Purificación y visualización de la gripe A ribonucleoprotein complejos virales

Summary

El genoma del virus de influenza A se compone de ocho complejos separados de ARN y proteínas, denominadas complejos de ribonucleoproteína viral (vRNPs). Este trabajo describe la purificación gradiente de glicerol y de microscopía electrónica de transmisión de visualización de la gripe A vRNPs.

Abstract

La gripe A genoma viral se compone de ocho en sentido negativo, de cadena sencilla moléculas de ARN, envasadas individualmente con varias copias de la influenza A nucleoproteína (NP) en partículas virales ribonulceoprotein (vRNPs). El vRNPs influenza están encerrados dentro de la envoltura viral. Durante la entrada de la celda, sin embargo, estos complejos vRNP son liberados en el citoplasma, donde el acceso a los mecanismos de acogida de transporte nuclear. Para el estudio de la importación nuclear de vRNPs influenza y la replicación del genoma de la gripe, es útil para trabajar con vRNPs aisladas para que los otros componentes del virus no interferir con estos procesos. Aquí se describe un procedimiento para purificar estas vRNPs del virus de la influenza. El procedimiento se inicia con la ruptura de la influenza A virión con detergentes a fin de liberar los complejos vRNP del virión con envoltura. El vRNPs se separan de los otros componentes de la influenza A virión en un gradiente de glicerol 33-70% de velocidad de sedimentación discontinua. Las fracciones obtenidas del gradiente de glicerol se analizan a través de la SDS-PAGE después de la tinción con azul de Coomassie. Las fracciones que contienen NP pico después se agruparon y se concentraron por centrifugación. Después de la concentración, la integridad de la vRNPs se verifica mediante la visualización de la vRNPs por microscopía electrónica de transmisión después de la tinción negativa. La purificación del gradiente de glicerol es una modificación de que a partir de Kemler<em> Et al.</em> (1994)¹, Y la tinción negativa ha sido realizada por Wu<em> Et al.</em> (2007).<sup> 2</sup

Protocol

Parte 1: La interrupción de la Influenza A virión Añadir 750 l de tampón SM (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) en un tubo de centrífuga Beckman policarbonato (11 mm x 34 mm) diseñado para encajar en un rotor TLA-120.2 para su uso en un Beckman Optima Max-E ultracentrífuga. Añadir 500 l de la gripe A (H3N2 X-31 A/AICHI/68 cepa, 2 mg / ml) en ese tubo. Mezcla del virus con el buffer de MNT pipeteando arriba y abajo varias veces. Centrifugar durante 10 minutos a 109.000 xg, …

Discussion

La purificación de vRNPs se basa en el procedimiento descrito por Kemler et al. (1994). ¹ Nosotros y otros han utilizado también este protocolo para aislar vRNPs para estudiar su importación nuclear. ^2,4,5

Se recomienda el uso de RNasa libre de puntas y los tubos de la hora de manipular vRNPs debido a que el genoma viral se compone de ARN, y por lo tanto, se degrada fácilmente en la presencia de ARN. Además, todos los buffers deben hacerse en el agua que e…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A		Charles River Laboratories	490715
Tris		Sigma	T1503
MES		Sigma	M-8250
Glycerol		Fisher	G33-1
Octylglucoside		Sigma	O-8001
Lysolecithin		Sigma	L-4129
Dithiothreitol		Sigma	D-9779
Coomassie brilliant blue G-250		Kodak	1367796
diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water		Invitrogen	750024
Uranyl Acetate		Ted Pella	19481
Ammonium Molybdate		Fisher	A-674
Optima MAX-E Ultracentrifuge		Beckman Coulter	434491
MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket		Beckman Coulter	367280
TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium		Beckman Coulter	362046
Eppendorf Thermomixer		Brinkman	022670000