Summary
Den decellulariserade mjältmatrisen (DSM) har lovande tillämpningar inom området levervävnadsteknik. Detta protokoll beskriver proceduren för att förbereda DSM på råtta, vilket inkluderar skörd av råttmjälte, decellularisering av dem genom perfusion och utvärdering av den resulterande DSM för att bekräfta dess egenskaper.
Abstract
Levertransplantation är den primära behandlingen för leversjukdom i slutstadiet. Bristen på donerade organ och den otillräckliga kvaliteten på dem gör det dock nödvändigt att utveckla alternativa behandlingar. Bioartificiella lever (BALs) som använder decellulariserad levermatris (DLM) har dykt upp som lovande lösningar. Det är dock fortfarande en utmaning att hitta lämpliga DLM:er. Användningen av en decellulariserad mjältmatris (DSM) har utforskats som en grund för BALs, vilket erbjuder ett lättillgängligt alternativ. I denna studie skördades och decellulariserades råttmjälte med hjälp av en kombination av frys-upptiningscykler och perfusion med decellulariseringsreagenser. Protokollet bevarade mikrostrukturerna och komponenterna i den extracellulära matrisen (ECM) inom DSM. Den fullständiga decellulariseringsprocessen tog cirka 11 timmar, vilket resulterade i en intakt ECM inom DSM. Histologisk analys bekräftade avlägsnandet av cellulära komponenter samtidigt som ECM:s struktur och sammansättning bibehölls. Det presenterade protokollet ger en omfattande metod för att erhålla DSM, vilket erbjuder potentiella tillämpningar inom levervävnadsteknik och cellterapi. Dessa fynd bidrar till utvecklingen av alternativa metoder för behandling av leversjukdom i slutstadiet.
Introduction
Levertransplantation är fortfarande den enda definitiva behandlingen för leversjukdom i slutstadiet 1,2,3. Den kritiska bristen och den sjunkande kvaliteten på donerade organ har dock ökat behovet av alternativa behandlingar4. Inom regenerativ medicin har bioartificiella lever (BAL) som använder decellulariserad levermatris (DLM) dykt upp som lovande lösningar 5,6,7. DLM bevarar den ursprungliga leverstrukturen, inklusive dess intrikata mikrovaskulära nätverk och komponenter i ECM, och erbjuder en ställning för att skapa transplanterbara BAL:er som potentiellt kan lindra leversjukdomar.
Trots löftet står införandet av denna teknik inför utmaningar, särskilt när det gäller att hitta lämpliga DLM:er. DLM:er som härrör från människor är en bristvara, medan de från animaliska källor medför risker för sjukdomsöverföring och immunavstötning. I ett innovativt tillvägagångssätt har vår forskning utforskat användningen av en decellulariserad mjältmatris (DSM) som grund för BALs 8,9,10,11. Mjälte är mer lättillgängligt i olika medicinska situationer, såsom portal hypertoni, traumatisk ruptur, idiopatisk trombocytopen purpura och donation efter hjärtdöd. Därför är mjälte mer allmänt tillgänglig än lever för forskningsändamål. Patienter som har genomgått splenektomi lider inte av allvarliga tillstånd, vilket ytterligare bekräftar att mjälten är överflödig. Mjältens mikromiljö, särskilt den extracellulära matrisen och sinusformerna, liknar den i levern. Detta gör mjälten till ett lämpligt organ för celladhesion och proliferation i forskning om hepatocyttransplantation. Baserat på dessa resultat har våra tidigare undersökningar visat att DSM delar jämförbara mikrostrukturer och komponenter med DLM och kan stödja överlevnad och funktion av hepatocyter, inklusive albumin- och ureaproduktion. Dessutom har DSM visat sig förbättra den hepatiska differentieringen av benmärgens mesenkymala stamceller, vilket leder till förbättrad och konsekvent funktionalitet.
Genom att använda DSM behandlade med heparin har vi konstruerat funktionella BAL:er som kan uppvisa effektiv kortvarig antikoagulation och partiell leverfunktionskompensation11. Följaktligen är denna tredimensionella DSM mycket lovande för utvecklingen av levervävnadsteknik och cellterapi. I detta arbete presenterar vi detaljerade metoder för att skörda råttmjälte och förbereda DSM som bevarar mikrostrukturerna och komponenterna i ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av kommittén för etik vid djurförsök vid Xi'an Jiaotong University och utfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur.
1. Skörd av mjälte
- Använd hanråttor av typen Sprague Dawley som väger 250-280 g. Håll råttorna i rum med kontrollerad temperatur och luftfuktighet och ge dem mat och vatten ad libitum, med undantag för fasta före operationen.
