, histologi osv. Denne protokol har til formål at standardisere vævsprøvetagning og lette undersøgelser af de voksne organsystemer i flere laboratorier.
Introduction
Selvom den "digitale dissektion" af voksen Xenopus" er tilgængelig1, er replikerbar organ- og vævsprøvetagning af voksen Xenopus fortsat udfordrende uden den detaljerede instruktion, der er tilgængelig for andre voksne modeller (f.eks. mus 2,3,4). Denne artikel har til formål at give klare retningslinjer for nøjagtig og replikerbar organprøvetagning af voksne Xenopus svarende til, hvad der i øjeblikket er tilgængeligt for deres larver5. Der lægges vægt på nem færdiggørelse for at opretholde maksimal friskhed og gøre protokollen tilgængelig for alle brugere.
Selvom der er en grundig dissektionsvejledning til Rana sp.6, samt adskillige dissektionsvejledninger til klasseværelset for andre anuraner7, er der i øjeblikket ingen Xenopus-dissektions- og prøvetagningsvejledning tilgængelig. For dem, der ikke er bekendt med prøvetagningspraksis eller paddeanatomi, gør de små forskelle mellem Xenopus og andre anuraner disse ressourcer suboptimale til replikerbar vævsprøvetagning.
Mange værdifulde væv er ikke inkluderet og er endda kasseret i denne vejledning; Dette er for at sikre vævets friskhed. Seks prøver er begrænsede nok til at sikre, at disse væv kan indsamles på under en time efter, at hjertet begynder at slå, uanset brugerens erfaring eller færdighedsniveau. Mere avancerede og detaljerede vejledninger til indsamling af mange andre væv er under udarbejdelse som separate ledsagende papirer.
For mindre erfarne brugere anbefales det altid, at denne protokol først forsøges på dyr, der aflives af andre årsager end forsøg, før der udtages prøver af dyr, der er udfordrende at erstatte (dvs. transgener, dyr i fremskreden alder osv.). Ideelt set vil alle dyr, der udtages prøve, være sunde og raske, og hvis de er hunner, vil de ikke have haft ægløsning inden for de seneste to uger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med regler og forskrifter fra Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3). De repræsentative resultater er vist for både en perfunderet og ikke-perfunderet moden albino han Xenopus laevis.
1. Forsøgspræparat
BEMÆRK: Hvis perfusionsprotokol8 følges før sampling, skal du gå til trin 2.2.
- Sørg for, at forskningsinstitutionen har godkendt den eutanasiteknik, der er beskrevet i denne protokol.
- Forbered en opløsning af 5 g/L MS-222 (tricainemethansulfonat) og 5 g/L natriumbicarbonat (se materialetabel). Volumenet skal være større end det volumen, der kræves for at dække de dyr, der aflives fuldstændigt. Kontroller pH-værdien for at sikre, at den er ≥7.
- Udfør primær eutanasi ved at placere Xenopus i eutanasiopløsningen; Dyret forbliver nedsænket i alt 1 time.
- Indstil dissektionsstationen, så alt væv umiddelbart efter prøveudtagning kan skylles i kølet PBS eller 0,7x PBS9 (afhængigt af eksperimentelle behov), kontrolleres og trimmes under et 5x (eller mere) forstørrelseslys. Denne station skal også gøre det muligt for brugeren enten at udskifte alle pincetter og sakse eller tørre dem af mellem brug.
- Når frøen har været i opløsningen i 1 time, er primær aflivning afsluttet. Fjern frøen og kontroller tabet af smerterespons ved at udføre en fodklemme.
- Registrer de relevante oplysninger om dyret, såsom art, stamme, køn, alder og sundhedsstatus, samt om det var perfunderet. Vej Xenopus og tag eventuelle yderligere mål, såsom snudeventilationslængde.
- Placer frøen på ryggen og fastgør lemmerne proksimalt for kroppen (figur 1).
- Brug en dissektionssaks til at skære gennem huden, op ad midtlinjen og derefter sideværts og lave to klapper.
- Med henvisning til figur 2 skal du identificere linea alba og bruge pincet til at gribe den og trække den væk fra det coelomiske hulrum. Skær forsigtigt op gennem muskulaturen med en saks. Lav to klapper ud af hulmuren. Klip eller fastgør alle flapper af vejen.
