Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Summary

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Abstract

En este vídeo, se demuestra el método de nuestro laboratorio ha desarrollado para analizar los cambios en la forma celular y los reordenamientos requeridos para doblar y doblar el cerebro del pez cebra en desarrollo (Gutzman et al, 2008). Este tipo de análisis permite una nueva comprensión de la biología de las células subyacentes necesarios para el desarrollo de la estructura 3D del cerebro de los vertebrados, y aumenta de forma significativa nuestra capacidad de estudiar la morfogénesis del tubo neural. El cerebro tiene la forma de pez cebra embrionarias a partir de las 18 horas posteriores a la fecundación (HPF) en los ventrículos en el neuroepitelio inflar. Un 24 por HPF, los pasos iniciales de la morfogénesis del tubo neural se completa. Utilizando el método descrito aquí, los embriones en la etapa de una célula son inyectados con mRNA de membrana específicos de proteína verde fluorescente (memGFP). Después de la inyección y ahora de incubación, el embrión, entre 18 y 24 HPF, se monta, en posición invertida, en gel de agarosa y la imagen por microscopía confocal. En particular, el embrión de pez cebra es transparente por lo que es un sistema ideal para la proyección de imagen fluorescente. Si bien nuestro análisis se han centrado en el límite del cerebro medio-hindbrain y la parte posterior del cerebro, este método puede ser extendido para el análisis de cualquier región en el pez cebra a una profundidad de 80 a 100 micras.

Protocol

1. Preparación de los ARNm para inyección El ARNm utilizados en este procedimiento se transcribe a partir de un plásmido que codifica CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. En primer lugar linealizar el plásmido de acuerdo con Gutzman et al, 2008. A continuación transcribimos ARNm memGFP con el mMessage mMachine kit. Diluir el ARNm resultante de 1μg/μl, alícuota y almacenar a -80 ° C. Preparar un molde de inyección de agarosa al 1% con los carriles de la anchura de los embriones en l…

Discussion

En este vídeo, se demuestra un método para la inyección de ARNm en una sola célula de embriones de pez cebra. En este sentido, el uso de ARNm que codifica una membrana GFP dirigida a la etiqueta de cada célula. A continuación se muestra cómo montar y la imagen del cerebro en desarrollo con una resolución única célula. Esta técnica nos ha permitido estudiar un nuevo tipo de cambio en las células forma, constricción basal, necesario para la formación de la frontera del cerebro medio-hindbrain (Gutzman et al,…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
SeaKem GTG agarose	Reagent	Lonza	50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine)	Reagent	Sigma	A-5040
Capillary tubing	Tool	Frederick Haer and Co.	30-30-1	Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease	Reagent	VWR	W0S717
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11232-20	Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips	Tool	Tip One, US Scientific	111-0806	These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit	Reagent	Ambion	AM1340	SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal	Microscope	Zeiss
Micromanipulator	Tool	Narishige
Microinjector	Tool	Medical Systems Research Products Harvard Apparatus	PLI-100
Micropipette puller	Tool	Sutter Instruments