- Injicera buprenorfin subkutant (0,05 ml/kg) som smärtstillande medel 1 timme före operation. Bedöva råttan genom inandning av isofluran. Använd en flödeshastighet på 1,5 L/min av 5% isofluran för induktionsanestesi i en plexiglaslåda och upprätthåll anestesi med en flödeshastighet på 0,6-0,8 L/min av 2% isofluran genom en mask. Bekräfta anestesidjupet genom att nypa ihop tårna.
- Använd en elektrisk rakapparat för att raka huden över hela buken. Fäst råttan på rygg på operationsbordet. Injicera 2 ml hepariniserad koksaltlösning (1 000 U heparin) via penisvenen dorsal för att uppnå systemisk antikoagulering. Desinficera den rakade huden med en povidon-jodlösning och täck med en steril draperingsduk.
- Gör ett korsformat snitt med en kirurgisk sax i buken, exponera bukhålan genom att sträcka ut med den hemostatiska pincetten och vänd levern mot diafragman. Exteriorisera mag-tarmkanalen till höger sida av buken och täck den med fuktig gasbinda.
- Separera och skär försiktigt av det mjältiga ligamentet för att exponera mjältens hilum.
OBS: Mjälten, som ser ut som en rödaktig långsträckt struktur, cirka 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm i storlek, kan identifieras i vänster buk. - Separera och exponera gradvis den gemensamma leverartären, gastroduodenalartären och mjältartären genom att dissekera längs mjältens hilum. Legat och skär av gastroduodenalartären och den gemensamma leverartären samtidigt som den omgivande vävnaden gradvis dissocieras.
- Vänd mjälten mot höger sida för att exponera bukaortan. Utför försiktigt trubbig dissektion och exponera bukaortan och celiaki med hjälp av bomullspinnar. Placera en 3-0 silkessutur, cirka 3 cm lång, över och under grenarna på celiakistammen, och placera en 6-0 silkessutur, cirka 10 cm lång, vid grenen av celiakistammen.
- Ligatur: bukaortan under och ovanför grenarna i celiakistammen. Gör ett litet snitt vid artärgrenen. Lyft försiktigt 6-0 silkessuturen, för in en 24 G venkateter i mjältartären längs celiakistammen och ligera och säkra den.
- Använd en sprutpump med en hastighet av 4 ml/min, infundera hepariniserad normal koksaltlösning (25 E/ml) med en volym av 50 ml. Skär samtidigt av portvenen som en utflödeskanal för att tillåta den infunderade vätskan att flöda ut ur mjälten. Djuret avlivas genom avblodning.
- Dissekera försiktigt den omgivande vävnaden i mjälten och undvik skador på bukspottkörteln, samtidigt som du bevarar de viktigaste tillbehörskärlen.
- Kontrollera om det finns något läckage runt mjälten, ta sedan bort mjälten och bukspottkörteln och skölj dem i vanlig koksaltlösning.
OBS: Mjälten och bukspottkörteln hos råttor är nära sammankopplade, med bukspottkörteln som omsluter mjältartären. Om mjälten avlägsnas separat kan det vara svårt att ligera många små blodkärl. Vid denna procedur avlägsnas mjälten tillsammans med bukspottkörteln. Efter decellularisering blir mjälten och bukspottkörteln genomskinliga och mikrokärlen är synliga, vilket underlättar bevarandet av mjälten med intakta blodkärl. - Överför mjälten till ett 50 ml centrifugrör fyllt med vanlig koksaltlösning och förvara den i en frys på -80 °C.
OBS: Mjälten och venkatetern som förs in i mjältartären kommer att kryokonserveras tillsammans för bekväm anslutning under perfusionsexperimenten.
2. Decellularisering av mjälte
- Upprepa frys-upptiningscykeln 3 gånger i en steril behållare för att lysera mjältcellerna.
OBS: Frys-upptiningscykeln är en fysikalisk metod som används för avcellularisering av ställningar. Mjältvävnaden placeras i en frys på -80 °C över natten för frysning, tas sedan bort från miljön med låg temperatur och placeras i ett rumstempererat eller 37 °C vattenbad för upptining. Denna frys- och upptiningsprocess upprepas 3-6 gånger, vilket stör cellmembranen och leder till celllys. - Installera ett perfusionssystem i en ren bänk som består av en peristaltisk pump, en 2 L behållare, ett silikonrör med en innerdiameter på 2,4 mm och en bubbelfälla (figur 1).
- Fyll perfusionssystemet med avjoniserat vatten (ddH2O) och håll det igång i 10 minuter.
- Överför försiktigt den skördade mjälten till den ddH2O-fyllda behållaren.
- Anslut silikonslangen till venkatetern som har förts in i mjältartären.
- Starta perfusion med ddH2O med en hastighet av 2 ml/min i 30 minuter.
