Encyclopedia of Experiments: Biology
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- ई3 मीडियम को कम पिघलने वाले पॉइंट में जोड़कर शुरू करें और तब तक हीटिंग करें जब तक कि एगर पूरी तरह से घुल न जाए। एगर को 37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और ट्राइकेन सॉल्यूशन जोड़ें। इसके बाद, ई3 मीडियम में भ्रूण युक्त पेट्री डिश में ट्राइकेन जोड़कर भ्रूण को एनेस्थेटाइज करें।
एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, एक भ्रूण को न्यूनतम मात्रा में माध्यम से खींचें। पिपेट को एक ईमानदार स्थिति में रखें और भ्रूण को पिपेट की नोक पर स्थिति में उछालें। अब भ्रूण को किसी अतिरिक्त माध्यम को जोड़कर बिना किसी उत्पीसन समाधान में रखें, जिससे एगरेग्नेस को पतला किया जा सके और गेलिंग को रोका जा सके। धीरे-धीरे एगर उठे के भीतर भ्रूण को मिलाएं और पिपेट का उपयोग करके समाधान को इमेजिंग प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें।
प्लेट को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और वांछित अभिविन्यास में भ्रूण को स्थान देने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें। एक बार जब एगर जम जाता है, तो एगर हाइड्रेटेड रखने और भ्रूण को इमेज करने के लिए इसके ऊपर ट्राइकेन युक्त E3 माध्यम डालें । एक उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम इमेजिंग और विश्लेषण के लिए पैराबायोटिक जेब्राफिश भ्रूण माउंट करेंगे ।
फ्यूज्ड भ्रूण की छवियों को प्राप्त करने के लिए, 0.8% कम पिघलने बिंदु तैयार करें। अभी भी गर्म होने के दौरान, एग्कोट का एक मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक में सेट 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में उठा। एनेस्थेटाइज 4 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पीएच 7.0 ट्राइकेन को 25 मिलीलीटर ई3 माध्यम में जोड़कर पैराबीटिक भ्रूण को भ्रूण से युक्त करें। धीरे-धीरे पकवान को घूमता है ताकि बीच में भ्रूण पूल हो।
फिर एक विस्तृत इत्तला दे दी प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर, भ्रूण को यथासंभव कम तरल में खींचें । इसके बाद, पिपेट को सीधा करें और धीरे-धीरे भ्रूण को उछाल दें ताकि वे पिपेट के बहुत नीचे बस जाएं। फिर भ्रूण को कम पिघलने वाले बिंदु के 1 मिलीलीटर एलिकोट में स्थानांतरित करें जो एगर उठी की सतह पर पिपेट टिप को हल्के से छूकर उठा। पिपेट से किसी भी अतिरिक्त तरल को निपटाएं और पिपेट का उपयोग धीरे-धीरे पैदा हुए में भ्रूण को मिलाने के लिए करें।
फिर, पिपेट के साथ, एगर उठे और भ्रूण को एक ग्लास बॉटम सिक्स-वेल प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें। एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, एक चिढ़ा सुई के अंत के लिए तय एक जेल लोडिंग टिप का उपयोग करने के लिए कवर ग्लास के करीब भ्रूण की स्थिति और इमेजिंग के लिए वांछित अभिविन्यास में । के बाद agarose सेट किया गया है और ट्राइकेन के साथ मध्यम कुओं में जोड़ा गया है, एक उल्टे व्यापक क्षेत्र epifluorescence लेजर स्कैनिंग कंफोकॉकल या कताई डिस्क कंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें छवियों को प्राप्त करने के लिए ।
पूरे भ्रूण क्षेत्र के लिए, 4x व्यक्तिपरक का उपयोग करें। एक विशिष्ट ऊतक को इमेज करने के लिए 20x उद्देश्य का उपयोग करें। टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार छवियों को संसाधित करें।
