Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)
Summary
Dieses Video zeigt neue Kultur, eine Methode, durch die Hühnerembryonen außerhalb der Eizelle bis zu 24 h kultiviert. Diese Methode ermöglicht ein bis frühen Entwicklung (Primitivstreifens bis 14 som.), Ein Zeitraum entsprechend E7-9 in der Maus zu studieren. Anwendungen dieser Technik sind die Elektroporation, in situ Hybridisierung und Immunhistochemie.
Abstract
Der Hühnerembryo ist ein wertvolles Werkzeug in der Studie der frühen Embryonalentwicklung. Seine Transparenz, Zugänglichkeit und einfache Handhabung machen ihn zu einem idealen Werkzeug zur Untersuchung der Bildung und Strukturierung des Gehirns, Neuralrohr, Somiten und Herz Primordien. Anwendungen von Hühnerembryonen Kultur gehören die Elektroporation von DNA-oder RNA-Konstrukte, um Genfunktionen, Transplantate growth factor Kügelchen wie FGFs und BMPs sowie whole mount in situ Hybridisierung und Immunhistochemie analysiert. Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte in Hühnerembryo Kultur; Erste, der Embryo in Kochsalzlösung explantiert. Dann wird der Embryo auf einem Glasring zentriert. Die Membranen um den Embryo sind die Wände entlang des Rings aufgehoben. Der Ring wird dann in einer Kulturschale mit einem Pool von Albumin platziert. Die Kulturschale wird verschlossen und in einer feuchten Kammer, wo der Embryo bis zu 24 Stunden kultiviert. Schließlich ist der Embryo vom Ring entfernt, fixiert und für weitere Anwendungen. Ein Leitfaden für die Fehlersuche wird ebenfalls vorgestellt.
Protocol
Discussion
Die neue Kultur-Methode 2 kann für eine Vielzahl von Anwendungen, von der Transplantate Wachstumsfaktor mit Perlen 3, um whole mount in situ Hybridisierung und Immunhistochemie ganze Berg 4 verwendet werden. Kultur über einen 24-Stunden-Periode ermöglicht die kontinuierliche Überwachung der embryonalen Entwicklung in Anwendungen wie Zeitraffer Zellbewegung Analyse 5 oder Überwachung von GFP mit elektroporiert Konstrukte 6.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Margaret M. Alkek Stiftung RHF unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
Referências
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
