Summary
Dit artikel presenteert een gids voor het bemonsteren van zes belangrijke en diverse organen in volwassen Xenopus die snel en gemakkelijk toegankelijk zijn: de hartkamer, de leverkwab, de alvleesklier, de vetlichamen, de gepaarde nieren en de huid.
Abstract
Xenopus is al meer dan honderd jaar een krachtig modelorganisme voor het begrijpen van de ontwikkeling en ziekten van gewervelde dieren. Hoewel experimentele analyse- en dissectietechnieken van het embryo goed gedocumenteerd zijn, zijn beschrijvingen van volwassen Xenopus-structuren en -organen, samen met technieken voor het werken met volwassenen, niet bijgewerkt om rekening te houden met de vereisten van moderne benaderingen zoals kwantitatieve proteomics en single-cell transcriptomics. De celtype- en gencentrische perspectieven vereisen contrasterende waarnemingen in embryonale stadia met die in volwassen weefsels. De organen van de larve ondergaan aanzienlijke veranderingen in hun algehele structuur, morfologie en anatomische locatie langs de overgang van larval naar volwassene, met name tijdens massale metamorfose-remodellering. Het vaststellen van robuuste normen voor orgaanidentificatie en -dissectie is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat datasets die het resultaat zijn van onderzoeken die in verschillende laboratoria zijn uitgevoerd, consistent kunnen zijn. Het huidige protocol identificeert zes van de organen in de volwassen Xenopus, en demonstreert methoden voor dissectie en bemonstering van de hartkamer, de lever, het vetlichaam, de alvleesklier, de gepaarde nier en de huid van de volwassen Xenopus. Afhankelijk van de conserveringsmethoden kunnen de ontlede organen worden gebruikt voor kwantitatieve proteomics, single cell/nuclei transcriptomics, in situ hybridisatie, immunohistochemie, histologie, enz. Dit protocol heeft tot doel weefselbemonstering te standaardiseren en multi-labonderzoek van de volwassen orgaansystemen te vergemakkelijken.
Introduction
Hoewel de "digitale dissectie" van volwassen Xenopus" beschikbaar is1, blijft repliceerbare orgaan- en weefselbemonstering van volwassen Xenopus een uitdaging zonder de gedetailleerde instructie die beschikbaar is voor andere volwassen modellen (bijv. muizen 2,3,4). Dit artikel is bedoeld om duidelijke richtlijnen te geven voor nauwkeurige en reproduceerbare orgaanbemonstering van volwassen Xenopus, vergelijkbaar met wat momenteel beschikbaar is voor hun larven5. De nadruk wordt gelegd op het gemak van voltooiing om maximale versheid te behouden en het protocol toegankelijk te maken voor alle gebruikers.
Hoewel er een grondige dissectiegids is voor Rana sp.6, evenals tal van klassikale dissectiegidsen voor andere anura's7, is er momenteel geen Xenopus-dissectie- en bemonsteringsgids beschikbaar. Voor degenen die niet bekend zijn met bemonsteringspraktijken of de anatomie van amfibieën, maken de kleine verschillen tussen Xenopus en andere anura's deze bronnen suboptimaal voor repliceerbare weefselbemonstering.
Veel waardevolle weefsels zijn niet opgenomen en worden zelfs weggegooid in de huidige gids; Dit is om de versheid van het weefsel te garanderen. Zes monsters zijn beperkt genoeg om ervoor te zorgen dat deze weefsels kunnen worden verzameld in minder dan een uur nadat het hart begint te kloppen, ongeacht de ervaring of het vaardigheidsniveau van de gebruiker. Meer geavanceerde en gedetailleerde handleidingen voor het verzamelen van vele andere weefsels zijn in voorbereiding als afzonderlijke begeleidende papieren.
Voor minder ervaren gebruikers wordt altijd aanbevolen om dit protocol eerst uit te proberen op dieren die worden geëuthanaseerd om andere redenen dan experimenten, voordat dieren worden bemonsterd die moeilijk te vervangen zijn (d.w.z. transgenen, dieren van hoge leeftijd, enz.). Idealiter zijn alle bemonsterde dieren gezond en, als ze vrouwelijk zijn, hebben ze de afgelopen twee weken geen eisprong gehad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van de Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3). De representatieve resultaten worden getoond voor zowel een geperfuseerde als een niet-geperfuseerde volwassen albino man Xenopus laevis.
