Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal
Summary
Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.
Abstract
Neste vídeo, demonstramos o método de nosso laboratório tem desenvolvido para analisar as mudanças de células forma e rearranjos necessários para dobrar e dobrar o cérebro zebrafish em desenvolvimento (Gutzman et al, 2008). Essa análise permite uma nova compreensão da biologia das células subjacentes necessários para o desenvolvimento da estrutura 3D do cérebro de vertebrados, e aumenta significativamente a nossa capacidade de estudar a morfogênese do tubo neural. O cérebro zebrafish embrionárias é moldada a partir das 18 horas pós-fertilização (hpf) como os ventrículos dentro do neuroepitélio inflar. Por 24 hpf, os passos iniciais da morfogênese do tubo neural estão completos. Usando o método descrito aqui, embriões em fase de uma célula são injetados com a codificação do mRNA membrana-alvo a proteína verde fluorescente (memGFP). Após a injeção e de incubação, o embrião, agora entre 18 e 24 hpf, é montado, invertido, em agarose e visualizados por microscopia confocal. Nomeadamente, o embrião do zebrafish é transparente tornando-se um sistema ideal para imagens fluorescentes. Enquanto nossas análises se concentraram na fronteira mesencéfalo e rombencéfalo o rombencéfalo, este método pode ser estendido para a análise de qualquer região do peixe-zebra a uma profundidade de 8-10 mM.
Protocol
Discussion
Neste vídeo, demonstramos um método para injeção de mRNA em embriões de peixe-zebra única célula. Aqui, usamos mRNA que codifica uma membrana GFP-alvo para rotular cada célula. Nós, então, demonstrar como montar e imagem do cérebro em desenvolvimento na resolução única célula. Esta técnica permitiu-nos a estudar um novo tipo de célula mudar de forma, a constrição basal, necessária para a formação da fronteira mesencéfalo rombencéfalo (Gutzman et al, 2008). Análise semelhante de outros fenômenos…
Acknowledgements
Muito obrigado a Dr. Jennifer Gutzman quem primeiro desenvolveu essa técnica no laboratório Sive. Graças também ao JB Verde no Dana-Farber Cancer Institute em Boston, MA que gentilmente forneceu o plasmídeo CAAX-GFP mRNA. A imagem confocal foi realizada na Fundação WM Keck Facilidade de imagem Biológicas da Whitehead. HS é suportada por NIHMH70926. EG é apoiado por uma bolsa NSF pré-doutoramento.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | Tip One, US Scientific | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Zeiss | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige | ||
| Microinjector | Tool | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instruments |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1995).
