Encyclopedia of Experiments: Biology
É necessário ter uma assinatura JoVE para assistir este Faça login ou comece sua avaliação gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Legg en deksle med dissekerte eggkamre på mikroskopstadiet. Finn et eggkammer av riktig utviklingsstadium og orientering for mikroinjeksjon. Mellom- og senfase eggkamre har en stor synlig oocytteplomme, og de i riktig retning er med sin fremre bakre akse vinkelrett på injeksjonsretningen.
Drosophila nerveceller er en gruppe på 15 celler inne i eggkammeret som er ansvarlig for å deponere maternalt avledede næringsstoffer og biomolekyler i den utviklende oocytten. Sett opp mikroinjektorsystemet til riktig injeksjons- og kompensasjonstrykk for å sikre konsistent injeksjonsvolum og utoverstrømning.
Pass på at det ikke er luft fanget i spissen av kapillæren og at det er en kontinuerlig strøm av løsningen. Juster deretter Z-posisjonen til målet for å fokusere på membranen som skiller follikkelcellene fra sykepleiercellene, sett nålen inn i en sykepleiercelle og utfør injeksjonen.
Følgende protokoll demonstrerer mikroinjektive Drosophila-sykepleierceller med fluorescerende oligonukleotidprober, kalt molekylære beacons, mot maternalt bidratt mRNA-transkripsjoner for levende celleavbildning.
- For molekylær beacon mikroinjeksjon, velg 40x oljemålet og monter en dekselglidning med det dissekerte eggkammeret på mikroskopstadiet. Finn et eggkammer i midten til sen utviklingsstadium som er riktig orientert for mikroinjeksjon, og sett deretter opp en mikroinjektor med riktig injeksjons- og kompensasjonstrykk.
Bruk mikromanipulator joystick, senk forsiktig en nål lastet med en mikroliter molekylær beacon-løsning inn i oljedråpen. Ta spissen i fokus mot periferien av synsfeltet. Utfør en ren funksjon for å fjerne luften fra nålespissen og for å sikre at det er strøm fra nålen, og ta nålen til hjemposisjonen.
Fokuser på eggkammeret som skal mikroinjiseres, og ta nålen tilbake i fokus nær kanten av eggkammeret. Utfør en fin justering av Z-posisjonen til målet slik at membranen som skiller follikkelcellene fra sykepleiercellene er i fokus. Sett nålen inn i en sykepleiercelle for injeksjon av molekylære beacons over en periode på to til fem sekunder.
- For å sikre reproduserbar mikroinjeksjonssuksess, fokuser nøye på membranen som skiller follikkelcellene og sykepleiercellene som skal injiseres, samtidig som spissen av nålen settes i fokus med mikromanipulatoren.
- Når alle de molekylære beacons er injisert, fjern forsiktig nålen og trekk den tilbake til hjemposisjonen. Endre målet til ønsket forstørrelse for bildeanskaffelse, fokuser deretter på eggkammeret under det nye målet og begynn bildeanskaffelsen.
