İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme
Summary
Influenza A virüsünün genomu sekiz ayrı kompleksleri, RNA ve protein olarak adlandırılan viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNPs) oluşur. Bu yazıda, gliserol degrade arıtma ve influenza A vRNPs transmisyon elektron mikroskobu görselleştirme açıklamaktadır.
Abstract
Influenza A viral genomun viral ribonulceoprotein parçacıklar (vRNPs) içine İnfluenza A nükleoprotein (NP) birden fazla kopyası ile ayrı ayrı paketlenmiş sekiz negatif anlamda, tek sarmallı RNA molekülleri oluşur. Influenza vRNPs viral zarf içine. Hücreye girişi sırasında konak nükleer taşıma makine erişmek, ancak, bu vRNP kompleksleri, sitoplazma içine salınır. , Grip vRNPs ve grip genomunun çoğaltma nükleer ithalat incelemek üzere, bu virüsün diğer bileşenler bu süreçlerin karışmaz böylece izole vRNPs çalışmak için yararlıdır. Burada, influenza A virüsünün bu vRNPs arındırmak için bir prosedür açıklanmaktadır. Prosedür zarflı virion vRNP kompleksleri serbest bırakmak amacıyla grip deterjanlarla virion bozulma ile başlar. VRNPs sonra grip hız sedimantasyon% 33-70 süreksiz gliserol degrade virion diğer bileşenler ayrılır. Gliserol gradiyenti elde kesirler sonra Coomassie mavi ile boyandıktan sonra SDS-PAGE ile analiz edilir. NP içeren pik fraksiyonları daha sonra bir araya toplanmış ve santrifüj yoluyla yoğunlaşmıştır. Konsantrasyon sonra, vRNPs bütünlüğünü negatif boyandıktan sonra transmisyon elektron mikroskobu ile vRNPs görselleştirme tarafından doğrulanmadı. Gliserol degrade arıtma Kemler o bir değişiklik<em> Ve ark.</em> (1994)<sup> 1</sup> Ve negatif boyama Wu tarafından yapılan olmuştur<em> Ve ark.</em> (2007).<sup> 2</sup
Protocol
Discussion
VRNPs Arındırma Kemler ve ark (1994) tarafından açıklanan prosedüre dayanmaktadır. 1. Biz ve diğerleri de kendi nükleer ithalat çalışma vRNPs izole etmek için bu protokolü kullanılır. 2,4,5
RNA viral genomun oluşur çünkü RNaz ücretsiz ipuçları ve tüpler vRNPs manipüle kullanmanızı tavsiye ederiz ve bu nedenle RNA varlığı kolayca düşürür. Buna ek olarak, tüm tamponlar RNaz ücretsiz su yapılmalıdır. Burada açıklanan protok…
Acknowledgements
Bu çalışma, Kanada Yenilik Vakfı (CFI), Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüsü, Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) hibe ile desteklendi.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | ||
| Tris | Sigma | T1503 | ||
| MES | Sigma | M-8250 | ||
| Glycerol | Fisher | G33-1 | ||
| Octylglucoside | Sigma | O-8001 | ||
| Lysolecithin | Sigma | L-4129 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D-9779 | ||
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | ||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | ||
| Uranyl Acetate | Ted Pella | 19481 | ||
| Ammonium Molybdate | Fisher | A-674 | ||
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 434491 | ||
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter | 367280 | ||
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter | 362046 | ||
| Eppendorf Thermomixer | Brinkman | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E., Walker, J. M. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, . Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
