Summary
Den här artikeln presenterar en guide för provtagning av sex viktiga och olika organ hos vuxna Xenopus som snabbt och enkelt kan nås: hjärtkammaren, leverloben, bukspottkörteln, fettkroppar, parade njurar och hud.
Abstract
Xenopus har varit en kraftfull modellorganism för att förstå ryggradsdjurs utveckling och sjukdomar i över hundra år. Även om experimentella analys- och dissektionstekniker av embryot är väldokumenterade, har beskrivningar av strukturer och organ hos Xenopus hos vuxna, tillsammans med tekniker för att arbeta med vuxna, inte uppdaterats för att ta hänsyn till kraven för sådana moderna metoder som kvantitativ proteomik och encellstranskriptomik. De celltyps- och gencentrerade perspektiven kräver kontrasterande observationer i embryonala stadier till de i vuxna vävnader. Larvens organ genomgår betydande förändringar i sin övergripande struktur, morfologi och anatomiska läge längs hela övergången från larv till vuxen, framför allt under massiv metamorfosombyggnad. Att fastställa robusta standarder för identifiering och dissektion av organ är avgörande för att säkerställa att dataset som härrör från studier som utförts vid olika laboratorier kan vara konsekventa. Detta protokoll identifierar sex av organen i den vuxna Xenopus, och demonstrerar metoder för dissektion och provtagning av hjärtkammare, lever, fettkropp, bukspottkörtel, njure och hud hos den vuxna Xenopus. Beroende på konserveringsmetoderna kan de dissekerade organen användas för kvantitativ proteomik, transkriptomik med enskilda celler/kärnor, in situ-hybridisering , immunhistokemi, histologi, etc. Detta protokoll syftar till att standardisera vävnadsprovtagning och underlätta undersökningar av de vuxna organsystemen i flera laboratorier.
Introduction
Även om den "digitala dissektionen" av "Xenopus" är tillgänglig1, är det fortfarande svårt att ta replikerbar organ- och vävnadsprovtagning av Xenopus hos vuxna utan den detaljerade instruktion som finns tillgänglig för andra vuxna modeller (t.ex. möss 2,3,4). Den här artikeln syftar till att ge tydlig vägledning för noggrann och replikerbar organprovtagning av vuxna Xenopus liknande den som för närvarande finns tillgänglig för deras larver5. En tonvikt läggs på enkel ifyllnad för att bibehålla maximal färskhet och göra protokollet tillgängligt för alla användare.
Även om det finns en grundlig dissektionsguide för Rana sp.6, liksom många klassrumsdissektionsguider för andra anuraner7, finns det för närvarande ingen Xenopus-dissektions- och provtagningsguide tillgänglig. För dem som inte är bekanta med provtagningsmetoder eller amfibiers anatomi, gör de små skillnaderna mellan Xenopus och andra anuraner att dessa resurser inte är optimala för replikerbar vävnadsprovtagning.
Många värdefulla vävnader ingår inte och kasseras till och med i denna guide. Detta för att säkerställa att vävnaden är färsk. Sex prover är tillräckligt begränsade för att säkerställa att dessa vävnader kan samlas in på mindre än en timme efter att hjärtat börjar slå, oavsett användarens erfarenhet eller kunskapsnivå. Mer avancerade och detaljerade guider för insamling av många andra vävnader håller på att utarbetas som separata kompletterande dokument.
För mindre erfarna användare rekommenderas det alltid att detta protokoll först provas på djur som avlivas av andra skäl än experiment innan provtagning görs på några djur som är svåra att ersätta (t.ex. transgena, djur i hög ålder, etc.). I idealfallet ska alla djur som provtas vara friska och, om de är av honkön, inte ha haft ägglossning under de senaste två veckorna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med regler och föreskrifter från Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3). De representativa resultaten visas för både en perfunderad och en icke perfunderad mogen albinohane av Xenopus laevis.
1. Experimentell förberedelse
OBS: Om perfusionsprotokoll8 följs före samp, hoppa till steg 2.2.
- Försäkra dig om att forskningsinstitutionen har godkänt den eutanasiteknik som beskrivs i detta protokoll.
- Bered en lösning av 5 g/L MS-222 (trikainmetansulfonat) och 5 g/L natriumbikarbonat (se Materialtabell). Volymen måste vara större än den volym som krävs för att täcka de djur som avlivas helt. Kontrollera pH-värdet för att säkerställa att det är ≥7.
- Utför primär dödshjälp genom att placera Xenopus i eutanasilösningen. Djuret kommer att förbli nedsänkt i totalt 1 timme.