1. Experimentele voorbereiding
OPMERKING: Als perfusieprotocol8 wordt gevolgd vóór de bemonstering, ga dan verder met stap 2.2.
- Zorg ervoor dat de onderzoeksinstelling de in dit protocol beschreven euthanasietechniek heeft goedgekeurd.
- Bereid een oplossing van 5 g/l MS-222 (tricaïne, methaansulfonaat) en 5 g/l natriumbicarbonaat (zie materiaaltabel). Het volume moet groter zijn dan het volume dat nodig is om de dieren die worden geëuthanaseerd volledig te bedekken. Controleer de pH om er zeker van te zijn dat deze ≥7 is.
- Primaire euthanasie uitvoeren door de Xenopus in de euthanasieoplossing te plaatsen; Het dier blijft in totaal 1 uur onder water.
- Stel het dissectiestation zo in dat alle weefsels onmiddellijk na de bemonstering kunnen worden gespoeld in gekoeld PBS of 0,7x PBS9 (afhankelijk van de experimentele behoeften), gecontroleerd en bijgesneden onder een vergrotingslicht van 5x (of hoger). Dit station moet de gebruiker ook in staat stellen om alle tangen en scharen te vervangen of schoon te vegen tussen gebruik.
- Zodra de kikker 1 uur in de oplossing is geweest, is de primaire euthanasie voltooid. Verwijder de straal en controleer het verlies van pijnrespons door een voetknijp uit te voeren.
- Noteer de juiste details voor het dier, zoals soort, stam, geslacht, leeftijd en gezondheidstoestand, en of het is doorbloed. Weeg de Xenopus en voer eventuele aanvullende metingen uit, zoals de lengte van de snuit-vent.
- Leg de kikker op zijn rug en speld de ledematen proximaal van het lichaam vast (Figuur 1).
- Knip met een dissectieschaar door de huid, langs de middellijn en vervolgens lateraal, waarbij u twee flappen maakt.
- Verwijzend naar figuur 2, identificeer de linea alba en gebruik een tang om deze vast te pakken en weg te trekken van de coelomische holte. Knip voorzichtig met een schaar door de spiermassa. Maak twee flappen van de spouwmuur. Knip of speld alle flappen uit de weg.
- Identificeer het hart dat nog zal kloppen. Gebruik een ontleedschaar om de coracoïde botten te verkleinen (Figuur 2) om een betere toegang tot het hart te krijgen.
OPMERKING: Als het hart is gestopt met kloppen vóór de bemonstering, moet worden opgemerkt dat de versheid van het monster in het gedrang is gekomen.
2. Bemonstering
OPMERKING: Als het dier is doorbloed, ga dan verder met stap 2.2.
- Identificeer het dunne hartzakje en trek het strak met een weefselpincet (Figuur 3).
- Perforeer met de punt van de iridectomieschaar voorzichtig het hartzakje en zorg ervoor dat u de onderliggende weefsels niet doorsnijdt. Schil het hartzakje weg, weg van de 3 kamers van het hart.
- Gebruik een pincet om het ventrikel bij de apex vast te pakken, identificeer waar het vastzit aan de oorschelpen en de arteriële romp (Figuur 4) en snijd het onder deze aanhechtingen door (Figuur 5). Snijd indien nodig het ventrikel bij zodat er geen weefsel uit de oorschelpen of arteriële romp zichtbaar is en er nog steeds lichtgekleurd klepweefsel zichtbaar is in het ventrikel.
OPMERKING: Bij niet-geperfuseerde dieren kan het verwijderen van de ventrikel kwalificeren als secundaire euthanasie. - De 3 lobben van de lever zullen zichtbaar zijn (Figuur 6 en Figuur 7). Pak de lip van de linkerkwab vast (aan de rechterkant van de kijker) en til deze voorzichtig op zodat de lever- en cystische kanalen zichtbaar zijn (Figuur 8). Bemonstering van de onderste 1/3 van de lob onder deze hulpstukken (Figuur 9).
