Purification et visualisation de la grippe A complexes ribonucléoprotéiques virale

Summary

Le génome du virus de la grippe A se compose de huit complexes séparés d'ARN et de protéines, appelées complexes ribonucléoprotéiques virale (vRNPs). Ce document décrit la purification sur gradient de glycérol et de visualisation microscopie électronique en transmission de la grippe A vRNPs.

Abstract

La grippe A génome viral est constitué de huit sens négatif, simple brin des molécules d'ARN, emballés individuellement avec des copies multiples de la grippe A nucléoprotéine (NP) en particules virales ribonulceoprotein (vRNPs). Le vRNPs la grippe sont enfermés dans l'enveloppe virale. Lors de l'entrée des cellules, cependant, ces complexes sont vRNP libéré dans le cytoplasme, où ils accéder à la machinerie de transport hôte nucléaire. Afin d'étudier l'import nucléaire de la grippe et le vRNPs la réplication du génome de la grippe, il est utile de travailler avec vRNPs isolés de telle sorte que les autres composantes du virus ne pas interférer avec ces processus. Ici, nous décrivons une procédure de purifier ces vRNPs du virus influenza A. La procédure débute par la perturbation de la grippe A virion avec des détergents afin de libérer les complexes vRNP du virion enveloppé. Le vRNPs sont ensuite séparées des autres composants de la grippe A virion sur un gradient discontinu de glycérol 33-70% par sédimentation de vitesse. Les fractions obtenues à partir du gradient de glycérol sont ensuite analysées via SDS-PAGE après coloration au bleu de Coomassie. Les fractions de pic contenant du NP sont ensuite rassemblées et concentrées par centrifugation. Après la concentration, l'intégrité de la vRNPs est vérifiée par la visualisation de la vRNPs par microscopie électronique à transmission après coloration négative. La purification sur gradient de glycérol est une modification de celle du Kemler<em> Et al.</em> (1994)¹, Et la coloration négative a été réalisée par Wu<em> Et al.</em> (2007).<sup> 2</sup

Protocol

Partie 1: La perturbation de la grippe A Virion Ajouter 750 pi de tampon de MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) dans un tube à centrifuger Beckman polycarbonate (11 mm x 34 mm), conçu pour s'intégrer dans un rotor TLA-120.2 pour une utilisation dans un Optima Beckman Max-E ultracentrifugation. Ajouter 500 ul de la grippe A (H3N2 X-31 A/AICHI/68 souche; 2 mg / ml) dans ce tube. Mélanger le virus avec le tampon de MNT par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Centrifug…

Discussion

La purification de vRNPs est basé sur la procédure décrite par Kemler et al. (1994). ¹ Nous et les autres ont également utilisé ce protocole pour isoler vRNPs d'étudier leur import nucléaire. ^2,4,5

Nous recommandons l'utilisation de la RNase conseils et des tubes lors de la manipulation vRNPs parce que le génome viral est constitué d'ARN, et se dégrade donc facilement dans la présence d'ARN. En outre, tous les tampons devraient être …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A		Charles River Laboratories	490715
Tris		Sigma	T1503
MES		Sigma	M-8250
Glycerol		Fisher	G33-1
Octylglucoside		Sigma	O-8001
Lysolecithin		Sigma	L-4129
Dithiothreitol		Sigma	D-9779
Coomassie brilliant blue G-250		Kodak	1367796
diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water		Invitrogen	750024
Uranyl Acetate		Ted Pella	19481
Ammonium Molybdate		Fisher	A-674
Optima MAX-E Ultracentrifuge		Beckman Coulter	434491
MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket		Beckman Coulter	367280
TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium		Beckman Coulter	362046
Eppendorf Thermomixer		Brinkman	022670000