- Fortsätt perfusionen med ddH2O med en hastighet av 4 ml/min i 30 minuter.
- Perfundering med 0,1 % (w/v) SDS-lösning i 4 timmar.
- Perfundera med 1% (v/v) Triton X-100 lösning i 2 timmar.
- Utför med PBS med en hastighet av 4 ml/min i 4 timmar för att tvätta DSM.
OBS: Använd den peristaltiska pumpen för enkelriktad perfusion av alla vätskor. - Efter att perfusionen är klar, ligerar och transekterar de vaskulära grenarna mellan bukspottkörteln och mjälten och tar sedan bort bukspottkörteln. Förvara DSM i ett rent och förseglat 50 ml centrifugrör indränkt i PBS som innehåller 10 % penicillin-streptomycin vid -20 °C tills den är redo att användas för framtida experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll använde en kombination av upprepade frys-upptiningscykler och perfusion med decellulariseringsreagens för decellularisering av råttmjälte. Den fullständiga decellulariseringen av mjälten uppnåddes inom cirka 11 timmar (Figur 2A). Under hela decellulariseringsprocessen övergick mjältens färg gradvis från djupröd till en fläckig, ljusröd och så småningom ett vitt genomskinligt utseende (Figur 2B). Den övergripande morfologin förblev relativt intakt, med synliga kärlstrukturer (Figur 2B).
Hematoxylin-eosinfärgning bekräftade avlägsnandet av cellulära komponenter, vilket avslöjade en intakt ECM inom DSM. Detta står i skarp kontrast till den naturliga mjälten, som avbildas i figur 3A, där cellulära kärnor och cytoplasmatiska element är synliga. Frånvaron av celler bekräftades ytterligare genom 4',6-diamidino-2-fenylindolfärgning (DAPI) och mätning av kvarvarande DNA (DSM: 10,1 ± 4 ng/mg torrvikt, naturlig mjälte: 6 200 ± 300 ng/mg torrvikt). Svepelektronmikroskopiska bilder avslöjade den ultrastrukturella karakteriseringen av DSM, som visade en bikakestruktur efter fullständigt avlägsnande av lymfocyter från mjälten (Figur 3C). Detta indikerade att decellulariseringen av mjälten bevarade den normala mjältens ultrastruktur och arkitektur. För en mer omfattande utvärdering av de avgörande ECM-proteinerna som finns inom DSM användes Masson trikrom (Figur 3B) och immunofluorescensfärgning. Specifikt var kollagen I (Figur 3D) och fibronektin (Figur 3E) måltavlor för analys. Resultaten indikerade att både strukturella och basalmembrankomponenter i ECM bibehölls på samma sätt som den ursprungliga mjälten.
Figur 1: Den experimentella uppställningen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Arbetsflödet för decellularisering och grova morfologiska förändringar. (A) Arbetsflödet för förberedelse av decellulariserad mjältmatris. Den fullständiga decellulariseringen av mjälten uppnåddes inom cirka 11 timmar. (B) Bruttomorfologiska förändringar av mjälten under beredningen av DSM. Under denna process övergick mjältens färg gradvis från djupröd till en fläckig, ljusröd och så småningom ett vitt genomskinligt utseende. (B) 1. Efter upprepade frys-upptiningscykler och före decellularisering. 2. Efter sköljning med avjoniserat vatten i 1 timme. 3. Efter perfusion med SDS i 4 timmar. Efter perfusion med Triton i 2 timmar. Förkortningar: DSM = decellulariserad mjältmatris; SDS = natriumdodecylsulfat; PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning; PS = penicillin-streptomycin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Morfologiska observationer av den decellulariserade mjältmatrisen. (A) H&E-färgning; (B) Masson trikrom färgning; c) SEM. (D,E) Immunofluorescensfärgning av kollagen I och fibronektin; (F) DAPI-färgning. Skalstänger = 50 μm (A, B, D-F), 5 μm (C). Förkortningar: DSM = decellulariserad mjältmatris; H&E = hematoxylin-eosin; SEM = svepelektronmikroskopi; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BAL:erna utgör ett effektivt tillvägagångssätt för behandling av leversjukdom i slutstadiet, särskilt i de fall där levertransplantation hindras av den nuvarande bristen på doneradeorgan. Ett lovande alternativ för att skapa BAL är användningen av DLM, som bevarar den naturliga leverns naturliga ECM och vaskulära struktur. Bristen på DLM hos människor och de potentiella riskerna för infektion och immunogenicitet i samband med DLM hos djur utgör dock betydande begränsningar. För att ta itu med denna utmaning föreslår vi en ny strategi som innebär att man använder en decellulariserad mjältmatris (DSM) som en alternativ ställning för BAL 8,9,10,11. Mjälte är mer lättillgängligt i olika kliniska scenarier och uppvisar liknande egenskaper som lever. I detta arbete presenterar vi detaljerade metoder för att skörda råttmjälte och förbereda DSM som bevarar mikrostrukturerna och komponenterna i ECM.