- Om betere toegang te krijgen tot de weefsels van een vrouwelijke kikker, is het nuttig om de eierstok te verwijderen. Identificeer de eierstok die is omhuld door een laag visceraal peritoneum dat het kiemepitheel wordt genoemd. Verschuif de lobben voorzichtig totdat ze zich op hun respectieve zijden bevinden om het bevestigingsgebied zichtbaar te maken (Figuur 10). Deze aanhechtingen zijn direct ventraal ten opzichte van de gepaarde nier.
- Verwijder met een schaar de eierstokken zo dicht mogelijk bij de nieren zonder ze te beschadigen (Figuur 11).
- Inspecteer de mediale kwab (ook wel de voorkwab genoemd) van de lever en merk op hoe deze verbinding maakt met de maag en de twaalfvingerige darm via het mesenterium en de ductus hepatopancreatica (ook wel het gemeenschappelijke galkanaal genoemd) (Figuur 6, Figuur 7 en Figuur 8).
- Snijd het mesenterium, het hepatoduodenale ligament door met een iridectomieschaar en het hepatopancreatische kanaal waar het de twaalfvingerige darm ontmoet. Verbreek de verbinding van de alvleesklier en de ductus hepatopancreatica met de mediale kwab van de lever, zodat er geen donker leverweefsel aan vastzit (figuur 12).
- Pak de maag vast met een getande tang en het bovenste uiteinde van de alvleesklier met een weefseltang. Onder een vergroting van 5x plaag je de alvleesklier voorzichtig van de maag (Figuur 13).
OPMERKING: Als het niet schoon wegkomt, is het resterende pancreasweefsel zichtbaar en kan het in fragmenten worden verwijderd. Als alternatief kan de alvleesklier methodisch worden losgemaakt met behulp van een iridectomieschaar en een weefselpincet. - Identificeer aan de hand van figuur 14A de urineblaas en verwijder deze, waarbij u zo dicht mogelijk bij de cloaca snijdt. Gooi dit zakdoekje weg.
- Identificeer aan de hand van figuur 14B de dikke darm en trek deze strak om de dikke darm zo dicht mogelijk bij de cloaca door te snijden. Verwijder en gooi het hele spijsverteringskanaal weg, snijd het buikvlies door waar het aan de milt hecht. De vetlichamen zullen nu volledig toegankelijk zijn.
- Plaag de vetlichamen uit elkaar zodat ze op hun respectievelijke zijden liggen. Het gebied boven de nier, waar het vetlichaam aansluit op het buikvlies, zal zichtbaar zijn. Pak de basis van het linker vetlichaam vast (aan de rechterkant van de kijker) en gebruik een schaar om het weg te knippen van het buikvlies, waarbij u een kleine marge overlaat zodat de nier niet wordt beschadigd (Figuur 15).
- Verwijder het resterende vetlichaam en gooi het weg. De gekoppelde nieren zijn nu volledig zichtbaar.
- Bij vrouwelijke kikkers of mannetjes met duidelijke rudimentaire eileiders, pak je een eileider vast en trek je deze weg van de nier en cloaca (Figuur 16). Snijd de eileider door waar deze de cloaca ontmoet en blijf deze wegtrekken van de nier, waarbij u eventuele duidelijke peritoneale aanhechtingen doorsnijdt zodra deze duidelijk worden. Gooi dit zakdoekje weg.
- Herhaal dit proces met de resterende eileider.
- De nieren zijn nog steeds bedekt met helder buikvlies (retroperitoneaal)10. Gebruik een tang om de nieren vast te pakken en snijd het buikvlies aan hun inferieure uiteinde door.
- Til de nieren uit de coelomische holte en gebruik een schaar om het buikvlies zo dicht mogelijk bij de nieren door te snijden zonder ze te beschadigen (Figuur 17).
- Snijd onder een vergroting van 5x overtollig buikvlies en ander achtergebleven weefsel (vetlichamen, milt) weg. Als de kikker een vrouwtje is, zorg er dan voor dat eventueel achtergebleven eierstokweefsel wordt verwijderd (Figuur 18). Als de kikker een mannetje is, verwijder dan voorzichtig de testis en controleer op een rudimentaire eileider, die mogelijk niet zichtbaar is zonder vergroting (Figuur 19).