- Identificer det hjerte, der stadig vil slå. Brug en dissektionssaks til at reducere coracoidknoglerne (figur 2) for at få bedre adgang til hjertet.
BEMÆRK VENLIGST: Hvis hjertet er holdt op med at slå før prøveudtagning, skal det bemærkes, at prøvens friskhed er blevet kompromitteret.
2. Prøveudtagning
BEMÆRK VENLIGST: Hvis dyret er blevet perfunderet, skal du springe til trin 2.2.
- Identificer det tynde hjertesæk og træk det stramt med vævstang (figur 3).
- Brug spidsen af iriskektomisaksen til forsigtigt at perforere perikardiet, og pas på ikke at skære det underliggende væv. Skræl hjertesækken væk fra hjertets 3 kamre.
- Brug pincet til at gribe ventriklen ved spidsen, identificer, hvor den fastgøres til auriklerne og arteriel trunk (figur 4), og skær den under disse vedhæftninger (figur 5). Trim om nødvendigt ventriklen, så intet væv fra auriklerne eller arteriel bagagerum er synligt, og lyst ventilvæv vil stadig være synligt inde i ventriklen.
BEMÆRK: Hos ikke-perfuserede dyr kan fjernelse af ventriklen kvalificeres som sekundær aflivning. - De 3 lapper i leveren vil være synlige (figur 6 og figur 7). Tag fat i læben på venstre lap (til højre for beskueren) og løft den forsigtigt, så lever- og cystekanalerne er synlige (figur 8). Udtag prøver af den nederste 1/3 af lappen under disse vedhæftede filer (figur 9).
- For at få bedre adgang til vævet fra en hunfrø er det nyttigt at fjerne æggestokken. Identificer æggestokken, som er indhyllet i et lag af visceralt peritoneum kaldet kimepitelet. Flyt forsigtigt lapperne, indtil de er på deres respektive sider for at gøre fastgørelsesområdet synligt (Figur 10). Disse vedhæftninger er direkte ventrale til den parrede nyre.
- Brug en saks til at fjerne æggestokkene så tæt på nyrerne som muligt uden at beskadige dem (figur 11).
- Undersøg leverens mediale lap (også kaldet den forreste lap) og bemærk, hvordan den forbindes til maven og tolvfingertarmen gennem mesenteriet og hepatopancreaskanalen (også kaldet den fælles galdegang) (figur 6, figur 7 og figur 8).
- Afbryd mesenteriet, hepatoduodenalt ledbånd ved hjælp af iriskektomisaks samt hepatopancreaskanalen, hvor det møder tolvfingertarmen. Afbryd forbindelsen mellem bugspytkirtlen og hepatopancreaskanalen til leverens mediale lap, så der ikke sidder mørkt levervæv fast (figur 12).
- Tag fat i maven med tandpincet og den overlegne ende af bugspytkirtlen med vævstang. Under 5x forstørrelse drilles forsigtigt bugspytkirtlen ud af maven (figur 13).
BEMÆRK VENLIGST: Hvis det ikke kommer rent væk, vil det resterende bugspytkirtelvæv være synligt og kan plukkes af i fragmenter. Alternativt kan bugspytkirtlen metodisk løsnes ved hjælp af iriskektomisaks og vævstang. - Med henvisning til figur 14A skal du identificere urinblæren og fjerne den, skære så tæt på cloaca som muligt. Kassér dette væv.
- Med henvisning til figur 14B skal du identificere tyktarmen og trække den stramt for at skære tyktarmen så tæt på cloacaen som muligt. Fjern og kassér hele fordøjelseskanalen, og skær bughinden, hvor den fastgøres til milten. De fede kroppe vil nu være fuldt tilgængelige.
- Drille de fede kroppe fra hinanden, så de er på hver deres side. Området over nyren, hvor fedtlegemet forbinder sig med bughinden, vil være synligt. Tag fat i bunden af den venstre fedtkrop (til højre for beskueren) og brug en saks til at skære den væk fra bughinden, så der er en lille margen, så nyren ikke beskadiges (figur 15).
- Fjern og kassér den resterende fedtkrop. De parrede nyrer vil nu være fuldt synlige.
- Hos hunfrøer eller hanner med tydelige vestigiale æggeledere, tag fat i en æggeleder og træk den væk fra nyren og cloaca (figur 16). Skær æggelederen, hvor den møder cloacaen, og fortsæt med at trække den væk fra nyrerne, og skær eventuelle klare peritoneale vedhæftninger, når de bliver synlige. Kassér dette væv.
