Grand Insérer production bibliothèque génomique de l'environnement
Summary
Construction d'une bibliothèque fosmide avec l'ADN génomique environnementale isolé du continuum profondeur verticale d'un fjord saisonnière hypoxiques est décrite. La bibliothèque clone résultant est capté dans les plaques 384 puits et archivées pour le séquençage et l'aval de criblage fonctionnel par l'application d'un système de picking colonie automatisés.
Abstract
La grande majorité des microbes dans la nature restent actuellement inaccessibles aux méthodes de culture traditionnelles. Au cours des dix dernières années, la culture indépendante génomique environnementale (<em> À savoir</em> Métagénomique) approches ont émergé, permettant aux chercheurs de combler cette lacune de culture en capturant le contenu génétique des populations autochtones des communautés microbiennes directement à partir de l'environnement. À cette fin, banques d'ADN génomique sont construits en utilisant la norme mais astucieuse des techniques de clonage en laboratoire. Nous décrivons ici la construction d'une bibliothèque génomique insérer des grandes environnement fosmide avec l'ADN provenant du continuum profondeur verticale d'un fjord saisonnière hypoxiques. Ce protocole est directement liée à une série de protocoles reliés y compris l'échantillonnage des eaux côtières marines [1], la filtration grand volume de biomasse microbienne [2] et une extraction d'ADN et protocole de purification [3]. A l'origine, de haute qualité est l'ADN génomique fin réparé avec la création de la 5-phosphorylés des extrémités franches. Fin réparé ADN est soumis à une électrophorèse en champ pulsé (PFGE) pour la sélection de taille et d'extraction de gel est effectuée pour récupérer des fragments d'ADN entre 30 et 60 mille paires de base (Ko) de longueur. L'ADN est purifié Taille sélectionnés loin de la matrice du gel PFGE et ligaturé au traité à la phosphatase à bout émoussé fosmide CopyControl pCC1 vecteur (EPICENTRE<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Concatémères linéaire de pCC1 et insert d'ADN sont ensuite emballés dans des headfull des particules de phage lambda par terminase, avec une infection ultérieure du phage résistant<em> E. coli</em> Cellules. Réussir clones transduits sont récupérés sur des plaques d'agar LB sous sélection antibiotique et archivés dans le format de 384 puits plaque à l'aide d'une colonie automatisé picking robot (Qpix2, GENETIX). Le protocole actuel s'inspire de diverses sources, y compris le kit CopyControl fosmide production bibliothèque d'Epicentre et les oeuvres publiées de multiples groupes de recherche [4-7]. Chaque étape est présentée avec les meilleures pratiques à l'esprit. Autant que possible nous mettons en évidence les subtilités de l'exécution afin d'améliorer la qualité et l'efficacité globales de la production de la bibliothèque. L'ensemble du processus de production et la cueillette des bibliothèques fosmide colonie automatisé prend au moins 7-10 jours comme il ya de nombreuses étapes d'incubation inclus. Cependant, il existe plusieurs points d'arrêt possibles qui sont mentionnés dans le protocole.
Protocol
Discussion
Une procédure est décrite la manière la plus efficace de générer une grande bibliothèque-insert fosmide avec l'ADN génomique provenant d'un échantillon des eaux côtières. En amont d'extraction d'ADN génomique est décrit dans un protocole séparé [3].
Comme la production fosmide-bibliothèque est un multi-processus, le plan d'au moins deux à trois semaines à temps pour toute la procédure, y compris toutes les étapes quatre présentées. L'extraction de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l'innovation, le Fonds de développement des connaissances en Colombie-Britannique et les sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada pour soutenir les études en cours sur les régions pauvres en oxygène des eaux côtières et océaniques ouverts. MT et SL ont été soutenus par des bourses de la Fondation du Centre TULA financé pour la diversité microbienne et évolution (cmde). MT a également reçu le soutien de la bourse de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
References
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