- Verwijder de pinnen van het dier, draai het op zijn ventrum en speld de ledematen van het dier opnieuw vast.
- Selecteer een van de achterpoten om van te bemonsteren en speld de voet van die ledemaat vast.
- Verwijder een amandelvormige huidflap van over de gastrocnemius/tibiofibula (figuur 20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door gebruik te maken van figuur 1 tot figuur 20 en alle stappen van dit protocol te volgen, werden de hartkamer, de linker leverkwab, de alvleesklier, de linker vetlichamen, gepaarde nieren en een huidflap binnen een uur na euthanasie netjes weggesneden. Binnen deze tijd worden de monsters gespoeld en bijgesneden zodat ze verschijnen, zoals weergegeven in figuur 21.
Figuur 1: Vastgezette Xenopus. Een volwassen vrouwtje X. tropicalis vastgepind door elke ledemaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Buikwand. De ventrale huid van een X. tropicalis vrouwtje is in flappen gesneden, waardoor de linea alba en coracoïde botten zichtbaar worden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Pericardium omsloten hart. De top van het hartventrikel wordt door het hartzakje gegrepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Hartventrikel en arteriële romp. Het ventrikel van een geperfuseerde X laevis wordt vastgegrepen en toont zijn gehechtheid aan de arteriële stam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Hartdiagram. Een diagram van de relevante structuren van het hart met een stippellijn die aangeeft waar het ventrikel moet worden bemonsterd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Hepatopancreatisch diagram. Een diagram van de 3 lobben van de lever, alvleesklier en bijbehorende organen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Hepatopancreatische organen. Een geperfundeerd, albino X. laevis mannetje met 3 lobben van lever, alvleesklier en bijbehorende organen gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Cystische en leverkanalen. De linkerkwab van de lever wordt opgetild om de cystische en leverkanalen bij geperfuseerde X. laevis te tonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Leverbemonstering. De linker leverkwab van een niet-geperfuseerde X. tropicalis is doorgesneden onder de aanhechtingen van de leverkanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Aanhechting van de eierstok. Met de eierstoklobben aan hun respectievelijke zijden is de continuïteit van het kiemepitheel naar de peritoneale wand (over de nieren) zichtbaar. Twee witte stippellijnen geven aan waar deze bijlagen moeten worden verbroken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Verwijdering van de eierstokken. De eierstok van een niet-geperfuseerde X. laevis wordt weggetrokken van de gepaarde nieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12: Mesenterium incisies. De coelomische holte van een niet-geperfuseerde X. laevis, na de bemonstering van de hartkamer en de linkerkwab van de lever, evenals de verwijdering van de eierstok. Een witte stippellijn geeft aan waar het hepatopancreatische ligament en kanaal moeten worden doorgesneden, terwijl een groene stippellijn aangeeft waar de alvleesklier van de mediale kwab van de lever moet worden doorgesneden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 13: Bemonstering van de alvleesklier. De alvleesklier van een niet-geperfuseerde X. laevis wordt uit de maag geplaagd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 14: Orgaanverwijdering. (A) De urineblaas van een niet-geperfuseerde X. laevis wordt weggetrokken van de cloaca met een stippellijn die aangeeft waar deze moet worden doorgesneden. (B) De dikke darm van een niet-geperfuseerde X. laevis wordt weggetrokken van de cloaca met een stippellijn die aangeeft waar deze moet worden doorgesneden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 15: Bemonstering van het vetlichaam. De vetlichamen, bevestigd aan het buikvlies aan het bovenste uiteinde van de gepaarde nieren, worden uit de coelomische holte getrokken met een stippellijn die aangeeft waar ze moeten worden gesneden. Merk op dat naast deze aanhechting deze mannelijke X. tropicalis 1 testis heeft, evenals een paar verschillende rudimentaire eileiders. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 16: Verwijdering van de eileider. De eileider van een geperfuseerde X. laevis wordt weggetrokken van de gepaarde nier, waardoor het heldere buikvlies zichtbaar wordt. Een stippellijn geeft aan waar het buikvlies moet worden ingesneden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 17: Afname van de nieren. De gepaarde nieren van een niet-geperfuseerde X. laevis worden uit de coelomische holte getild. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 18: Trimmen van de nieren. (A) Een ventrale weergave van de gepaarde nier van een niet-doorbloed vrouwtje X. laevis met bijbehorende buikvliesorganen eraan. (B) Dezelfde nier waarvan de bijbehorende organen zijn verwijderd, maar waarvan er nog wat buikvliesweefsel overblijft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 19: Verwijdering van de testikels. De gepaarde nieren van niet-geperfuseerde X. tropicalis met één testis verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 20: Bemonstering van de huid. (A) De rechterpoot van een X. tropicalis met een stippellijn die het te bemonsteren huidgebied aangeeft. (B) De rechterpoot van een X. tropicalis met een huidmonster dat over de tibiofibula is verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 21: Representatieve resultaten van orgaanbemonstering. Monsters van hartventrikel, lever, pancreas, vetlichaam, gepaarde nier en huid genomen van een geperfuseerde en niet-geperfuseerde albino X. laevis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omdat dit protocol tot doel heeft de versheid te maximaliseren, kunnen sommige monsters ongewenste weefsels bevatten. Het hepatopancreatische kanaal en een deel van het mesenterium worden bijvoorbeeld bemonsterd met de alvleesklier, en een deel van het buikvliesweefsel, de bijnieren en de urineleiders zullen altijd worden bemonsterd met de gepaarde nieren. Als versheid geen probleem is, kan een nauwkeurigere bemonstering worden bereikt met behulp van gewijzigde technieken.
Het uiterlijk en de locatie van organen zijn vergelijkbaar tussen geslachten en soorten van Xenopus. De kleur van weefsels varieert echter aanzienlijk, afhankelijk van het feit of de dieren al dan niet zijn doorbloed. Het is om deze reden dat afbeeldingen van zowel doorbloede als niet-doorbloede dieren zijn opgenomen.
Een beperking van dit protocol is dat snelheid en reproduceerbaarheid voorrang krijgen op het verzamelen van monsters die het geheel van het gewenste weefsel het beste vertegenwoordigen. Het deel van de linkerkwab van de lever dat hier wordt bemonsterd, kan bijvoorbeeld niet alle drie de lobben van leverweefsel adequaat vertegenwoordigen. Als er fouten zijn in de bemonstering, worden de opties voor het oplossen van problemen beïnvloed door de mogelijkheid van variatie tussen verschillende delen van het weefsel. Het is bijvoorbeeld niet bekend of de rechterkwab van de lever, het juiste vetlichaam of een ander deel van de huid functionele alternatieven zouden zijn voor de gewenste weefsels. In deze gevallen moet discretie worden gebruikt, op basis van de behoeften van het onderzoek, voordat delen van het weefsel worden vervangen.
Een andere beperking van dit protocol is dat als de dieren die worden bemonsterd drastische anatomische defecten of klinisch significante gezondheidsproblemen hebben, de organen in de coelomische holte er mogelijk niet uitzien zoals hier beschreven. Granulomen zijn gevonden in de weefsels van kikkers die zijn geïnfecteerd met Mycobacterium spp.11,12, en eerdere gevallen van ovarieel hyperstimulatiesyndroom lijken te leiden tot een abnormale presentatie van organen13.
Hoewel deze methode is ontwikkeld voor Xenopus in het laboratorium, zijn er significante overeenkomsten in het uiterlijk van deze organen bij veel niet-caeciliaanse amfibieën en reptielen met ledematen14. Het bemonsteringsgedeelte van dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor andere modellen, zoals axolotls of de groene anolis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de OD-subsidie van de NIH R24OD031956. We danken Samantha Jalbert, Jill Ralston en Cora Anderson voor hun hulp en steun, evenals onze redacteur en anonieme peer reviewers voor hun nuttige feedback
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying Glass with LED Light and Stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable Transfer Pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection Tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Iridectomy Scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Sodium Bicarbonate, Powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen Forceps, Serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for Dissecting | Fisher Scinetific | S99385 |
References
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R.
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a Frog (Rana sp.). Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. JoVE. (issue), e65287 (2023).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Trott, K. A., et al. Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis). Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).
- Fremont-Rahl, J. J., et al. Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs. Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).
- Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol. Herpetol. , 35-81 (2009).
