Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca
Summary
Costruzione di una biblioteca con fosmid ambientale DNA genomico isolato dal continuum profondità verticale di un fiordo stagionalmente ipossia è descritto. La biblioteca clone risultante è raccolto in 384 pozzetti e archiviati per il sequenziamento a valle e screening funzionale con l'applicazione di un sistema automatizzato di raccolta colonia.
Abstract
La stragrande maggioranza dei microbi in natura attualmente rimangono inaccessibili ai metodi di coltivazione tradizionali. Negli ultimi dieci anni, la cultura indipendente genomica ambientale (<em> Cioè</em> Metagenomica) approcci sono emersi, consentendo ai ricercatori di colmare questa lacuna coltivazione catturando il contenuto genetico di comunità microbiche indigene direttamente dall'ambiente. A tal fine, le librerie di DNA genomico sono costruiti utilizzando le normali tecniche seppur abile clonazione di laboratorio. Qui si descrive la costruzione di una grande libreria genomica inserimento ambientale fosmid con il DNA derivato dal continuum profondità verticale di un fiordo stagionalmente ipossia. Questo protocollo è direttamente collegato ad una serie di protocolli di collegamento tra il campionamento delle acque costiere marine [1], la filtrazione di grandi volumi di biomassa microbica [2] e una estrazione del DNA e protocollo di purificazione [3]. All'inizio, DNA genomico di alta qualità è fine riparato con la creazione di estremità blunt 5-fosforilata. End-riparato il DNA è sottoposto a campo pulsato elettroforesi su gel (PFGE) per la selezione del formato e l'estrazione del gel viene eseguito per recuperare frammenti di DNA tra i 30 ei 60 mila paia di basi (Kb) di lunghezza. DNA formato selezionato è purificato dalla matrice gel PFGE e legato alla fosfatasi trattati smussato-end fosmid CopyControl vettore pCC1 (Epicentre<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Concatemers lineare di pCC1 e del DNA sono successivamente inserire headfull confezionati in particelle di fago lambda terminase, con successiva infezione dei fagi resistenti<em> E. coli</em> Cellule. Cloni con successo trasdotte sono recuperate su piastre di agar LB con selezione antibiotica e archiviati in formato da 384 pozzetti piastra utilizzando una colonia automatizzato raccolta robot (Qpix2, Genetix). L'attuale protocollo attinge da varie fonti tra cui il CopyControl Kit Produzione Biblioteca Fosmid da Epicentre e le opere pubblicate di gruppi di ricerca multipli [4-7]. Ogni passo è presentato con le migliori pratiche in mente. Quando è possibile si evidenzia sottigliezze in esecuzione di migliorare la qualità e l'efficienza della produzione di biblioteca. L'intero processo di produzione e raccolta biblioteca fosmid colonia automatizzato richiede almeno 7-10 giorni in quanto vi sono molti passaggi di incubazione inclusi. Tuttavia, ci sono diversi punti di sosta possibili, che sono indicati all'interno del protocollo.
Protocol
Discussion
Una procedura viene descritto come generare più efficiente un grande inserto biblioteca fosmid con il DNA genomico derivato da un campione d'acqua costiere. A monte di estrazione del DNA genomico è descritta in un protocollo separato [3].
Mentre il fosmid-libreria di produzione è un processo multistep, piano di almeno due o tre settimane, in tempo per l'intera procedura compresi tutti i passaggi quattro presentati. L'estrazione del DNA genomico è il passo più importante e tu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l'innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council (NSERC) del Canada per sostenere gli studi in corso sulle regioni di scarsità di ossigeno delle acque costiere oceaniche e aperto. MT e SL erano supportati da borse di studio del Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution (CMDE). MT inoltre ricevuto il sostegno borsa di studio della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
References
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
