인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화
Summary
인플루엔자 바이러스의 게놈은 RNA와 단백질 여덟 별도 단지, 칭했다 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스 (vRNPs)로 구성되어 있습니다. 본 논문은 글리세롤 기울기 정화 및 독감 vRNPs의 전송 전자 현미경의 시각화에 대해 설명합니다.
Abstract
인플루엔자 바이러스 게놈은 개별적으로 바이러스성 ribonulceoprotein 입자 (vRNPs)에 인플루엔자 핵 단백질 (NP)의 복사본이 여러 개 모여 팔 부정적 – 감각, 단일 좌초 RNA 분자로 이루어져 있습니다. 인플루엔자 vRNPs는 바이러스 봉투 안에 동봉됩니다. 그들이 호스트 핵 수송 기계에 액세스할 어디 셀 항목 동안 그러나, 이러한 vRNP의 단지는 세포질에 발표됩니다. 인플루엔자 vRNPs 및 인플루엔자 게놈의 복제의 핵 수입을 연구하기 위해서는, 그것은 바이러스의 다른 구성 요소가 이러한 프로세스를 방해하지 않도록 격리 vRNPs 작동하는 데 유용합니다. 여기, 우리는 인플루엔자 바이러스로부터 vRNPs 정화 절차를 설명합니다. 절차는 싸여 virion에서 vRNP 단지를 공개하기 위해 인플루엔자 세제과 virion의 장애로 시작합니다. vRNPs은 다음 인플루엔자 속도 침강에 의해 33~70% 불연속 글리세롤 기울기에 virion의 다른 구성 요소에서 분리됩니다. 글리세롤 기울기에서 얻은 분수는 다음 쿠매시과 청색의 얼룩 후 SDS – PAGE를 통해에서 분석하고 있습니다. NP가 포함된 정상 분수 그런 다음 함께 풀링 및 원심 분리에 의해 집중되고있다. 농도 후 vRNPs의 무결성은 부정적인 얼룩 후 전송 전자 현미경에 의해 vRNPs의 시각화에 의해 확인됩니다. 글리세롤 기울기 정화는 Kemler에게서의 수정입니다<em> 외.</em> (1994)<sup> 1</sup>, 그리고 부정적인 얼룩이 우에 의해 수행되었습니다<em> 외.</em> (2007).<sup> 2</sup
Protocol
Discussion
vRNPs의 정화가 Kemler 외. (1994)에 기술된 절차에 따라 달라집니다. 한 우리는 다른 사람들이 그들이 핵 수입을 공부 vRNPs을 분리하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 2,4,5
우리는 바이러스 게놈은 RNA로 구성되어 있기 때문에 RNase 무료 도움말 및 vRNPs을 조작 튜브의 사용을 권장하고, 따라서 RNA의 존재에서 쉽게 떨어집니다. 또한, 모든 버퍼는 RNase ?…
Acknowledgements
이 작품은 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI), 보건 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소와 자연 과학 및 캐나다 공학 연구 협의회 (NSERC)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | ||
| Tris | Sigma | T1503 | ||
| MES | Sigma | M-8250 | ||
| Glycerol | Fisher | G33-1 | ||
| Octylglucoside | Sigma | O-8001 | ||
| Lysolecithin | Sigma | L-4129 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D-9779 | ||
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | ||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | ||
| Uranyl Acetate | Ted Pella | 19481 | ||
| Ammonium Molybdate | Fisher | A-674 | ||
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 434491 | ||
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter | 367280 | ||
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter | 362046 | ||
| Eppendorf Thermomixer | Brinkman | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E., Walker, J. M. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, . Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