- Ställ in dissektionsstationen så att alla vävnader omedelbart efter provtagning kan sköljas i kyld PBS eller 0,7x PBS9 (beroende på experimentella behov), kontrolleras och trimmas under en 5x (eller större) förstoringslampa. Denna station måste också göra det möjligt för användaren att antingen byta ut alla pincetter och saxar eller torka av dem mellan användningarna.
- När grodan har varit i lösningen i 1 timme har den primära avlivningen slutförts. Ta bort grodan och kontrollera förlusten av smärtrespons genom att nypa i foten.
- Anteckna lämpliga uppgifter för djuret, såsom art, stam, kön, ålder och hälsotillstånd samt om det var perfunderat. Väg Xenopus och gör eventuella ytterligare mätningar, t.ex. längden på nosen och ventilen.
- Placera grodan på rygg och nåla fast lemmarna proximalt mot kroppen (Figur 1).
- Använd en dissektionssax för att klippa genom huden, upp på mittlinjen och sedan i sidled, så att du gör två flikar.
- Med hänvisning till figur 2, identifiera linea alba och använd en pincett för att ta tag i den och dra bort den från coelomikhålan. Klipp försiktigt upp genom muskulaturen med en sax. Gör två flikar av hålrumsväggen. Klipp eller nåla bort alla flikar.
- Identifiera hjärtat som fortfarande kommer att slå. Använd dissekeringssax för att minska de coracoida benen (Figur 2) för att få bättre tillgång till hjärtat.
OBS: Om hjärtat har slutat slå före provtagning bör det noteras att provets färskhet har äventyrats.
2. Provtagning
OBS: Om djuret har fått perfundering, hoppa till steg 2.2.
- Identifiera den tunna hjärtsäcken och dra åt den med en vävnadstång (Figur 3).
- Använd spetsen på iridektomisaxen för att försiktigt perforera hjärtsäcken, var försiktig så att du inte klipper de underliggande vävnaderna. Dra upp hjärtsäcken från de 3 kamrarna i hjärtat.
- Använd en pincett för att ta tag i ventrikeln i spetsen, identifiera var den fäster vid öronen och artärstammen (Figur 4) och klipp den under dessa fästen (Figur 5). Om det behövs, trimma ventrikeln så att inga vävnader från öronen eller artärstammen är synliga, och ljusfärgad klaffvävnad kommer fortfarande att vara synlig inuti kammaren.
OBS: Hos icke-perfunderade djur kan avlägsnande av ventrikeln räknas som sekundär avlivning. - De 3 loberna i levern kommer att vara synliga (Figur 6 och Figur 7). Ta tag i läppen på den vänstra loben (på betraktarens högra) och lyft den försiktigt så att lever- och cystkanalerna är synliga (Figur 8). Ta prov på den nedre 1/3 av loben under dessa fästen (Figur 9).
- För att få bättre tillgång till vävnaderna hos en kvinnlig groda är det bra att ta bort äggstocken. Identifiera äggstocken som är insvept i ett lager av visceral peritoneum som kallas germinalt epitel. Flytta försiktigt loberna tills de är på sina respektive sidor för att göra fästområdet synligt (Figur 10). Dessa fästen är direkt ventrala till den parade njuren.
- Använd en sax för att ta bort äggstockarna så nära njurarna som möjligt utan att skada dem (Figur 11).
- Inspektera den mediala loben (även kallad den främre loben) i levern och notera hur den ansluter till magsäcken och tolvfingertarmen genom tarmkäxet och hepatopankreatuskanalen (även kallad den gemensamma gallgången) (Figur 6, Figur 7 och Figur 8).
- Skär av mesenterium, hepatoduodenalt ligament med hjälp av iridektomisax samt hepatopancreatisk kanal där den möter tolvfingertarmen. Bryt förbindelsen mellan bukspottkörteln och hepatopancreaskanalen och leverns mediala lob så att ingen mörk levervävnad fästs (Figur 12).
- Ta tag i magsäcken med en tandad pincett och den övre änden av bukspottkörteln med en vävnadstång. Vid 5x förstoring ska du försiktigt ta bort bukspottkörteln från magsäcken (Figur 13).
OBS: Om det inte lossnar rent kommer den återstående bukspottkörtelvävnaden att synas och kan plockas av i fragment. Alternativt kan bukspottkörteln metodiskt avlägsnas med hjälp av iridektomisax och vävnadstång. - Med hänvisning till figur 14A, identifiera urinblåsan och ta bort den, klipp så nära kloaken som möjligt. Kassera denna vävnad.
