Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim
Summary
Mevsimsel hipoksik fiyort dikey derinliği süreklilik çevre genomik DNA izole bir fosmid kütüphane inşaatı açıklanmıştır. Çıkan klon kütüphanesi 384-kuyucuğu içine aldı ve mansap sıralama ve fonksiyonel tarama, otomatik bir koloni toplama sistemi uygulama tarafından arşivlenir.
Abstract
Doğada mikropların büyük bir çoğunluğu şu anda, geleneksel tarım yöntemleri erişilemez kalır. Geçtiğimiz on yıl boyunca, kültür-bağımsız çevre genomik (<em> Yani</em> Metagenomic) yaklaşımları, araştırmacılar, bu kültür ortamında doğrudan yerli mikrobiyal toplulukların genetik içeriği yakalayarak köprü sağlayan ortaya çıkmıştır. Bu amaçla, genomik DNA kütüphaneleri de olsa standart sanatsal laboratuar klonlama teknikleri kullanılarak inşa edilmektedir. Burada mevsimsel hipoksik fiyort dikey derinliği süreklilik elde edilen DNA ile büyük bir ekleme çevre genomik fosmid kütüphane yapım açıklar. Bu protokol doğrudan kıyı deniz suyu örnekleme [1] bağlı protokoller de dahil olmak üzere bir dizi bağlı mikrobiyal biyokütle, büyük hacimli filtrasyon [2] ve bir DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma protokol [3]. Başlangıçta, yüksek kalitede genomik DNA 5-fosforile künt biter oluşturulması ile sona onarılmıştır. End-DNA tamir boyutu seçimi ve jel çıkarma, 30 ve 60 bin baz çiftinden (Kb) uzunluğu arasında DNA parçaları kurtarmak için yapılır pulsed-field jel elektroforezi (PFGE) tabi tutulur. Boyutu seçilen DNA PFGE jel matris uzak saflaştırılmış ve künt uç fosfataz tedavi fosmid CopyControl vektör pCC1 (Epicentre bağlandı.<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). PCC1 ve insert DNA Lineer concatemers sonradan faj dayanıklı sonraki enfeksiyonu ile lambda terminase faj parçacıkları içine paketlenmiş headfull<em> E. coli</em> Hücreler. Başarıyla transduced klonlar antibiyotik seçimi altında LB agar plaklarına kurtarıldı ve robot alarak otomatik bir koloni (Qpix2, GENETIX) kullanarak 384 plaka biçimi arşivlenir. Mevcut protokol Epicentre CopyControl Fosmid Kütüphane Üretim Seti de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan çizer ve birden fazla araştırma grupları yayınlanan eserler [4-7]. Her adım, akılda en iyi uygulamalar ile sunulmuştur. Genel kütüphane üretim kalitesini ve verimliliğini artırmak için yürütme inceliklerini vurgulamak Mümkün olduğunda. Dahil pek çok kuluçka adımları olduğu gibi, fosmid kütüphane üretim ve otomatik koloni toplama tüm süreç en az 7-10 gün sürer. Ancak, protokol içinde belirtilen olası birkaç durak noktaları vardır.
Protocol
Discussion
Bir prosedür nasıl bir kıyı su numunesi elde edilen genomik DNA ile büyük bir takın fosmid kütüphane oluşturmak için en verimli şekilde açıklanmıştır. Up-stream genomik DNA ekstraksiyonu ayrı bir protokol [3] açıklanmıştır.
Fosmid-kütüphane üretim çok adımlı bir süreç, planı dört sunulan adımları da dahil olmak üzere tüm prosedürü için en az 2-3 hafta süre. Genomik DNA ekstraksiyonu, en önemli adım ve tüm aşağı akım adımları çıkarılan geno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu ve Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada Kanada Vakfı Biz, kıyı ve açık okyanus sularında düşük oksijen bölgelerde devam eden çalışmalar destek için teşekkür etmek istiyorum. MT ve SL Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim (CMDE) TULA vakıf tarafından finanse edilen Merkezi burs tarafından desteklenmiştir. MT de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) burs desteği aldı.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
References
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
