Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)
Summary
Questo video dimostra nuova cultura, un metodo con cui sono coltivati embrioni di pollo al di fuori l'uovo per un massimo di 24 ore. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo precoce (stria primitiva a 14 som.), Un periodo corrispondente a E7-9 nel topo. Le applicazioni di questa tecnica sono elettroporazione, ibridazione in situ e immunoistochimica.
Abstract
L'embrione di pollo è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo embrionale precoce. La sua trasparenza, accessibilità e facilità di manipolazione, lo rendono uno strumento ideale per studiare la formazione ed il modello del cervello, del tubo neurale, somite e primordi cuore. Le domande di cultura pulcino embrione comprendono elettroporazione di costrutti di DNA o RNA per analizzare la funzione del gene, innesti di perle fattore di crescita rivestito come FGF e BMP, così come montare tutto ibridazione in situ e immunoistochimica. Questo video mostra le varie fasi della cultura pulcino embrione; In primo luogo, l'embrione viene espiantato in soluzione salina. Poi, l'embrione è centrato su un anello di vetro. Le membrane che circondano l'embrione si sollevano lungo le pareti dell'anello. L'anello viene posto in un piatto di coltura contenente un pool di albumina. Il piatto cultura è sigillato e posto in una camera umida, in cui l'embrione è colta per un massimo di 24 ore. Infine, l'embrione viene rimosso dal ring, fissa e trattati per ulteriori applicazioni. Una guida alla risoluzione è anche presentato.
Protocol
Discussion
Il metodo di cultura di New 2 può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni, che vanno da innesti di fattore di crescita contenente microsfere di 3, per montare tutto ibridazione in situ e immunoistochimica intero monte 4. Cultura in un periodo di 24 ore consente il monitoraggio continuo dello sviluppo embrionale in applicazioni quali l'analisi lasso di tempo il movimento delle cellule 5 o il monitoraggio di GFP contenenti costrutti elettroporate 6.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal M. Margaret Alkek Fondazione RHF.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
Referências
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