- Med hänvisning till figur 14B, identifiera tjocktarmen och dra den spänd för att skära av tjocktarmen så nära kloaken som möjligt. Ta bort och kassera hela matsmältningskanalen, skär av bukhinnan där den fäster vid mjälten. De feta kropparna kommer nu att vara fullt tillgängliga.
- Retas isär de feta kropparna så att de ligger på sina respektive sidor. Området över njuren, där den feta kroppen ansluter till bukhinnan, kommer att vara synligt. Ta tag i basen av den vänstra feta kroppen (på åskådarens högra) och använd en sax för att klippa bort den från bukhinnan, lämna en liten marginal så att njuren inte skadas (Figur 15).
- Ta bort och kassera den återstående fettkroppen. De parade njurarna kommer nu att vara fullt synliga.
- Hos grodhonor eller hanar med distinkta rudimentära äggledare, ta tag i en äggledare och dra bort den från njuren och kloaken (Figur 16). Klipp av äggledaren där den möter kloaken och fortsätt att dra bort den från njuren, klipp av alla tydliga peritoneala fästen när de blir uppenbara. Kassera denna vävnad.
- Upprepa denna process med den återstående äggledaren.
- Njurarna är fortfarande täckta med klar bukhinna (retroperitoneal)10. Använd en pincett för att ta tag i njurarna och skära av bukhinnan i deras nedre ände.
- Lyft ut njurarna ur kaviteten med en sax för att skära av bukhinnan så nära njurarna som möjligt utan att skada dem (Figur 17).
- Vid 5x förstoring, skär bort överflödig bukhinna och annan kvarvarande vävnad (feta kroppar, mjälte). Om grodan är en hona, se till att eventuell kvarvarande äggstocksvävnad tas bort (Figur 18). Om grodan är en hane ska du försiktigt ta bort testiklarna och kontrollera om det finns en rudimentär äggledare, som kanske inte är synlig utan förstoring (Figur 19).
- Ta bort stiften från djuret, vänd det på dess ventrum och fäst djurets lemmar igen.
- Välj antingen bakbenen att provta från och fäst foten på den lemmen.
- Ta bort en mandelformad hudflik över gastrocnemius/tibiofibula (Figur 20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att använda Figur 1 till Figur 20 och följa alla steg i detta protokoll kunde hjärtkammaren, den vänstra leverloben, bukspottkörteln, de vänstra fettkropparna, parade njurar och en hudflik rent avlägsnas inom en timme efter avlivning. Inom denna tid sköljs och trimmas proverna så att de visas, som visas i figur 21.
Bild 1: Fäst Xenopus. En fullvuxen hona av X. tropicalis sitter fast genom varje lem. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bukvägg. Den ventrala huden hos en X. tropicalis-hona är skuren i flikar, vilket gör linea alba- och coracoidbenen synliga. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Hjärtsäcksslutet hjärta. Hjärtkammarens topp grips genom hjärtsäcken. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Hjärtkammare och artärstam. Ventrikeln hos en perfunderad X laevis, som grips, visar dess fäste vid artärstammen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Hjärtdiagram. Ett diagram över de relevanta strukturerna i hjärtat med en streckad linje som anger var ventrikeln ska provtas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Hepatopancreasdiagram. Ett diagram över de 3 loberna i levern, bukspottkörteln och tillhörande organ. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Hepatopan creasorgan. En perfunderad, albino X. laevis hane med 3 flikar av lever, bukspottkörtel och tillhörande organ märkta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Cystiska kanaler och levergångar. Den vänstra leverloben lyfts för att visa de cystiska och levergångarna hos perfunderad X. laevis. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Leverprov. Den vänstra leverloben av en icke-perfunderad X. tropicalis är avskuren under fästena i levergångarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Fäste på äggstockarna. Med äggstocksloberna på sina respektive sidor är kontinuiteten av det germinala epitelet till bukhinneväggen (över njurarna) synlig. Två vita streckade linjer visar var dessa bilagor ska brytas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Borttagning av äggstockar. Äggstocken hos en icke-perfunderad X. laevis dras bort från de parade njurarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 12: Snitt av käx. Koelomisk kavitet hos en operfunderad X. laevis, efter provtagning av hjärtkammaren och vänster lob i levern samt avlägsnande av äggstocken. En vit streckad linje anger var man ska skära av det hepatopancreasiska ligamentet och kanalen, medan en grön streckad linje anger var bukspottkörteln ska skäras av från leverns mediala lob. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 13: Provtagning av bukspottkörteln. Bukspottkörteln hos en operfunderad X. laevis retas bort från magen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 14: Avlägsnande av organ. (A) Urinblåsan hos en operinfunderad X. laevis dras bort från kloaken med en streckad linje som anger var den ska skäras. (B) Tjocktarmen hos en icke perfunderad X. laevis dras bort från kloaken med en streckad linje som anger var den ska skäras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 15: Provtagning av fettkroppar. De feta kropparna, som är fästa vid bukhinnan i den övre änden av de parade njurarna, dras ut ur coelomikhålan med en streckad linje som visar var de ska skäras. Observera att intill detta fäste har denna hane X. tropicalis 1 testikel samt ett par distinkta rudimentära äggledare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 16: Avlägsnande av äggledare. Äggledaren hos en perfunderad X. laevis dras bort från den parade njuren, vilket gör den klara bukhinnan synlig. En streckad linje anger var bukhinnan ska snittas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 17: Njurprovtagning. De parade njurarna hos en icke-perfunderad X. laevis lyfts ut ur coelomiska hålan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 18: Trimning av njurarna. (A) En ventral bild av en operfunderad hona av X. laevis parade njure med tillhörande peritoneala organ fästa. B) Samma njure med tillhörande organ borttagna, men med en del av bukhinnevävnaden kvar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 19: Borttagning av testiklar. De parade njurarna hos den icke-perfunderade X. tropicalis med en testikel borttagen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 20: Provtagning av huden. A) Det högra benet på en X. tropicalis med en streckad linje som anger det hudområde som skall provtas. B) Det högra benet på en X. tropicalis med ett hudprov avlägsnat över tibiofibula. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 21: Representativa resultat av organprovtagning. Prover av hjärtkammare, lever, bukspottkörtel, fettkropp, parad njure och hud tagna från en perfunderad och operfunderad albino X. laevis. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eftersom detta protokoll syftar till att maximera färskheten kan vissa prover innehålla oönskade vävnader. Till exempel provtas hepatopancreaskanalen och en del mesenteri med bukspottkörteln, och viss peritoneal vävnad, binjurar och urinledare kommer alltid att provtas med de parade njurarna. Om färskheten inte är ett problem kan en mer exakt provtagning uppnås med hjälp av modifierade tekniker.
Organens utseende och läge är jämförbara mellan könen och arterna hos Xenopus. Färgen på vävnaderna varierar dock kraftigt beroende på om djuren har perfunderats eller inte. Det är av denna anledning som bilder av både perfunderade och operfunderade djur ingår.
En begränsning med detta protokoll är att hastighet och reproducerbarhet prioriteras framför att samla in prover som bäst representerar helheten av den önskade vävnaden. Till exempel kan den del av den vänstra loben av levern som provtas här inte på ett adekvat sätt representera alla tre loberna av levervävnad. Om det finns fel i provtagningen påverkas alternativen för felsökning av risken för variation mellan olika vävnadssnitt. Till exempel är det inte känt om den högra leverloben, den högra fettkroppen eller en annan del av huden skulle vara funktionella alternativ till de önskade vävnaderna. I dessa fall bör man vara försiktig med att bygga upp vävnadsdelar med hänsyn till forskningens behov, innan man byter ut vävnadsdelar mot varandra.
En annan begränsning i detta protokoll är att om de djur som provtas har drastiska anatomiska defekter eller kliniskt signifikanta hälsoproblem, kan det hända att organen i coelomikhålan inte ser ut som beskrivet här. Granulom har hittats i vävnader hos grodor infekterade med Mycobacterium spp.11,12, och tidigare fall av ovariellt hyperstimuleringssyndrom verkar leda till en onormal presentation av organ13.
Även om denna metod har utvecklats för laboratorie-Xenopus, finns det betydande likheter i utseendet på dessa organ hos många icke-caecilianska amfibier och lemmade reptiler14. Provtagningsdelen av detta protokoll kan enkelt modifieras för andra modeller, till exempel axolotls eller den gröna anolen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna uppger att de inte har några motstridiga intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH:s OD-anslag R24OD031956. Vi tackar Samantha Jalbert, Jill Ralston och Cora Anderson för deras hjälp och stöd samt vår redaktör och våra anonyma granskare för deras hjälpsamma feedback
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying Glass with LED Light and Stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable Transfer Pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection Tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Iridectomy Scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Sodium Bicarbonate, Powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen Forceps, Serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for Dissecting | Fisher Scinetific | S99385 |
References
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R.
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a Frog (Rana sp.). Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. JoVE. (issue), e65287 (2023).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Trott, K. A., et al. Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis). Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).
- Fremont-Rahl, J. J., et al. Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs. Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).
- Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol. Herpetol. , 35-81 (2009).
