Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)
Summary
Это видео демонстрирует новую культуру, метод, которым куриные эмбрионы культивируются вне яйца на срок до 24 час. Этот метод позволяет исследовать раннего развития (первичной полоски до 14 сом.), Период, соответствующий E7-9 в мышь. Применение этого метода относятся электропорация, на месте гибридизации и иммуногистохимии.
Abstract
Куриного эмбриона является ценным инструментом для изучения раннего эмбрионального развития. Его прозрачность, доступность и легкость манипуляций, делают его идеальным инструментом для изучения формирования и структурирования головного мозга, нервной трубки, сомитов и сердце зачатков. Применение куриных эмбрионов культуры включают электропорации ДНК или РНК конструкций для анализа функции гена, трансплантаты фактора роста покрыты бисером, таких как FGFs и БМП, а также целые горы на месте гибридизации и иммуногистохимии. Это видео демонстрирует различные этапы на куриных эмбрионов культуры; Во-первых, эмбрион эксплантированных в солевом растворе. Затем эмбрион сосредоточена на стеклянное кольцо. Мембраны, окружающие эмбрион поднимаются вдоль стенок кольца. Кольцо затем помещены в культуре блюдо с пулом альбуминовой. Культуры блюдо закрывают и помещают во влажную камеру, где эмбрион культивировали в течение до 24 часов. Наконец, эмбрион удаляется из кольца, фиксированная и обработаны для дальнейшего применения. Руководство по устранению неисправностей также представлен.
Protocol
Discussion
Новый метод культуры 2 может быть использован для широкого спектра применений, начиная от прививок фактора роста содержащие бисером 3, для установки в целом гибридизация и целые горы иммуногистохимии 4. Культуры в течение 24 ч позволяет периода непрерывного контроля эмб?…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Маргарет М. Alkek Фонда РГНФ.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
Referências
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
