Micro-injection van Drosophila Verpleegkundige Cellen: Een Methode van Intracellulaire Levering

- Plaats een afdeklip met ontlede eierkamers op het microscoopstadium. Zoek een eierkamer van het juiste ontwikkelingsstadium en oriëntatie voor micro-injection. Eikamers in het midden tot laat stadium hebben een grote zichtbare oöcyt-dooier, en die in de juiste oriëntatie zijn met hun voorste-achterste as loodrecht op de injectierichting.

Drosophila zenuwcellen zijn een groep van 15 cellen in de eikamer die verantwoordelijk zijn voor het deponeren van maternale afgeleide voedingsstoffen en biomoleculen in de zich ontwikkelende oöcyt. Stel het micro-injectorsysteem in op de juiste injectie- en compensatiedruk om een consistent injectievolume en uitgaande stroom te garanderen. Breng voorzichtig een eerder geladen capillaire naald in het gezichtsveld, zodat de cellen en naald zich in hetzelfde brandpuntsvlak bevinden.

Zorg ervoor dat er geen lucht vastzit in de punt van het capillair en dat er een continue stroom van de oplossing is. Pas vervolgens de Z-positie van het doel aan om te focussen op het membraan dat de follikelcellen scheidt van de verpleegkundige cellen, steek de naald in een verpleegsterscel en voer de injectie uit.

Het volgende protocol demonstreert micro-injecting drosophila verpleegkundige cellen met fluorescerende oligonucleotide sondes, genaamd moleculaire bakens, tegen maternale bijgedragen mRNA transcripties voor live cel beeldvorming.

- Voor moleculaire bakenmicro-injection selecteert u het 40x oliedoel en monteert u een afdeklip met de ontleedde eierkamer op het microscoopstadium. Zoek een eikamer in het midden- tot late ontwikkelingsstadium die goed is georiënteerd voor micro-injectie en stel vervolgens een micro-injector in met de juiste injectie- en compensatiedruk.

Laat met behulp van de micromanipulator joystick voorzichtig een naald geladen met een microliter moleculair bakenoplossing in de oliedruppel zakken. Breng de punt scherp naar de rand van het gezichtsveld. Voer een schone functie uit om de lucht van de naaldpunt te verwijderen en ervoor te zorgen dat er stroom uit de naald komt en breng de naald naar de thuispositie.

Focus op de te micro-injecteren eikamer en breng de naald weer scherp aan de rand van de eikamer. Voer een fijne aanpassing uit van de Z-positie van het doel, zodat het membraan dat de follikelcellen van de verpleegkundige cellen scheidt, scherp is. Steek de naald in een verpleegsterscel voor injectie van de moleculaire bakens gedurende een periode van twee tot vijf seconden.

- Om reproduceerbaar micro-injectiesucces te garanderen, moet u zich zorgvuldig concentreren op het membraan dat de follikelcellen scheidt en de verpleegkundige cellen die zullen worden geïnjecteerd, terwijl u de punt van de naald in beeld brengt met de micromanipulator.

- Wanneer alle moleculaire bakens zijn geïnjecteerd, verwijdert u de naald voorzichtig en trekt u deze terug naar de thuispositie. Verander het doel in de gewenste vergroting voor beeldverwerving, focus vervolgens op de eierkamer onder de nieuwe doelstelling en begin met het verkrijgen van het beeld.