- Gentag denne proces med den resterende æggeleder.
- Nyrerne er stadig dækket af klar bughinde (retroperitoneal)10. Brug pincet til at tage fat i nyrerne og afskære bughinden i deres nedre ende.
- Løft nyrerne ud af det coelomiske hulrum ved hjælp af en saks til at skære bughinden så tæt på nyrerne som muligt uden at beskadige dem (figur 17).
- Under 5x forstørrelse skal du skære overskydende bughinde og andet resterende væv (fedtlegemer, milt) væk. Hvis frøen er hunkøn, skal du sikre dig, at eventuelt resterende æggestokvæv fjernes (figur 18). Hvis frøen er han, skal du forsigtigt fjerne testiklerne og kontrollere, om der er en vestigial æggeleder, som muligvis ikke er synlig uden forstørrelse (figur 19).
- Fjern stifterne fra dyret, vend det på dets ventrum, og fastgør dyrets lemmer igen.
- Vælg et af bagbenene til prøvetagning og fastgør foden af det pågældende lem.
- Fjern en mandelformet hudflap over gastrocnemius/tibiofibula (figur 20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved at bruge figur 1 til figur 20 og følge alle trin i denne protokol blev hjerteventriklen, den venstre leverlap, bugspytkirtlen, de venstre fedtlegemer, parrede nyrer og en hudflap rent skåret ud inden for en time efter aflivning. Inden for denne tid skylles og trimmes prøverne, så de vises, som vist i figur 21.
Figur 1: Fastgjort Xenopus. En moden hun X. tropicalis fastgjort gennem hvert lem. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Bugvæg. Den ventrale hud på en X. tropicalis-hun er skåret i klapper, hvilket gør linea alba og coracoid knogler synlige. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Hjertesækken. Hjerteventriklens spids gribes gennem perikardiet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hjerteventrikel og arteriel trunk. Ventriklen på en perfuseret X laevis, der gribes og viser dens fastgørelse til arteriestammen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Hjertediagram. Et diagram over de relevante strukturer i hjertet med en stiplet linje, der angiver, hvor der skal tages prøver af ventriklen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Hepatopancreatic diagram. Et diagram over de 3 lapper i leveren, bugspytkirtlen og tilhørende organer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Hepatopancreasorganer. En perfuseret, albino X. laevis han med 3 lapper af lever, bugspytkirtel og tilhørende organer mærket. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Cystiske og leverkanaler. Den venstre lap af leveren løftes for at vise cyste- og leverkanalerne i perfunderet X. laevis. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Leverprøvetagning. Den venstre leverlap af en uperfunderet X. tropicalis er afskåret under vedhæftningerne i leverkanalerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Fastgørelse af æggestokke. Med æggestoklapperne på deres respektive sider er kontinuiteten af germinalepitelet til bughindevæggen (over nyrerne) synlig. To hvide stiplede linjer angiver, hvor disse vedhæftede filer skal skæres over. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: Fjernelse af æggestokke. Æggestokken på en uperfunderet X. laevis trækkes væk fra de parrede nyrer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 12: Mesentery snit. Det coelomiske hulrum i en uperfunderet X. laevis efter prøveudtagning af hjerteventriklen og venstre lap af leveren samt fjernelse af æggestokken. En hvid stiplet linje angiver, hvor hepatopancreasbåndet og kanalen skal skæres over, mens en grøn stiplet linje angiver, hvor bugspytkirtlen skal adskilles fra leverens mediale lap. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 13: Prøveudtagning af bugspytkirtlen. Bugspytkirtlen på en uperfunderet X. laevis bliver drillet af maven. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 14: Fjernelse af organer. (A) Urinblæren på en ikke-perfuseret X. laevis trækkes væk fra cloacaen med en stiplet linje, der angiver, hvor den skal skæres. (B) Tyktarmen på en uperfunderet X. laevis trækkes væk fra cloacaen med en stiplet linje, der angiver, hvor den skal skæres over. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 15: Prøvetagning af fedt legeme. Fedtlegemerne, der er fastgjort til bughinden i den øvre ende af de parrede nyrer, trækkes ud af det coelomiske hulrum med en stiplet linje, der viser, hvor de skal skæres. Bemærk, at ved siden af denne vedhæftning har denne han X. tropicalis 1 testikler samt et par forskellige vestigiale æggeledere. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 16: Fjernelse af æggeledere. Æggelederen af en perfuseret X. laevis trækkes væk fra den parrede nyre, hvilket gør den klare bughinde synlig. En stiplet linje angiver, hvor bughinden skal skæres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 17: Prøvetagning af nyrer. De parrede nyrer af en uperfunderet X. laevis løftes ud af det coelomiske hulrum. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 18: Nyretrimning. (A) Et ventralt billede af en uperfunderet kvinde X. laevis parrede nyre med tilhørende peritoneale organer fastgjort. (B) Den samme nyre med tilhørende organer fjernet, men med noget peritonealt væv tilbage. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 19: Fjernelse af testikler. De parrede nyrer af uperfunderet X. tropicalis med en testikler fjernes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 20: Hudprøver. (A) Højre ben af en X. tropicalis med en stiplet linje, der angiver det hudområde, der skal udtages prøver af. (B) Højre ben af en X. tropicalis med en hudprøve fjernet over tibiofibula. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 21: Repræsentative resultater af organprøvetagning. Prøver af hjerteventrikel, lever, bugspytkirtel, fedtkrop, parret nyre og hud taget fra en perfuseret og ikke-perfuseret albino X. laevis. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Da denne protokol har til formål at maksimere friskheden, kan nogle prøver indeholde uønskede væv. For eksempel prøves hepatopancreaskanalen og noget mesenterium med bugspytkirtlen, og noget peritonealvæv, binyrer og urinledere vil altid blive samplet med de parrede nyrer. Hvis friskhed ikke er et problem, kan mere præcis prøveudtagning opnås ved hjælp af modificerede teknikker.
Udseendet og placeringen af organer er sammenlignelige mellem køn og arter af Xenopus. Vævets farve varierer dog betydeligt afhængigt af, om dyrene er blevet perfunderet eller ej. Det er af denne grund, at billeder af både perfuserede og ikke-perfuserede dyr er inkluderet.
En begrænsning ved denne protokol er, at hastighed og reproducerbarhed prioriteres frem for indsamling af prøver, der bedst repræsenterer hele det ønskede væv. For eksempel kan den del af den venstre lap af leveren, der er prøvetaget her, ikke tilstrækkeligt repræsentere alle tre lapper af levervæv. Hvis der er fejl i prøvetagningen, påvirkes mulighederne for fejlfinding af potentialet for variation mellem forskellige vævssektioner. For eksempel vides det ikke, om den højre lap af leveren, den rigtige fede krop eller en anden del af huden ville være funktionelle alternativer til det ønskede væv. I disse tilfælde bør der udvises diskretion baseret på forskningens behov, før man erstatter vævssektioner.
En anden begrænsning ved denne protokol er, at hvis de dyr, der udtages prøver fra, har drastiske anatomiske defekter eller klinisk signifikante sundhedsproblemer, vises organerne i det coelomiske hulrum muligvis ikke som beskrevet her. Granulomer er fundet i væv fra frøer inficeret med Mycobacterium spp.11,12, og tidligere tilfælde af ovariehyperstimulationssyndrom ser ud til at føre til en unormal præsentation af organer13.
Selvom denne metode er blevet udviklet til laboratorie-Xenopus, er der betydelige ligheder i udseendet af disse organer hos mange ikke-cæcilianske padder og lemmede krybdyr14. Prøveudtagningsdelen af denne protokol kan let ændres til andre modeller, såsom axolotler eller den grønne anole.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH's OD-bevilling R24OD031956. Vi takker Samantha Jalbert, Jill Ralston og Cora Anderson for deres hjælp og støtte samt vores redaktør og anonyme fagfællebedømmere for deres nyttige feedback
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying Glass with LED Light and Stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable Transfer Pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection Tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Iridectomy Scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Sodium Bicarbonate, Powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen Forceps, Serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for Dissecting | Fisher Scinetific | S99385 |
References
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R.
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a Frog (Rana sp.). Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. JoVE. (issue), e65287 (2023).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Trott, K. A., et al. Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis). Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).
- Fremont-Rahl, J. J., et al. Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs. Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).
- Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol. Herpetol. , 35-81 (2009).
