Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie
Summary
In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.
Abstract
In deze video, tonen we de methode ons lab heeft zich ontwikkeld tot de cel verandert de vorm en de herschikkingen nodig zijn om te buigen en vouwen de zich ontwikkelende hersenen zebravis (Gutzman et al., 2008) te analyseren. Een dergelijke analyse biedt een nieuw begrip van de onderliggende celbiologie die nodig zijn voor de ontwikkeling van de 3D-structuur van de gewervelde hersenen en verhoogt ons vermogen om neurale buis morfogenese bestuderen. De embryonale zebravis hersenen gevormd wordt vanaf 18 uur na de bevruchting (HPF) als de hartkamers binnen de neuroepithelium te blazen. Door 24 HPF, de eerste stappen van de neurale buis morfogenese zijn voltooid. Met behulp van de hier beschreven methode, worden embryo's aan de ene cel stadium geïnjecteerd met mRNA dat codeert voor membraan-gerichte groen fluorescerend eiwit (memGFP). Na injectie en incubatie, het embryo, nu tussen 18 en 24 HPF, is gemonteerd, omgekeerd, in beeld gebracht door agarose en confocale microscopie. Met name de zebravis embryo is doorzichtig, waardoor het een ideaal systeem voor fluorescerende beeldvorming. Terwijl onze analyses hebben zich geconcentreerd op de middenhersenen-achterhersenen grens en de achterhersenen, zou deze methode worden uitgebreid voor de analyse van elke regio in de zebravis op een diepte van 80-100 micrometer.
Protocol
Discussion
In deze video tonen we een methode voor het mRNA injectie in een cel zebravis embryo's. Hier maken we gebruik van mRNA dat codeert voor een membraan-gerichte GFP aan elke cel label. Vervolgens hebben we laten zien hoe te monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen van enkele cel resolutie. Deze techniek heeft ons toegelaten om een nieuw type van de cel van vorm veranderen, basale vernauwing, die nodig zijn voor de vorming van de middenhersenen-achterhersenen grens (Gutzman et al., 2008) te bestude…
Acknowledgements
Veel dank aan Dr Jennifer Gutzman die als eerste deze techniek ontwikkeld in het Sive lab. Ook dank aan JB Green in het Dana-Farber Cancer Institute in Boston, MA, die zo vriendelijk op voorwaarde dat de plasmide coderend voor CAAX-GFP mRNA. De confocale imaging werd uitgevoerd op het WM Keck Foundation Biologische Imaging Facility bij de Whitehead. HS wordt ondersteund door NIHMH70926. EG wordt ondersteund door een NSF pre-doctorale beurs.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | Tip One, US Scientific | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Zeiss | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige | ||
| Microinjector | Tool | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instruments |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1995).
