Живая съемка данио рерио Эмбриональные мозга с помощью конфокальной микроскопии
Summary
В этом видео мы продемонстрируем метод, при котором для анализа развивающихся мозга позвоночных в живых эмбрионов данио на одной резолюции ячейки с помощью конфокальной микроскопии. Это включает в себя метод, посредством которого мы вводим одноклеточного эмбриона полосатого данио, а затем смонтировать и изображение развивающегося мозга.
Abstract
В этом видео мы продемонстрируем метод нашей лаборатории разработаны для анализа формы клеток изменения и перестановки требуется согнуть и сложить развивающихся данио мозга (Gutzman и др., 2008). Такой анализ дает новое понимание основных клеточной биологии, необходимые для развития 3D-структуры мозга позвоночных, а также значительно увеличивает нашу способность к обучению нейронных морфогенеза трубки. Эмбрионального мозга данио формируется, начиная с 18 часов после оплодотворения (ФВЧ), а желудочки в нейроэпителия надуваться. К 24 HPF, первые шаги нейронных морфогенеза трубки являются полными. Использование метода, описанного здесь, эмбрионов на стадии одной клетки вводят мРНК, кодирующей мембраны ориентированных зеленый флуоресцентный белок (memGFP). После инъекции и инкубации эмбриона, в настоящее время от 18 до 24 HPF, монтируется, перевернутый, в агарозном и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. Следует отметить, что данио эмбрион прозрачной что делает его идеальной системой для флуоресцентной визуализации. Хотя наши анализы были направлены на средний мозг, задний мозг границы и задний мозг, этот метод может быть распространен для анализа любой регион данио на глубину 80-100 мкм.
Protocol
Discussion
В этом видео мы продемонстрируем метод мРНК инъекции в одно эмбрионов данио клетки. Здесь мы используем мРНК, кодирующей мембраны ориентированных GFP на этикетке каждой ячейке. Затем показано, как монтировать и изображение развивающегося мозга в одной резолюции клетки. Этот метод позво…
Acknowledgements
Большое спасибо доктор Дженнифер Gutzman который первым разработал эту технику в Sive лаборатории. Спасибо также JB Зеленый в Dana-Farber института рака Boston, MA который любезно предоставил плазмиды, кодирующей CAAX-GFP мРНК. Конфокальной микроскопии было проведено в WM Keck Фонд фонда изображений Биологические на Уайтхеда. HS поддерживается NIHMH70926. Е. поддерживается NSF предварительно докторских стипендий.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | Tip One, US Scientific | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Zeiss | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige | ||
| Microinjector | Tool | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instruments |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1995).