En idealisk decellulariseringsmetod skulle ta bort cellulära komponenter samtidigt som den ursprungliga strukturen, sammansättningen och de mekaniska egenskaperna hos ECM 12,13,14 bibehålls. Decellulariseringsmetoder omfattar fysiska, kemiska och enzymatiska behandlingar, var och en med sina distinkta fördelar och nackdelar15. Även om dessa metoder delvis kan ta bort cellulära komponenter, kan de också äventyra sammansättningen, strukturen och funktionaliteten hos den återstående ECM. Kvaliteten på decellulariseringen kan påverkas av variationer i celldensitet, matristjocklek och vävnadsmorfologi mellan olika vävnadskällor.
Hittills finns det ingen guldstandard för decellulariseringsprocessen. Vanligtvis är det otillräckligt att bara använda någon av dessa metoder för att minimera negativa effekter på ECM och maximera avlägsnandet av cellulärt innehåll. Följaktligen är det mest effektiva tillvägagångssättet beroende av vävnadens egenskaper, vilket kräver en kombination av dessa metoder. I denna studie använde vi ett protokoll som kombinerade fysikaliska metoder (frys-upptiningscykler och perfusion) med kemiska metoder (SDS och TritonX-100) för att decellularisera råttmjälte.
Frys-upptiningscyklerna främjar celllys och snabb lossning av celler från ECM16. Samtidigt förbättrar perfusion genom den naturliga vaskulaturen avsevärt decellulariseringseffektiviteten och bevarar det ursprungliga vaskulära nätverket17. Natriumdodecylsulfat (SDS), som fungerar som ett joniskt rengöringsmedel, löser skickligt upp både cell- och kärnmembran, vilket leder till ett mer omfattande avlägsnande av cytoplasmatiska och nukleära komponenter. Denna process orsakar dock också skador på ECM-ultrastrukturen på grund av utarmningen av glykosaminoglykaner (GAG) och kollagen.
Förhöjda koncentrationer av SDS korrelerade med minskat kvarvarande DNA-innehåll och minskad mekanisk hållfasthet i ECM-ställningen. Omvänt bevarade lägre koncentrationer av SDS en större mängd kollagen och inducerade mindre denaturering av ECM-proteiner. Däremot fungerar Triton X-100, som fungerar som ett nonjoniskt rengöringsmedel, effektivt lipid-lipid-, lipid-protein- och DNA-proteininteraktioner, vilket erbjuder ett mildare tillvägagångssätt för upplösning av cellmembran. Ändå visar det sig vara otillräckligt för att fullständigt avlägsna cellkärnor och DNA. Därför måste det kombineras med låga koncentrationer av SDS och fysikaliska behandlingar för att säkerställa fullständigt avlägsnande av cellulära komponenter samtidigt som ECM:s ursprungliga struktur, sammansättning och prestanda bevaras. Det är viktigt att notera att rester av rengöringsmedel kan ha viss cytotoxicitet, så sköljning efter behandling med sterilt PBS eller destillerat vatten är nödvändig före förvaring.
En begränsning med detta protokoll är frånvaron av kvantifiering för kvarvarande SDS och Triton X-100. Detta beslut bygger på både vårt teams erfarenhet och bekräftande rapporter, som tyder på att en 4 timmars PBS-tvätt är tillräcklig för att effektivt avlägsna dessa ämnen. Dessutom har våra tidigare cellodlingsexperiment med detta protokoll inte visat några tecken på cytotoxicitet. För att minimera protokollets kostnader gjordes ett medvetet val att avstå från kvantifiering av kvarvarande tvättmedel.
Sammanfattningsvis presenterar detta protokoll en genomförbar metod för framställning av DSM, som visar effektivitet, stabilitet och minimal invasivitet. De DSM:er som utarbetas med hjälp av detta protokoll upprätthåller mjältens inneboende arkitektur, sammansättning och naturliga vaskulära nätverk. Dessutom erbjuder det en ställning för cellimplantation och tredimensionell dynamisk odling, vilket skapar en grund för att främja undersökningar i vävnadskonstruerad lever.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inte deklarerat några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (82000624), Natural Science Basic Research Program of Shaanxi (2022JQ-899 & 2021JM-268), Shaanxi Province Innovation Capability Support Program (2023KJXX-030), Shaanxi Province Key R&D Plan University Joint Project-Key Project (2021GXLH-Z-047), Institutional Foundation of The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University (2021HL-42 & 2021HL-21).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
References
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).
- Somuncu, Ö
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
