הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה
Summary
בניה של ספריה fosmid עם הדנ"א הגנומי הסביבה מבודדים רצף העומק האנכי של פיורד hypoxic עונתיות מתואר. הספרייה שיבוט המתקבל הוא הרים את 384 גם צלחות בארכיון עבור סידור במורד וסינון תפקודית על ידי יישום של מערכת המושבה אוטומטיות קטיף.
Abstract
הרוב המכריע של חיידקים בטבע כיום להישאר נגיש שיטות הטיפוח המסורתיות. במהלך העשור האחרון, תרבות עצמאית גנומית סביבתיים (<em> כלומר</em> Metagenomic) התפתחו גישות, המאפשר לחוקרים לגשר על הפער הזה טיפוח ידי לכידת את התוכן הגנטי של קהילות הילידים ישירות חיידקים מהסביבה. לשם כך, ספריות ה-DNA הגנומי בנויים באמצעות תקן אם כי בטכניקות שיבוט ערמומית מעבדה. כאן אנו מתארים את בניית ספרייה גנומית גדול הסביבה להכניס fosmid עם ה-DNA שמקורם רצף העומק האנכי של פיורד hypoxic עונתיות. פרוטוקול זה הוא מקושר ישירות אל סדרה של פרוטוקולים מחובר כולל דגימה מים חוף הים [1], סינון נפח גדול של ביומסה של חיידקים [2] וכן מיצוי דנ"א פרוטוקול טיהור [3]. בראשית, ה-DNA הגנומי איכות גבוהה היא סוף תוקן עם הקמתה של 5-פוספורילציה מסתיים בוטה. קצה לתיקון ה-DNA הוא נתון אלקטרופורזה פעמו שדה ג'ל (PFGE) לבחירת גודל מיצוי ג'ל מבוצע להתאושש שברי DNA בין 30 ל -60 אלף זוגות Base (KB) באורך. ה-DNA גודל שנבחר מטוהרים מן המטריצה ג'ל PFGE ו ligated את phosphatase שטופלו בוטה סוף fosmid CopyControl וקטור pCC1 (EPICENTRE<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Concatemers שכבות של pCC1 ו-DNA להכניס לאחר מכן הם headfull ארוז לחלקיקים phage ידי למבדה terminase, עם זיהום הבאות של הפאג עמידים<em> א coli</em> תאים. שיבוטים בהצלחה transduced הם התאוששו על צלחות אגר LB תחת מבחר אנטיביוטית בארכיון בפורמט-384 גם צלחת באמצעות המושבה אוטומטיות לקטוף רובוט (Qpix2, GENETIX). הפרוטוקול הנוכחי שואבת ממקורות שונים כולל ערכת CopyControl ספריית Fosmid הפקה מ EPICENTRE ועל העבודות שפורסמו קבוצות מחקר רבות [4-7]. כל שלב מוצג עם שיטות עבודה מומלצות בראש. במידת האפשר אנו מדגישים דקויות הביצוע כדי לשפר את איכות היעילות הכוללת של ייצור הספרייה. כל התהליך של ייצור ספריה fosmid ואוסף המושבה אוטומטיות לוקח לפחות 7-10 ימים כמו ישנם צעדים רבים הדגירה כלל. עם זאת, ישנן מספר נקודות עצירה אפשרית אשר מוזכרים במסגרת הפרוטוקול.
Protocol
Discussion
ההליך מתואר כיצד היעיל ביותר ליצור ספרייה גדולה הכנס fosmid עם הדנ"א הגנומי נגזר מדגם מים החוף. Up-stream-DNA הגנומי מיצוי מתואר בפרוטוקול נפרד [3].
כפי הייצור fosmid-ספריית הוא רב שלבי תהליך, תוכנית לפחות שבועיים עד שלושה שבועות בזמן ההליך ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לקרן קנדית עבור חדשנות, פיתוח קולומביה הבריטית קרן ידע מדעי הלאומי וההנדסה מועצת המחקר (NSERC) של קנדה לתמיכה מחקרים מתמשכים על אזורים חמצן נמוכה של מים חופי האוקיינוס הפתוח. MT ו – SL נתמכו על ידי מלגות ממרכז טולה היסוד במימון עבור גיוון התפתחות חיידקים (CMDE). MT גם קיבל מלגת תמיכה של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
References
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
