Overview
इस वीडियो में कम पिघल agarose का उपयोग कर 6 अच्छी तरह से थाली पर बढ़ते लाइव ज़ेब्राफिश भ्रूण पर कदम से कदम निर्देश का वर्णन करता है । यह लाइव भ्रूण की छवियों को प्राप्त करने और सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इसका विश्लेषण करने की प्रक्रिया भी प्रदान करता है।
Protocol
1. माइक्रोस्कोप सेटअप, छवि अधिग्रहण, प्रसंस्करण और विश्लेषण
- तैयार 0.8% कम पिघलने बिंदु (LMP) agarose: 0.8 ग्राम LMP 100 मिलीलीटर E3 और गर्मी के लिए जोड़ें जब तक पूरी तरह से भंग. जबकि गर्म, एलएमपी के 1 मिलीलीटर एक 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक में 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में उठी। एलएमपी एगरेएन 37 डिग्री सेल्सियस पर पिघला रहेगा। एलएमपी के प्रत्येक 1 मिलीलीटर एलिकोट में 40 माइक्रोन 4 मिलीग्राम/मिलीलीटर (25x), पीएच 7.0 ट्राइकेन को 37 डिग्री सेल्सियस पर जोड़ें। नोट: यदि एक पिगमेंटेड तनाव के साथ काम कर रहे हैं, तो प्रत्येक 1 मिलीलीटर अलीकोट में 0.15% (50x) पीटीयू के 20 माइक्रोन जोड़ें।
- शेष एलएमपी को 4 डिग्री सेल्सियस पर सील 50 मिलीलीटर ट्यूब में कई महीनों तक स्टोर करें।
- एनेस्थेटाइज पैराबायोटिक भ्रूण को 4 मिलीग्राम/मिलीलीटर (25x), पीएच 7.0 ट्राइकेन को 25 मिलीलीटर E3 में जोड़कर इमेज किया जाएगा जो भ्रूण पहले से ही हैं।
- धीरे से पकवान भंवर इतना है कि भ्रूण बीच में पूल होगा । फिर, एक व्यापक इत्तला दे दी प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर, संभव के रूप में थोड़ा तरल में भ्रूण आकर्षित । पिपेट को सीधा करें और धीरे-धीरे भ्रूण को उछालें ताकि वे पिपेट के बहुत नीचे बस जाएं।
- पिपेट के तल पर भ्रूण के साथ, उन्हें एलएमपी एगर के 1 मिलीलीटर एलिकोट में स्थानांतरित करें, जो पिपेट टिप को अग्निजनक की सतह पर हल्के से छूकर उठा। अतिरिक्त तरल स्थानांतरित करने से बचें क्योंकि इससे एगरेज़ को कमजोर किया जा सकेगा।
- पिपेट से अतिरिक्त तरल को निष्कासित करने के बाद, पिपेट का उपयोग धीरे-धीरे एगर उठे के भीतर भ्रूण को मिलाने के लिए करें, फिर सभी एगर उठे और भ्रूण को ग्लास-बॉटम (नंबर 1.5 कवरलिप), 6-अच्छी प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करने के लिए पिपेट का उपयोग करें।
नोट: इमेजिंग प्लेट में भ्रूण स्थानांतरित करने के बाद पिपेट को त्यागना सुनिश्चित करें। अवशिष्ट एगर उठे पिपेट के अंदर सेट होंगे, जो इसे आगे के उपयोग के लिए अप्रभावी प्रदान करेंगे। बल्कि, हर बार एक नया पिपेट का उपयोग करें। - एक स्टीरियोस्कोप के तहत, एक लकड़ी के अंत में तय पाइपट टिप का उपयोग करने के लिए एक लकड़ी संभाला चिढ़ा सुई के अंत में कवर ग्लास की ओर नीचे की स्थिति (यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे माइक्रोस्कोप उद्देश्य के काम की दूरी के भीतर हैं) और इमेजिंग के लिए वांछित अभिविन्यास में ।
नोट: जब तक एगर उठे पूरी तरह से सेट नहीं हो जाते तब तक लगातार रिपोजिशन करें। पैराबायोटिक भ्रूण को माउंट करने का ध्यान रखें जिसके अनुसार जोड़ी के भ्रूण को इमेज किया जाना है। संयुक्त भ्रूण के यादृच्छिक अभिविन्यास को देखते हुए, कुछ जोड़ों के लिए यह दोनों भ्रूण छवि के लिए मुश्किल हो सकता है । इस परिदृश्य में, संदंश और एक व्यापक इत्तला दे दी प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर agarose से भ्रूण ठीक है और फिर एक अलग नजरिए से इमेजिंग के लिए रिमाउंट । - एक बार एगर उठे सेट हो जाने के बाद, ट्राइकेन (और यदि आवश्यक हो तो पीटीयू) के साथ पूरक 2 - 3 मिलीलीटर E3 के साथ कवर करें।
- एक उल्टे चौड़े क्षेत्र epi-फ्लोरेसेंस, लेजर स्कैनिंग कंफोकल, या कताई डिस्क कंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर भ्रूण छवि । वांछित इमेजिंग के लिए सबसे उपयुक्त उद्देश्य का चयन करें। देखने के एक पूरे भ्रूण क्षेत्र के लिए, एक 4x उद्देश्य का उपयोग करें । एक विशिष्ट ऊतक की छवि के लिए 20x उद्देश्य जैसे उच्च आवर्धन का चयन करें
नोट: यदि एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं, तो एक ग्लास कवर स्लिप पर एलएमपी एगर उठे (ऊपर के समान) में माउंट करें। कांच को एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कवरलिप करें जिसमें एक ही E3-ट्राइकेन-पीटीयू से भरा वैक्यूम तेल की एक अंगूठी है। - प्रक्रिया ऐसे NIH छवि J/फिजी के रूप में मुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण किया ।
नोट: सेल संख्याओं को गिनें और विभाजन और ट्रैकिंग एल्गोरिदम का उपयोग करके सेल माइग्रेशन और सेल डिवीजन जैसी गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
