Live avbildning av Zebrafish embryonal hjärna av konfokalmikroskopi
Summary
I denna video visar vi en metod för att analysera utvecklingen av ryggradsdjur hjärnan i levande zebrafisk embryon till en enda cell upplösning av konfokalmikroskopi. Detta inkluderar den metod som vi injicerar encelliga zebrafisk embryo och därefter montera och bild den växande hjärnan.
Abstract
I denna video visar vi metoden vårt laboratorium har utvecklats för att analysera de cellförändringar form och omflyttningar som krävs för att böja och vika utveckla zebrafisk hjärnan (Gutzman et al, 2008). En sådan analys ger en ny förståelse av de underliggande cellbiologi som krävs för utveckling av 3D-strukturen för ryggradsdjur hjärnan, och betydligt ökar vår förmåga att studera neuralrörsdefekter morfogenes. Den embryonala zebrafisk hjärnan är formad som börjar vid 18 timmar efter befruktning (HPF) som ventriklarna inom neuroepithelium blåsa. Genom 24 HPF, de första stegen i neuralrörsdefekter morfogenes är kompletta. Med hjälp av metoden som beskrivs här, är embryon till en cell scenen injiceras med mRNA kodning membran riktade grönt fluorescerande protein (memGFP). Efter injektion och inkubation, embryot, nu mellan 18 och 24 HPF, är monterad, inverterad, i agaros och avbildat av konfokalmikroskopi. Noterbart är zebrafisk embryot transparent vilket gör det till ett idealiskt system för lysrör avbildning. Medan våra analyser har fokuserat på mellanhjärnan-hindbrain gränsen och hindbrain, skulle denna metod förlängas för analys av en region i zebrafisk till ett djup av 80-100 ìm.
Protocol
Discussion
I denna video visar vi en metod för mRNA injektion i enstaka embryon cell zebrafisk. Här använder vi mRNA som kodar för ett membran riktade GFP att etikettera varje cell. Vi visar sedan hur man monterar och bild den växande hjärnan på en enda cell upplösning. Denna teknik har gett oss möjlighet att studera en ny typ av celler formen förändring, basala sammandragning, som krävs för bildandet av mitthjärnan-hindbrain gränsen (Gutzman et al, 2008). Liknande analys av andra fenomen har potential att kraftigt …
Acknowledgements
Ett stort tack till Dr Jennifer Gutzman som först utvecklade denna teknik i Sive labbet. Tack även till JB Green på Dana-Farber Cancer Institute i Boston, MA som välvilligt lämnat plasmiden kodning CAAX-GFP mRNA. Den konfokala bildhantering genomfördes på WM Keck stiftelsen biologisk avbildning Facility vid Whitehead. HS stöds av NIHMH70926. EG stöds av en NSF doktorander gemenskap.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | Tip One, US Scientific | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Zeiss | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige | ||
| Microinjector | Tool | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instruments |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1995).
